一种人源性电压门控钾通道1.5免疫原性肽段及其用途

摘要

本发明提供了一种人源性电压门控钾通道1.5免疫原性肽段及其用途。所述肽段由人源性电压门控钾通道1.5α亚基跨膜片段S5和S6之间胞外环上连续的13个氨基酸构成，肽段的氨基酸序列为：Glu-Ala-Asp-Asn-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro，通过免疫学的方法制备针对上述肽段的抗体，可以作为人源性电压门控钾通道1.5以及由其基因编码的超快激活延迟整流钾通道新的、特异性抑制剂，该抗体可用于调节人源性电压门控钾通道1.5以及由其基因编码的超快激活延迟整流钾通道功能的研究。基于上述肽段所制备的单克隆抗体和疫苗将有助于房颤的治疗。

权利要求

1.一种人源性电压门控钾通道1.5免疫原性肽段，该肽段由人源性电压门控钾通道

1.5α亚基跨膜片段S5和S6之间胞外环上连续的13个氨基酸构成，其特征在于：所述肽段的氨基酸序列为Glu-Ala-Asp-Asn-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro，应用该肽段作为抗原决定簇/半抗原制备针对该肽段的抗体。

2.针对权利要求1所述肽段的抗体用于制备人源性电压门控钾通道1.5以及由其基因编码的超快激活延迟整流钾通道的抑制剂的用途。

说明书

一种人源性电压门控钾通道1.5免疫原性肽段及其用途

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人源性电压门控钾通道1.5的胞外环肽段E313的合成和针对该肽段制备的抗体，以及该抗体在作为人源性电压门控钾通道1.5和由其基因编码的超快激活延迟整流钾通道的特异性抑制剂的应用。

背景技术

[0002] 心房颤动，以下简称为房颤，是临床上最常见的心律失常，可以诱发心绞痛和心力衰竭，并可导致血管栓塞等严重并发症的发生，增加死亡率。将房颤心律恢复为窦性心律并长期维持即节律控制是房颤治疗的重要策略。研究表明，心房肌的电重构在房颤的维持和复发中起关键作用且在房颤的早期已经发生，主要特征为心房肌动作电位时程和有效不应期的缩短。临床上常用的房颤转复药物，如胺碘酮等III类抗心律失常药物，因延长心房肌的动作电位时程和有效不应期，可以改善房颤时心房肌的电重构，从而抑制房颤的发作。外向复极钾电流是其作用的主要部位。

[0003] 研究发现，人心房肌细胞上存在一种特有的外向复极钾电流即超快激活延迟整流+钾电流，其英文全称为ultrarapid delayed rectifier K current，以下简写为IKur，而该电流不存在于人心室肌细胞。IKur在人心房复极中起着极为重要的作用，50％的抑制可引起动作电位时程延长66％。IKur通道的生物物理学和药理学特性与人电压门控性钾通道
1.5(human voltage-gated potassium channel 1.5，hKv1.5)极类似，二者具有分子相关性。现已证实，IKur通道主要是由hKv1.5通道基因编码表达的。hKv1.5通道基因位于人12号染色体短臂第1区第3条带，英文简写为12p13，该通道蛋白是一种重要的电压门控钾离子通道，由四个结构相同的α亚基聚合成，每个α亚基由6个跨膜蛋白分子片段S1～S6以及N末端和C末端组成，并具有3个胞外环，分别为E1、E2和E3。其中S5，S6主要构成离子通道孔，是钾离子进出细胞的部位。

[0004] 针对Kv1.5编码序列的反义寡核苷酸在不改变其他电流的情况下，使IKur减小约50％。一些Kv1.5通道阻滞剂能延长心房肌的动作电位时程和有效不应期，抑制实验性房颤的发作。这些研究显示，对IKv1.5/IKur的阻滞，能有效延长心房肌的动作电位时程和有效不应期，改善房颤时心房肌的电重构，抑制房颤的发作；但不影响心室的复极电流，因而不导致长QT间期综合征和尖端扭转性室性心动过速的发生。因此，IKv1.5/IKur成为房颤治疗新的、安全和理想的靶点。

[0005] 然而研究发现，相当多的一部分化合物在阻滞Kv1.5通道的同时亦能阻滞心脏中的电压门控钠、钙等离子通道。由于电压门控钾通道具有较高的结构同源性，使得不同的电压门控钾通道具有高度一致的药物结合位点。研究发现，Kv1.5通道与心脏复极HERG和KCNQ1/KCNE1钾通道阻滞剂结合位点高度保守，因而使得现有的一些Kv1.5通道阻滞剂，在阻滞Kv1.5通道的同时，亦对HERG和KCNQ1/KCNE1通道产生阻滞作用，常常会导致药源性的心律失常的发生，阻碍了一些Kv1.5通道阻滞剂进一步开发成为临床药物。因此，美国食品和药品管理局要求新上市的药物应评估其对心脏复极电流的影响。

[0006] 抗体与抗原的结合具有亲和力高，特异性强的特点，理论上开发出针对hKv1.5、具有阻滞效应的抗体可以作为hKv1.5通道特异性的阻滞剂。所有电压门控钾通道的跨膜片段S5和S6所构成的离子通道孔区是钾离子进出细胞的关键部位。针对该部位胞外环肽段的抗体能够对电压门控钾通道产生抑制作用。hKv1.5/IKur通道是一种功能性表达于人心房肌细胞上的电压门控钾通道，其组成氨基酸序列与其它的电压门控钾通道不同，因此可能制备针对该通道特定肽段的特异性抗体。如同其它针对离子通道孔区胞外环肽段的抗体，针对hKv1.5/IKur通道跨膜片段S5和S6所构成的离子通道孔区胞外环肽段的抗体，理论上能够对hKv1.5/IKur通道产生特异性抑制作用，从而开发出一种新型、对房颤具有抑制作用的生物制剂。目前尚未见抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体的相关报道。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种人源性电压门控钾通道hKv1.5免疫原性肽段，基于该肽段制备的抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体，可以作为hKv1.5通道以及由hKv1.5通道基因编码表达的IKur通道新的、特异性抑制剂。

[0008] 实现本发明的具体技术方案：

[0009] (1)hKv1.5胞外环肽段E313序列的选择：hKv1.5通道跨膜蛋白分子片段S5，S6主要构成离子通道孔，是钾离子进出细胞的部位。根据hKv1.5通道α亚基跨膜片段S5和S6之间的胞外环肽段氨基酸的亲水性、表露性和柔韧性等，选择抗原指数高的包含连续13个氨基酸的一段肽段-hKv1.5胞外环肽段E313，作为抗原决定簇或半抗原。具体氨基酸序列为：Glu-Ala-Asp-Asn-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro，并应用该肽段作为抗原决定簇/半抗原，制备针对该肽段的抗体。

[0010] (2)hKv1.5胞外环肽段E313的合成：根据E313肽段氨基酸序列采用多肽自动合成仪，固相法合成hKv1.5通道胞外环肽段E313。

[0011] (3)抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体的制备：采用戊二醛偶联法，以牛血清白蛋白作为载体蛋白合成多肽-BSA完全抗原。将此抗原与完全或不完全弗氏佐剂一起免疫新西兰大白兔，制备抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体。定期测定血清中该抗体的滴度。于免疫5次后，采血，亲合层析法提纯该抗体。

[0012] (4)抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对IKur的抑制作用：通过膜片钳技术，观察抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对人心房肌细胞上的IKur的抑制作用。

[0013] (5)抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对人心房肌细胞动作电位的影响：通过膜片钳技术，观察抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对人心房肌细胞动作电位的影响。

[0014] (6)抗hKv1.5胞外环肽段E314抗体特异性鉴定：

[0015] 通过免疫印迹法和免疫荧光组织化学法，分别观察抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体与人心房肌细胞上的hKv1.5通道蛋白及稳定表达HERG、hKCNQ1/hKCNE1通道基因的HEK293细胞系和人心肌细胞上HERG通道、hKCNQ1/hKCNE1通道、电压门控钠通道、L型钙通道蛋白的结合。

[0016] 通过膜片钳技术，观察抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对上述细胞系和人心房肌细胞电压门控钠通道及L型钙通道电流的影响，明确抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体的特异性。

[0017] 本发明具有以下优点：

[0018] (1)hKv1.5通道免疫原性肽段E313可作为抗原决定簇/半抗原制备针对该肽段的抗体，该肽段也可用作检测、筛选和鉴定对hKv1.5/IKur通道蛋白具有抑制功能的抗体所针对的抗原决定簇。

[0019] (2)基于hKv1.5通道胞外环肽段E313制备的抗体-抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体可作为hKv1.5/IKur通道新的、特异性抑制剂，用于对hKv1.5/IKur通道功能的研究。该抗体可用于文献报道的以hKv1.5/IKur为干预靶点的房颤的治疗性研究。基于E313肽段所制备的单克隆抗体和疫苗将有助于房颤的治疗。

附图说明

[0020] 图1：hKv1.5通道胞外环肽段抗原决定簇预测图。A：根据氨基酸的亲水性预测的hKv1.5通道结构图；B：hKv1.5通道胞外环肽段氨基酸抗原性预测图，E3表示所选取的肽段E313：Glu-Ala-Asp-Asn-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro，共13个氨基酸；C：根据Jameson-Wolf法筛选出的跨膜片段S5和S6之间胞外环肽段E313个氨基酸的抗原指数。

[0021] 图2：抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体滴度。

[0022] 图3：免疫荧光法测定抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体与IKur通道蛋白的特异性结合。A：抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体与表达于人心房肌细胞膜上的IKur通道蛋白结合。a为绿色荧光显示抗体与细胞膜的结合，b为无绿色荧光显示细胞核；B：经E313肽段孵育后的抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体，与表达于人心房肌细胞膜上的IKur通道蛋白无结合；
C：HEK293细胞无绿色荧光，表明抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体与稳定表达于HEK293细胞膜上的HERG通道蛋白无结合；D：HEK293细胞无绿色荧光，表明抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体与稳定表达于HEK293细胞膜上的hKCNQ1/hKCNE1通道蛋白无结合。

[0023] 图4：免疫印迹法测定抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体与IKur通道蛋白的特异性结合。A：抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体仅与表达于人心房肌上的75kDa IKur通道蛋白特异性结合，而与表达于人心房肌上的145/155kDa HERG通道1α亚基，120kDa hKCNQ1通道，220kDaNav1.5通道α亚基，190kDa Cav1.2通道α1C亚基蛋白无结合；经E313肽段孵育后的抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体与表达于人心房肌上的IKur通道蛋白无结合；B：抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体仅与表达于人心室肌上的75kDa IKur通道α亚基蛋白特异性结合，而与表达于人心室肌上的HERG通道1α亚基、hKCNQ1通道、Nav1.5通道α亚基、Cav1.2通道α1C亚基蛋白无结合。

[0024] 图5：抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对人心房肌细胞上IKur的抑制作用。A对照组：表达于窦性心律患者心房肌细胞上的IKur；B：抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体与过量hKv1.5胞外环肽段E313预孵育后对IKur的作用；C～E不同浓度抗体组：15nM，30nM和60nM抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对窦性心律患者心房肌细胞上IKur的抑制作用；F房颤组：表达于房颤患者心房肌细胞上IKur；G：60nM抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对房颤患者心房肌细胞上IKur的抑制作用；H：与过量hKv1.5胞外环肽段E313预孵育后及不同浓度抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对窦性心律患者心房肌细胞上IKur电流-电压曲线的影响；
I：去极化脉冲为+50mV时各组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果表明不同浓度抗体组与对照组相比有统计学意义*P＜0.001，预孵育组与对照组相比无统计学意义P＞0.05；J：60nM抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对房颤患者心房肌细胞上IKur电流-电压曲线的影响；K：去极化脉冲为+50mV时窦性心律组，房颤组及抗体组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果表明抗体组与房颤组相比有统计学意义*P＜0.001，房颤组与窦性心律组相比电流密度显著减少，有统计学意义*P＜0.001。

[0025] 图6：抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对人心房肌细胞动作电位时程的影响。A：窦性心律患者对照组及E313抗体组心房肌细胞动作电位；B：心房颤动患者对照组及E313抗体组心房肌细胞动作电位；C：60nM E313抗体延长窦性心律患者心房肌细胞动作电位时程APD20，APD50，缩短APD90，统计结果与对照组相比有统计学意义，*P＜0.001，*P＜0.001，*P＜0.001 vs对照组；D：60nM E313抗体延长心房颤动患者心房肌细胞动作电位时程APD20，APD50，APD90，统计结果与对照组相比有统计学意义，*P＜0.001，*P＜0.001，*P＜0.001vs对照组；E：不同刺激频率(0.5HZ，1HZ，2HZ)下60nM E313抗体延长心房颤动患者心房肌细胞动作电位时程APD20，APD50，APD90呈轻微的频率依赖性，但与对照组相比无统计学意义，P＞0.05。

[0026] 图7：抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对人心房肌细胞电压门控钠通道电流的抑制作用。A：对照组：正常人心房肌细胞电压门控钠通道电流；B：抗体组：60nM抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对人心房肌细胞电压门控钠通道电流的影响；C：60nM抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对人心房肌细胞电压门控钠通道电流-电压曲线的影响；D：去极化脉冲为-35mV时两组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果抗体组与对照组相比无统计学意义，P＞0.05。

[0027] 图8：抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对人心房肌细胞L型钙通道电流的抑制作用。A：对照组：正常人心房肌细胞L型钙通道电流；B：抗体组：60nM抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对人心房肌细胞L型钙通道电流的影响；C：60nM抗hKv1.3胞外环肽段E313抗体对人心房肌细胞L型钙通道电流-电压曲线的影响；D：去极化脉冲为+10mV时两组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果抗体组与对照组相比无统计学意义，P＞0.05。

[0028] 图9：抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对稳定表达于HEK293细胞系上的HERG电流的抑制作用。A：对照组：稳定表达于HEK293细胞系上的HERG通道电流；B：抗体组：60nM抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对HERG通道电流的影响；C：60nM抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对HERG通道电流-电压曲线的影响；D：去极化脉冲为+40mV时两组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果抗体组与对照组相比无统计学意义，P＞0.05。图10抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对稳定表达于HEK293细胞系上的hKCNQ1/hKCNE1通道电流的抑制作用。A：对照组：稳定表达于HEK293细胞系上的hKCNQ1/hKCNE1通道电流；B：抗体组：60nM抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对hKCNQ1/hKCNE1通道电流的影响；C：60nM抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对KCNQ1/KCNE1通道电流电流-电压曲线的影响；D：去极化脉冲为+40mV时两组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果抗体组与对照组相比无统计学意义，P＞0.05。

具体实施方式

[0029] 以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。

[0030] 实施例1抗原的合成

[0031] 根据hKv1.5通道α亚基跨膜片段S5和S6之间的胞外环肽段氨基酸的亲水性、表露性和柔韧性等，采用Jameson-Wolf算法，通过计算机，选择抗原指数高的包含连续13个氨基酸的一段肽段-hKv1.5胞外环肽段E313，具体氨基酸序列为：Glu-Ala-Asp-Asn-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro。根据其氨基酸序列采用PSSM8型多肽自动合成仪，固相法合成hKv1.5通道胞外环肽段E313。采用戊二醛偶联法，以BSA作为载体蛋白合成多肽-BSA完全抗原。抗原合成完毕后，置于-70℃冰箱中备用。

[0032] 实施例2抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体的制备

[0033] (1)动物免疫

[0034] 将制备的抗原与完全或不完全弗氏佐剂一起免疫新西兰大白兔(清洁级，体重2～3kg)，制备抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体。设置免疫组和假性免疫组，免疫组：初次免疫每只兔取抗原800μg，后继免疫每只兔取抗原400μg，均加等体积弗氏佐剂，初次免疫用完全弗氏佐剂，以后用不完全弗氏佐剂，充分乳化后，于兔子背部、后腿皮下多点注射。
每两周加强免疫一次，共5次。假性免疫组：用生理盐水加弗氏佐剂假性免疫，剂量与方法同免疫组。

[0035] (2)血清标本的留取

[0036] 从初次免疫开始，每次免疫前从兔耳缘静脉抽血1ml，动态观察血清抗体效价，第9周处死，留取血清制备抗体。

[0037] (3)抗体的制备提纯

[0038] 抗体采用亲合层析法制备提纯，提纯完毕后分装，置于-20℃冰箱中备用(以下称一抗)。

[0039] 实施例3 ELISA检测抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体效价

[0040] 以假性免疫的健康新西兰大白兔血清为阴性对照，将不同时段兔血清进行检测。将合成的多肽，以每孔1μg包被于酶联板，方阵滴定法先后加入制备的一抗及HRP标记的羊抗兔IgG，TMB/H2O2显色，稀H2SO4终止反应。在酶标仪450mm波长处测吸收度OD值，以(待测孔OD值-空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD值)≥2.1为阳性，＜2.1为阴性。每次试验均设3个复孔阴性对照。取1份阳性样品，进行同一板内及不同板间的重复试验。

[0041] ELISA检测发现在0周，2周留取的血清抗体滴度为0，第4周留取的血清抗体滴度为1∶25，效价偏低，第6周留取的血清抗体滴度为1∶3200，效价有一次明显的飞跃。表明随着免疫时间及免疫次数的增加，抗体的滴度在上升，第8周抗体滴度达1∶6400、第9周抗体滴度达到1∶12800，说明抗体滴度已达到相对稳定较高的水平(见图2)。

[0042] 实施例4稳定表达HERG和hKCNQ1/hKCNE1通道基因HEK293细胞系的建立

[0043] (1)HEK293细胞培养：转染前1d，采用0.25％胰酶消化，将处于对数生长期的细胞5
制备成单细胞悬液，以约3～6×10 细胞接种于培养板，加含10％胎牛血清的DMEM培养基，在37℃5％CO2饱和湿度培养箱中，细胞生长至铺满培养板。

[0044] (2)G418和潮霉素浓度筛选：于HERG/pcDNA3，hKCNQ1/pCEP4质粒(由美国威斯康星大学麦迪逊分校医学院Dr.Robertson Gail和香港大学李贵荣教授馈赠)和hKCNE1/pcDNA3质粒转染前两周，确定G418(购自美国Invitrogen公司)和潮霉素(购自瑞士Roche公司)杀死HEK293细胞的最低浓度。

[0045] (3)转染：分别按照 HD(购自瑞士Roche公司)、Attractene转染试剂盒(购自美国QIAGEN公司)的说明书进行操作。于含10％胎牛血清的DMEM培养基中缓缓加入脂质体/DNA复合物，摇匀，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜。

[0046] (4)克隆筛选：转染72h后，更换含10％胎牛血清的DMEM培养基，并开始在DMEM培养基中加入合适浓度的G418和潮霉素。待单克隆长出后，用克隆柱挑选单克隆，扩增后应用全细胞膜片钳技术检测细胞克隆IHERG和IhKCNQ1/hKCNE1的表达，所应用膜片钳记录方法见实施例7。挑选稳定表达IHERG和IhKCNQ1/hKCNE1的细胞克隆。

[0047] 实施例5单个人心房肌细胞的分离

[0048] 采用二步酶解法分离人单个心房肌细胞。先将心肌组织块剪碎，用36℃100％氧饱和的无钙台式液反复冲洗三遍，共15min，然后将其置入含150-200U/ml II型胶原酶(购自美国Worthington公司)、1.2U/ml XXIV型蛋白酶(购自美国SIGMA公司)和1mg/ml牛血清白蛋白(购自美国SIGMA公司)的无钙台式液中。温孵约50min，再将剩余组织置入上述相同的含胶原酶无钙台式液中继续温孵，每隔10min显微镜下观察细胞状况，待镜下细胞数量和质量最佳时，停止温孵，离心获取心房肌细胞。分离好的心房肌细胞置于KB液中，室温下静置1h备用。

[0049] 实施例6抗hKv1.5胞外环肽段E314抗体的特异性鉴定

[0050] 免疫荧光组织化学法观察抗体与稳定表达HERG和hKCNQ1/hKCNE1通道基因HEK293细胞系和人心房肌细胞的结合。HEK293细胞用0.25％胰酶消化成单细胞后，以合适浓度接种在载玻片上贴壁过夜，而人心房肌细胞滴加在载玻片上，4℃静止30分钟，然后4％多聚甲醛固定30分钟，PBS振洗3次，每次10min；10％驴血清和1％牛血清白蛋白湿盒封闭2小时；滴加用封闭液稀释的一抗在4℃冰箱过夜，PBS振洗3次，每次10min；加FITC标记的1∶100驴抗兔IgG室温孵育2小时，PBS振洗3次，每次10min；滴加DAPI，室温孵育5分钟，振洗三次，每次5分钟；抗淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察并照相记录结果。结果显示，抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体特异性地结合于人心房肌上的IKur通道蛋白，而该抗体与稳定表达于HEK293细胞膜上的HERG通道、hKCNQ1/hKCNE1通道蛋白均不结合，经E313肽段孵育后，抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体与人心房肌细胞膜上IKur通道蛋白的结合作用消失(见图3)。

[0051] 免疫印迹法观察抗体与稳定表达HERG和hKCNQ1/hKCNE1通道基因HEK293细胞系和人心房肌及心室乳头肌蛋白的结合。细胞膜蛋白的提取参考Barry DM等的方法，提取的蛋白用BCA法测蛋白浓度。每孔取35μg蛋白上样于7.5％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳后转移样品蛋白至硝酸纤维素膜上。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBST中室温摇动封闭2.5小时，加以1∶1000一抗4℃孵育过夜。用TBST洗膜3次，每次15min，加入1∶10000HRP标记羊抗兔二抗室温孵育2小时，TBST洗膜3次，每次15min，浸入增强化学发光试剂，条带显色后暗室X线压片曝光30秒，洗片，烘干。结果表明，抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体能特异识别表达于人心房肌和心室肌上的75KD的IKur通道α亚基蛋白。而抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体未识别表达于人心房肌和心室肌及稳定表达于HEK293细胞系上145kDa/155KD的HERG通道蛋白、120KD的hKCNQ1通道蛋白、190KD的Cav1.2通道蛋白α1C亚基、220KD的Nav1.5通道蛋白α亚基(见图4)。

[0052] 实施例7抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对IKur、INa、ICaL、IHERG、IhKCNQ1/hKCNE1电流和人心房肌细胞动作电位时程的影响

[0053] 通过Axopatch200B放大器采用全细胞(IKur、INa、IHERG)或穿孔膜片钳技术(ICaL、IhKCNQ1/hKCNE1、AP)，记录抗体孵育前后人心房肌细胞和HEK293细胞系离子电流及动作电位时程。

[0054] IKur程序设置：采样频率＝10KHz，低通滤波＝5KHz，首先保持电位(HP)-50mV，给予脉宽100ms、+40mV固定去极化的刺激脉冲，使心肌细胞Itol提前失活，排除Itol对记录IKur的影响，间隔10ms后HP＝-50mV、脉宽150ms、阶跃10mV、-40～+60mV的系列去极化刺激脉冲，继而膜电位钳制到-30mV观察尾电流，最后回到HP＝-50mV，刺激频率＝1Hz，IKur电流密度＝电流强度/膜电容(pA/pF)。以不同钳制电压下的IKur电流密度对相应测试电压绘成电流-电压(I-V)曲线。

[0055] INa程序设置：采样频率＝10KHz，低通滤波＝5KHz，HP＝-120mV、脉宽100ms、阶跃5mV、-70～+30mV的系列去极化脉冲刺激记录INa，刺激频率＝1Hz。INa的电流强度的计算：测量内向电流峰值与刺激结束后的稳态值之差。INa电流密度＝电流强度/膜电容(pA/pF)。以不同钳制电压下的INa电流密度对相应测试电压绘成I-V曲线。

[0056] IHERG程序设置：采样频率＝10KHz，低通滤波＝5KHz，首先给予HP＝-80mV，继而给予脉宽4000ms、阶跃10mV、-40～+50mV的去极化脉冲，然后HP＝-50mV，持续5000ms，分别记录IHERG刺激电流和尾电流(Itail)，刺激频率＝0.05Hz。Itail的电流强度的计算：测量阶跃电流的峰值减去刺激结束稳态电流水平(pA)。Itail电流密度＝电流强度/膜电容(pA/pF)。以不同钳制电压下的IHERG的Itail电流密度对相应测试电压绘成I-V曲线。

[0057] ICaL程序设置：采样频率＝10KHz，低通滤波＝5KHz，HP＝-40mV、脉宽300ms、阶跃10mV、-40～+60mV的系列去极化脉冲刺激记录ICaL，刺激频率＝0.2Hz。ICaL的电流强度的计算：测量内向电流峰值与刺激结束后的稳态值之差。ICaL电流密度＝电流强度/膜电容(pA/pF)。以不同钳制电压下的ICaL电流密度对相应测试电压绘成I-V曲线。

[0058] IhKCNQ1/hKCNE1程序设置：采样频率＝10KHz，低通滤波＝5KHz，首先维持电位(HP)-80mV，给予脉宽3000ms、阶跃20mV、-60～+60mV的去极化脉冲，然后维持电位(HP)-40mV，持续3000ms，分别记录IhKCNQ1/hKCNE1刺激电流和尾电流，刺激频率＝0.1Hz。Iks的刺激电流强度的计算：测量阶跃电流的峰值减去刺激结束稳态电流水平(pA)。IhKCNQ1/hKCNE1电流密度＝电流强度/膜电容(pA/pF)。以不同钳制电压下的IhKCNQ1/hKCNE1的刺激电流密度对相应测试电压绘成I-V曲线。

[0059] AP程序设置：采样频率＝10KHz，低通滤波＝5KHz，1.2nA电流刺激(1.2倍阈值)，持续时间5ms，刺激频率0.5Hz，1Hz，2Hz。动作电位观察指标：静息膜电位(RMP)，复极化20％(APD20)，复极化50％(APD50)时间，复极化90％(APD90)时间，动作电位幅度(APA)。

[0060] 实验数据经pCLAMP9.0软件采集，Digidata1322A模-数/数-模转换器转换，存盘于计算机。实验在室温(20℃～25℃)下进行。

[0061] 实验数据通过统计学方法进行分析，数据以均数±标准误表示。采用SPSS12.0统计软件包，进行t检验和单因素方差分析，P＜0.05具有统计学意义。

[0062] (1)抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对IKur的抑制作用

[0063] 图5为预孵15nmol/L、30nmol/L、60nmol/L三组抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体组与表达于窦性心律患者心房肌细胞IKur电流图，以及预孵60nmol/L抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体组与表达于房颤患者心房肌细胞IKur电流图。以各脉冲刺激下平均电流密度值对相应膜电位求得I-V曲线。结果显示，三组浓度E313抗体对窦性心律患者心房肌IKur均有抑制作用，在去极化脉冲为+50mV条件下，60nmol/L，30nmol/L，15nmol/L E313抗体抑制该电流分别达74％，57％，22％，IKur电流密度平均值与对照组相比均有明显差异(2.03364±0.29079pA/pF，3.41384±0.26239pA/pF，6.15294±0.4495nA/pF vs7.87311±0.51408pA/pF，P＜0.001)；60nmol/L E313抗体对房颤患者心房肌IKur有抑制作用，在去极化脉冲为+50mV条件下，60nmol/L E313抗体抑制该电流达58％，IKur电流密度平均值与房颤组相比有明显差异(2.48442±0.16672pA/pF vs 5.90023±0.25078pA/pF，P＜0.001)。E313抗体与过量抗hKv1.5胞外环肽段E313孵育后对IKur的抑制作用消失，IKur电流密度平均值与对照组相比无明显差异(7.47311±0.50408pA/pF vs
7.87311±0.51408pA/pF，P＞0.05)。

[0064] (2)抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体延长心房肌细胞动作电位时程

[0065] 图6为预孵60nmol/L抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对窦性心律及心房颤动患者心房肌细胞动作电位时程的影响。窦性心律患者APD20(6±2ms)短于心房颤动患者APD20(26±5ms)，而窦性心律患者APD90(285±11ms)长于心房颤动患者
APD90(241±9ms)。60nmol/LE313抗体延长窦性心律患者动作电位时程APD20(6±2ms vs
19±3ms，P＜0.001)和APD50(55±4ms vs 117±5ms，P＜0.001)，缩短窦性心律患者动作电位时程APD90(285±11msvs 233±8ms，P＜0.01)。60nmol/LE313抗体延长心房颤动患者动作电位时程APD20(26±5ms vs 59±7ms，P＜0.001)，APD50(60±6ms vs 112±9ms，P＜0.001)，及APD90(241±9ms vs 310±12ms，P＜0.001)。不同刺激频率(0.5HZ，1HZ，
2HZ)下60nM E313抗体对心房颤动患者心房肌细胞动作电位时程APD20，APD50，APD90的延长呈轻微频率依赖性，但与对照组相比无统计学意义，P＞0.05。

[0066] (3)抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体对INa、ICaL、IHERG和IhKCNQ1/hKCNE1的影响[0067] 图7为预孵60nmol/L抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体组和对照组人心房肌细胞INa电流图。以各脉冲刺激下平均电流密度值对相应膜电位求得I-V曲线。结果显示，与对照组比较，去极化脉冲为-35mV条件下预孵抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体组INa电流密度平均值无明显差异(-36.22484±6.82026pA/pF vs-38.05864±6.73967pA/pF，P＞0.05)。

[0068] 图8为预孵60nmol/L抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体组和对照组人心房肌细胞ICaL电流图。以各脉冲刺激下平均电流密度值对相应膜电位求得I-V曲线。结果显示，与对照组比较，去极化脉冲为+10mV条件下预孵抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体组ICaL电流密度平均值无明显差异(-16.0683±1.555pA/pF vs-16.83783±1.79633pA/pF，P＞0.05)。

[0069] 图9为预孵60nmol/L抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体组和对照组HEK293细胞IHERG的电流图。IHERG在-40mV时迅速激活，峰值电位在0mV，当膜电位大于0mV后，随着膜电位的增加，电流反而减小，呈现出明显的内向整流特性。当恢复到HP＝-50mV，记录到电流幅度更高的Itail。以各脉冲刺激下平均电流密度值对相应膜电位求得I-V曲线。Itail在+40mV时达到峰值，当膜电位再升高时尾电流饱和。结果显示，与对照组比较，去极化脉冲为+40mV条件下预孵抗hKv1.3胞外环肽段E314抗体组IHERG的Itail电流密度平均值无明显差异(38.89665±5.10447pA/pF vs 39.33293±5.00542pA/pF，P＞0.05)。

[0070] 图10为预孵60nmol/L抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体组和对照组HEK293细胞IhKCNQ1/hKCNE1的电流图。IhKCNQ1/hKCNE1在-40mV时缓慢激活，失活缓慢，当恢复到HP＝-40mV，记录到Itail。以各脉冲刺激下平均电流密度值对相应膜电位求得I-V曲线。结果显示，与对照组比较，去极化脉冲为+40mV条件下预孵抗hKv1.5胞外环肽段E313抗体组IhKCNQ1/hKCNE1电流密度平均值无明显差异(0.1947±0.0286nA/pF vs 0.19618±0.01018nA/pF，P＞0.05)。