吉林枝芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一种吉林枝芽孢杆菌(Virgibacillus jilinensisGIMN1.014T)及其应用，该菌已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期为2011年5月10日，保藏编号为CCTCC NO.M2011164，本发明中的吉林枝芽孢杆菌具有耐盐的能力，可用于耐盐微生物菌剂的研究与开发。

权利要求

T

1.吉林枝芽孢杆菌GIMN1.014(Virgibacillus jilinensis)，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO.M2011164。

说明书

吉林枝芽孢杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一种能耐盐的新的细菌及其应用，具体涉及吉林枝芽孢杆菌及其应用。

背景技术

[0002] 土壤盐渍化是限制农作物生长、发育和产量最严重的非生物胁迫之一。我国近1/5耕地发生盐碱化，盐碱地改良利用技术的发展，对于我国尤其是内陆干旱农业灌区农村经济持续健康发展、国土治理、生态环境保护等具有极其重要的现实意义。目前改良盐碱地的主要措施有：工程措施、水利措施、生物措施和农业措施等。其中生物改良主要包括种植耐盐植物和使用微生物菌肥等。

[0003] 近年来，国内外许多学者尝试盐碱地土壤中分离得到耐盐细菌，并对其耐盐机制进行研究。目前对革兰氏阳性菌的研究主要集中于枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌。

[0004] 芽孢杆菌广泛分布于自然界中，由于其产生芽孢而具有极强的抗逆性。本研究从土壤中分离筛选一株新的枝芽孢菌耐盐菌株，并对其耐盐性质进行了研究。这为下一步耐盐微生物菌剂的研究与开发打下基础；并且可能用于耐盐基因的克隆及转基因耐盐植物的开发。

发明内容

[0005] 为了开发新的耐盐细菌资源，本发明的目的在于提供一种能耐盐的新的细菌——吉林枝芽孢杆菌。

[0006] 该菌命名为吉林枝芽孢杆菌(Virgibacillus jilinensis GIMN1.014T)，保藏编号为CCTCC NO.M2011164。

[0007] 本发明所述的吉林枝芽孢杆菌是从吉林西部的盐碱土壤中采集，经实验室分离培养获得的。该菌培养条件为：

[0008] (1)培养基：采用牛肉膏蛋白胨培养基。

[0009] 具体配方为：牛肉膏10g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，水1000ml，pH 7.0；

[0010] (2)培养温度：30℃。

[0011] 本发明吉林枝芽孢杆菌(Virgibacillus jilinensis GIMN1.014T)的分子分类地位的确定。

[0012] 该菌株的16S rRNA序列登陆号为HQ693527，其16S rRNA序列如SEQ ID NO：1所示。

[0013] 测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与本发明菌株亲缘关系最近的种属。从数据库获得相关种属的16S rRNA序列，构建系统发育树。

[0014] 吉林枝芽孢杆菌的16S rRNA基因序列与菌株Virgibacillus carmonensis LMG T20964 只有94.9％的同源性，本发明与其同源性最高的枝芽孢杆菌菌株微生物学特性的比较见表1。

[0015] 表1吉林枝芽孢杆菌与其同源性最高的枝芽孢杆菌菌株微生物学特性比较[0016]

[0017] 注：+，阳性；-，阴性；+/-，弱阳性；NA，无可取数据T

[0018] 由于本发明与同源性最高的菌株Virgibacillus carmonensis LMG20964 之间在H2S的产生，D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、棉子糖和D-蜜二糖的利用上存在明显不同，而且16S rRNA基因序列同源性只有94.9％。一般情况下，16S rRNA基因序列同源性小于97.0％的细菌，其DNA-DNA杂交率不会大于70％(Stackebrandt & Goebel，1994)，因此无需进行DNA-DNA杂交率实验。根据1987年国际系统微生物委员会ICSB规定，DNA同源性小于
70％或者杂交分子的热解链温度差小于或等于2℃为细菌种的界限(Wayne et al，1987)，因此本发明的细菌为一种新的细菌，命名为吉林枝芽孢杆菌(Virgibacillus jilinensis T
GIMN1.014)。

[0019] 本发明吉林枝芽孢杆菌具有以下有益效果：

[0020] 本发明吉林枝芽孢杆菌具有耐盐的能力，具有较大的研究价值。

[0021] 本发明吉林枝芽孢杆菌(Virgibacillus jilinensis GIMN1.014T)已于2011年5月10日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2011164。

附图说明

[0022] 图1是本发明吉林枝芽孢杆菌的透射电子显微镜照片(2500倍)；

[0023] 图2是本发明吉林枝芽孢杆菌及部分相关菌株依据16S rRNA序列构建的系统发育树。

具体实施方式

[0024] 下面结合具体实施例对本发明进行更详尽的说明。

[0025] 实施例1：本发明吉林枝芽孢杆菌的分离

[0026] 从吉林西部盐碱地0-30cm土样，取10g土壤放入装有90mL无菌水的三角瓶中(带玻珠)，在180rpm转速下振荡30分钟，静置10分钟后取上层液稀释10倍后取0.1mL均匀涂布在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，翻转平板置于30℃培养箱中培养7天，即可获得本发T明所述的菌株Virgibacillus jilinensisGIMN1.014。

[0027] 牛肉膏蛋白胨培养基：

[0028] 牛肉膏10g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，水1000ml，pH 7.0；本发明的吉林枝T芽孢杆菌(Virgibacillus jilinensis GIMN1.014)具有下述性质：

[0029] 1.形态特征

[0030] 吉林枝芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨培养基平板上培养24h后的菌落呈奶酪色，圆形或不规则形，表面光滑半透明，边缘整齐；革兰氏染色为阳性，菌体杆状，鞭毛端生，不运动，形成芽孢，芽孢椭圆形。

[0031] 2.生理生化特征

[0032] 吉林枝芽孢杆菌的接触酶试验为阳性；能水解明胶、七叶树素和酪蛋白；在甘油、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D麦芽糖、D-乳糖、蔗糖、D-松三糖和D-松二糖中产酸；能利用D-海藻糖、蔗糖、D-松二糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖、甘油、丝氨酸、果胶、甲酸和乙酸作为碳源；生长温度范围15-45℃，以及生长pH值范围为7.0-11.5。

[0033] 3.其他性质

[0034] 吉林枝芽孢杆菌甲基萘醌的主要类型为MK-7，细胞壁的DAP类型为meso-DAP，脂肪酸主要成分为：anteiso-C15:0；磷脂主要组分为PE、PG、PI、PIM和PIMD。细胞壁脂肪酸种类和含量如表2。

[0035] 表2吉林枝芽孢杆菌与相近种的细胞壁脂肪酸种类和含量比较

[0036]

[0037] 实施例2：本发明的吉林枝芽孢杆菌16S rRNA的序列测定

[0038] 1、PCR模板DNA的快速制备

[0039] 将细菌划线接种在牛肉膏蛋白胨培养基的平板上，30℃培养过夜。取单一菌落悬浮于10μl无菌蒸馏水中，于沸水中加热5min，离心，取上清作为PCR模板DNA.[0040] 2、16S rRNA基因PCR扩增

[0041] PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

[0042] PrimerA：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

[0043] PrimerB：5’-AAGGAGGTGATCCACCCCCA-3’

[0044] PCR反 应 体 系(总 体 积50μl)：10倍 缓 冲液 5μl，dNTP(2mmol/l)4μl，PrimerA(10pmol/l)1μl，PrimerB(10pmol/l)1μl，Taq酶(2U/l)0.4μl，DNA模板1μl，灭菌ddH2O 37.4μl。

[0045] PCR扩增条件：94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循环；72℃7min。

[0046] 3、序列测定

[0047] PCR产物纯化后，送上海英骏生物技术有限公司用3730全自动测序仪测序。

[0048] 实施例3：本发明吉林枝芽孢杆菌耐盐实验测定

[0049] 通过液体培养基的梯度接种实验，来确定该细菌耐盐的能力。

[0050] 挑取本发明的吉林枝芽孢杆菌的单菌落，接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在30℃的摇床中培养1-2天，作为母液，分别吸取100μl的母菌液于含有0％-11％梯度的NaCl液体培养基中，30℃的摇床中培养1-2天，利用分光光度计测定OD600的值来确定生长情况。

[0051] 测试结果表明，本发明的吉林枝芽孢杆菌具有耐盐的能力，最高达10％(表4)，可用于制备耐盐微生物菌剂和改良盐碱地的微生物菌肥。

[0052] 表4吉林枝芽孢杆菌耐盐能力测定结果

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