一种具有产电特性的蜡样芽孢杆菌及其在微生物燃料电池中的应用转让专利
申请号 : CN201110347512.1
文献号 : CN102399722B
文献日 : 2013-04-24
发明人 : 张剑荣 , 赵翠娥 , 郭利川 , 刘常宏
申请人 : 南京大学
摘要 :
一种具有产电能力的蜡样芽孢杆菌，该蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus），2011年7月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.5055。该菌株鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）菌株，具有以下特征：菌体为细胞杆状，末端方，成短或长链，直径为0.4～0.6μm，菌长为2.0～5.0μm；革兰氏阳性；菌落大，表面粗糙，扁平，不规则，在普通琼脂平板培养基上，37℃，培养24h，可形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落(似蜡烛样颜色)直径5-7mm。可利用多种碳源，并能在厌氧和好氧条件下生长。利用该菌株制备的微生物燃料电池具有较高的产电能力，既可以直接用于微生物燃料电池中进行产电，也可以利用污水有机物进行产电。
权利要求 :
1.一种具有产电能力的蜡样芽孢杆菌，其特征在于：所述的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ）命名为MFC-1，已于2011年7月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 5055。
2. 根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌在微生物燃料电池中的应用。
3. 根据权利要求2所述的蜡样芽孢杆菌在微生物燃料电池中的应用，其特征在于：所述的蜡样芽孢杆菌能以葡萄糖作为电子供体直接用于微生物燃料电池中进行产电；或者能在污水环境中利用有机物成分进行产电。
说明书 :
一种具有产电特性的蜡样芽孢杆菌及其在微生物燃料电池
中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种芽孢杆菌即蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的产电特性及其在微生物燃料电池中的应用研究。
背景技术
[0002] 能源紧张和环境污染是我国现代社会可持续发展面临的两大主要挑战。随着社会经济不断发展，对能源的大量消耗而导致环境质量的严重恶化，尤其是碳排放增加引起的温室效应将对全球气候长期影响。因此，通过节约能源或实现新型能源的替代来实现环境效益、经济效益和社会效益的统一是目前面临的最主要的研究课题。微生物燃料电池(Microbial Fuel Cell, MFC)是一种新型、便捷的能源装置。它可以利用各种有机物、无机物以及微生物呼吸的代谢产物、发酵产物、污水等作为燃料，是目前环境领域的研究热点。微生物燃料电池如果用在废水处理工艺，除了可以对废水进行有效处理外，还可以为人类提供清洁能源，具有清洁、安全、低噪音、高效、低辐射以及利于操作等特点。 [0003] Logan等以城市生活污水为营养物质构造的新型微生物燃料电池实现了在污水处理的同时回收电能，从而在一定程度上降低了污水的处理成本（参见：Liu H，Ramnarayanan R，Logan B E. Production of electricity during wastewater treatment using a single chamber microbial fuel cell[J]. Environmental Science Technology，2004，
38（14）：4040-4046.）。据分析，废水中含有大量的能量(BOD)，目前污水处理仍以耗能较高的好氧曝气处理工艺为主，而利用厌氧甲烷发酵的处理污水工艺因有机污染物浓度较低在经济上不可行且运行时间较长，不仅对能源回收不利，还将消耗大量能源。 同时，我国持续的城市化进程将使用于污水处理的经济成本大幅上升，进而给经济、社会、环境带来不利的影响。MFC技术兼具厌氧污水处理和好氧曝气的特征，污水处理效率高，还可产生电能，有望为水资源的可持续利用带来新契机。
38（14）：4040-4046.）。据分析，废水中含有大量的能量(BOD)，目前污水处理仍以耗能较高的好氧曝气处理工艺为主，而利用厌氧甲烷发酵的处理污水工艺因有机污染物浓度较低在经济上不可行且运行时间较长，不仅对能源回收不利，还将消耗大量能源。 同时，我国持续的城市化进程将使用于污水处理的经济成本大幅上升，进而给经济、社会、环境带来不利的影响。MFC技术兼具厌氧污水处理和好氧曝气的特征，污水处理效率高，还可产生电能，有望为水资源的可持续利用带来新契机。
[0004] 1999年，Kim等首次发现有些微生物在代谢过程中可将电子直接传递到电极表面（参见：Kim B H, Kim H J, Hyun M S et al. Direct electrode reaction of Fe(III)-reducing bacterium, Shewanella putrefaciens [J]. J Microbiol Biotechnol, 1999, 9(2): 127-131.）。2004年，Jang和Liu等直接以混合菌分别成功构2
建了无中间体无质子交换膜MFC，电池输出功率达到了几百mWm，这一显著的成绩立即引起了更多人对MFC 的关注，也引发了以混合菌接种MFC 的研究热潮。随后，研究人员相继发现某些微生物能在无介体的条件下直接将体内产生的电子传递到电极。最近的研究发现了多种可以向细胞外直接转移电子的细菌，这些胞外产电菌大多集中于两类异化金属还原菌属——Shewanella 和Geobacter。有关蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的产电特性及其在微生物燃料电池方面的应用在国内外尚未发现有报道。
建了无中间体无质子交换膜MFC，电池输出功率达到了几百mWm，这一显著的成绩立即引起了更多人对MFC 的关注，也引发了以混合菌接种MFC 的研究热潮。随后，研究人员相继发现某些微生物能在无介体的条件下直接将体内产生的电子传递到电极。最近的研究发现了多种可以向细胞外直接转移电子的细菌，这些胞外产电菌大多集中于两类异化金属还原菌属——Shewanella 和Geobacter。有关蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的产电特性及其在微生物燃料电池方面的应用在国内外尚未发现有报道。
发明内容
[0005] 本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供从自然界中分离具有高活性产电能力的蜡样芽孢杆菌及其在微生物燃料电池中的应用，所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus sp.)MFC-1菌株(以下简称MFC-1菌株)，所属分类为芽孢杆菌，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏日期为2011年7月12日，保藏号为CGMCC No5055。
[0006] 该MFC-1菌株能在污水环境中利用有机物成分进行产电，该菌还可以作为微生物燃料电池阳极催化剂进行催化底物产电。
[0007] 本发明的MFC-1菌株是该种内首次报道具有产电特性的菌株，在微生物燃料电池中具有很高的产电活性，具有广阔的工业应用前景和理论研究价值。
[0008] 本发明的MFC-1菌株是分离自南京大学生命科学学院门前的有机废水中，经菌落和形态的显微观察、染色反应、常规生理生化特征性实验以及16s rDNA序列分析，该菌株鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）MFC-1菌株，具有以下特征：（1）菌体为细胞杆状，末端方，成短或长链，直径为0.4～0.6μm，菌长为2.0～5.0μm；（2）革兰氏阳性；（3）菌落大，表面粗糙，扁平，不规则，在普通琼脂平板培养基上，37 ℃，培养24 h，可形成圆形或近似圆形、质地 软、无色素、稍有光泽的白色菌落(似蜡烛样颜色)直径5-7 mm；（4）
16S rDNA序列分析结果表明，该MFC-1菌与Bacillus cereus 、Bacillus thuringiensis和Bacillus subtilis的同源性均为100%，结合生理生化鉴定，鉴定其为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。（5）根据《伯杰氏手册》和《常见细菌鉴定手册》中描述的上述四种芽孢杆菌的鉴定特征(表1)，测定了MFC-1菌株的生理生化反应以及生长特性， 其生理生化指标如表1所示：
16S rDNA序列分析结果表明，该MFC-1菌与Bacillus cereus 、Bacillus thuringiensis和Bacillus subtilis的同源性均为100%，结合生理生化鉴定，鉴定其为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。（5）根据《伯杰氏手册》和《常见细菌鉴定手册》中描述的上述四种芽孢杆菌的鉴定特征(表1)，测定了MFC-1菌株的生理生化反应以及生长特性， 其生理生化指标如表1所示：
[0009] 表1蜡样芽孢杆菌MFC-1菌株的生理生化指标生理生化指标 结果 碳源利用指标 结果
厌氧生长 + D-葡萄糖 +
V-P测定 + 葡萄糖（产气） –
V-P培养物终pH<6 + L-阿拉伯糖 –
V-P培养物终pH>6 – D-甘露醇 –
伴孢晶体 – D-木糖 –
苯丙氨酸脱羧酶 – 水解:酪素 +
尿素水解 + 明胶 +
需要NaCl和KCl – 淀粉 +
生长温度：50℃ – 生长pH6.8营养肉汤 +
丙二盐酸 + 生长pH5.7营养肉汤 +
厌氧生长 + D-葡萄糖 +
V-P测定 + 葡萄糖（产气） –
V-P培养物终pH<6 + L-阿拉伯糖 –
V-P培养物终pH>6 – D-甘露醇 –
伴孢晶体 – D-木糖 –
苯丙氨酸脱羧酶 – 水解:酪素 +
尿素水解 + 明胶 +
需要NaCl和KCl – 淀粉 +
生长温度：50℃ – 生长pH6.8营养肉汤 +
丙二盐酸 + 生长pH5.7营养肉汤 +
[0010] 注：+：阳性，-：阴性，d：不同，ND：未测
[0011] 本发明的MFC-1菌株既可以利用多种碳源，在厌氧和好氧条件下均可生长；可以在营养培养基中培养，也可以在以葡萄糖为唯一碳源和能源的培养基中生长。在微生物燃料电池的阳极中生长的菌体具有高活性的产电能力。该菌株具有产电性能的报道属于首次。
[0012] 本发明的MFC-1菌株的应用方法有：（1）该菌能以葡萄糖作为电子供体直接用于微生物燃料电池中进行产电；（2）能在污水环境中利用有机物成分进行产电；（3）该菌可以作为微生物燃料电池阴、阳极催化剂进行催化底物产电。
[0013] 本发明提供的MFC-1菌株是从自然界中筛选分离得到的；该菌株表现出很好的产电能力，无论是淡水培养基还是污水培养基均能表现出高活性的产电能力，特别是在污水处理中既能促进污染物的降解又能产生利用污染物的电能。该MFC-1菌具有许多作为工业应用菌株的优良特性，产电活性高，具有广阔的工业应用潜力。
附图说明
[0014] 图1为微生物燃料电池的构造示意图；
[0015] 图2为MFC-1菌株在碳纸电极表面的附着扫描电镜图；
[0016] 图3 MFC-1菌株在微生物燃料电池中的电压—时间示意图。
具体实施方式
[0017] 实施例1：MFC-1菌株的筛选
[0018] 在南京大学校园内的自然废水中，取500ml自然废水放入微生物燃料电池的阳极室中，微生物燃料电池装置采用H型双室结构（图1），由两个玻璃瓶组成，之间用连接在玻璃瓶上的玻璃管对接，中间采用杜邦公司的Nafion 211质子交换膜，用夹子将两室加紧并连接起来，电极采用高纯碳纸，导线用铜丝连接，露出的部分用胶粘住，外电路连接一个1000Ω的固定电阻，电阻两端的电势差采用万用表测量。电池阳极通入高纯氮气以保证厌氧状态，阴极采用铁氰化钾溶液。将整个电池装置置于恒温（30℃）房间内运行。待外电路电压升高到稳定后，在厌氧环境下，将阳极室中格的碳纸电极放入生理盐水中，摇晃，使粘在上面的菌体进入生理盐水中，重新接种到新鲜的阳极液中再次运行电池进行富集，重复三次都能达到很高的电压的样品进行分离纯化。在厌氧培养箱中，将富集的样品涂布于LB固体培养基中培养，将得到的菌株进行纯化，经过多次划线分离得到一株纯化菌株。该菌株产电验证表明能达到550 mV的外电路电压，具有很高的产电活性。该菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），已于2011年7月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No. 5055。
[0019] 实施例2：MFC-1菌株的培养
[0020] 挑取LB培养基培养的MFC-1菌株，接种到含5mL LB培养基的15mL离心管中，37 ℃, 120转/分, 培养12小时后，以1%接种量将其加入含250 ml 到如下培养基的500 ml锥形瓶中, 培养基每升中含量：10g C6H12O6，5g yeast extract，10g NaHCO3，8.5g NaH2PO4，37℃，120转/分，培养12小时后，厌氧环境下离心再次得菌体, 用于微生物产电研究。
[0021] 实施例3：MFC-1菌株的产电
[0022] 按照实施例2表述的培养和接种方法，从200mL以葡萄糖作为电子供体的培养基中获得生长对数晚期的细胞，经厌氧条件下离心（8000rpm, 10min），50mM PBS缓冲液洗涤三次后重新分散到50mM葡萄糖作为电子供体的厌氧培养基中，接种到微生物燃料电池的阳极内。阳极室通高纯氮气保持厌氧环境，阴极液为0.1M PBS缓冲液的铁氰化钾溶液作为电子接受体，电池装置和运行条件如实施例1所述，外电阻采用1000欧姆，电池两端电压用万能表每隔5 min记录一次，电池产电过程见图3所示。