一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，涉及一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法，具体是一株高效利用木糖生长并产丁二酸重组菌株及其利用该菌株发酵生产丁二酸的方法。本发明的产丁二酸基因工程菌菌株分类命名为大肠埃希氏菌BA204，其保藏号登记号为CCTCC NO：M2011207。其构建过程主要包括失活或敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，并过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，使重组大肠杆菌能够利用木糖代谢生长，大幅度提高了丁二酸的合成效率。其发酵方法采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。

权利要求

1.一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌 BA204（Escherichia coli BA204），其保藏号登记号为CCTCC NO：M2011207；其具体构建步骤如下：（1） 以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的E.coliNZN111菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，得到同时缺乏ldhA、pflB和PPC的感受态菌株；（2）纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，构建得到过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒；

（3）将步骤（2）所述的质粒导入步骤（1）得到的感受态菌株，获得阳性转化子；

（4）利用步骤（3）的阳性转化子过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到可利用木糖代谢产丁二酸基因工程菌大肠埃希氏菌 BA204。

2.利用权利要求1所述的大肠埃希氏菌 BA204发酵生产丁二酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于将大肠埃希氏菌 BA204按体积百分比1%接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3时，按接种量10%转接至厌氧阶段发酵培养基中厌氧发酵。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于将大肠埃希氏菌 BA204按体积百分比1%接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3时，经膜分离处理后，按接种量10%转接至厌氧阶段发酵培养基中厌氧发酵。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的膜分离处理采用的膜为微滤膜。

6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述的厌氧阶段发酵培养基是以木糖为碳源的产丁二酸大肠杆菌用发酵培养基。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的碳源包括木糖、玉米芯水解液、稻草秸秆水解液或者甘蔗渣水解液。

说明书

一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术领域，涉及一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法，具体是一株高效利用木糖生长并产丁二酸重组菌株及其利用该菌株发酵生产丁二酸的方法。

背景技术

[0002] 丁二酸（succinic acid）又称琥珀酸，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，作为C4平台化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯 (PBS) 类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。

[0003] 丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转化可再生资源（葡萄糖、木糖等），由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可以吸收固定CO2，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，今年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重组谷氨酸棒杆菌和重组大肠杆菌。利用野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。E.coli 由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。

[0004] 野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，因此大肠杆菌敲除或失活乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性减少副产物的生成，但是由于敲除丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因，导致菌株不能生产乙酸，从而使伴随乙酸生成的ATP减少，最终导致重组大肠杆菌不能利用木糖代谢生长，并且生产丁二酸。

[0005] 玉米芯是农业生产中比较常见的废弃物，由于其成分含有大量纤维素，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此现有技术中大多数产丁二酸大肠杆菌不能利用玉米芯水解液发酵生产丁二酸。姜岷等将玉米芯按料液比1:5 (质量体积比)配制玉米芯料液，物料粒径250～380μm，H2SO4用量3% (体积分数)，水解温度126℃，反应时间215 h，利用活性炭吸附及Ca(OH)2中和等方式，对玉米芯多组分糖液进行脱毒脱盐处理，总糖质量浓度为50 g/L，其中木糖占80%以上。

[0006] 稻草秸秆是重要的一类可再生生物质资源。目前，除了在造纸业工业方面的利用，绝大多数被废弃，严重浪费了资源并且污染了环境。其主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此现有技术中大多数产丁二酸大肠杆菌不能利用稻草秸秆水解液发酵生产丁二酸，陶文沂等通过稀硫酸121℃处理稻草秸秆1 h，再用20 g/L的NaOH于121℃处理秸秆1h，葡萄糖和木糖二者总质量浓度都达50 g/L左右。

[0007] 甘蔗渣是甘蔗制糖时榨糖之后剩下的主要成分，因此其水解液对微生物发酵来说，是一种很好的可持续利用的绿色碳源，但其水解液含有高浓度木糖，因此现有技术中大多数产丁二酸大肠杆菌不能利用稻草秸秆水解液发酵生产丁二酸，约含有50%的纤维素通过粉碎以及碱/氧化法预处理可得到总糖质量为50 g/L，其中木糖占80%以上。

[0008] 在大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶生成草酰乙酸，在此过程中没有ATP的生成，但是在Bacillus subtilis中，磷酸烯醇式丙酮酸是通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶生成草酰乙酸的，在此过程中有ATP的生成，并且Millard等在大肠杆菌中过量表达E. coli ppc 和pck，研究发现过量表达ppc 可以使琥珀酸作为混合酸发酵的主要产物, 且产量较出发菌株提高3.5倍，而过量表达pck对发酵结果没有影响，但在ppc缺陷菌株中，pck的过量表达能够提高琥珀酸的产量。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于提供了一株能高效利用木糖生长并产丁二酸的大肠杆菌基因工程菌株及其构建方法，并利用该菌株厌氧发酵生产丁二酸，达到菌株的构建方法简单方便，构建得到的菌株发酵方法简单可行，易于工业化，产酸能力强的目的，从而大大降低生产成本，提高经济效益。

[0010] 为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案：

[0011] 一、本发明提供一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌 BA204（Escherichia coli BA204），其保藏号登记号为CCTCC NO：M2011207。

[0012] 二、本发明所述的大肠埃希氏菌 BA204的构建方法，其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大肠杆菌为出发菌株，利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，并过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶后，得到能够高效利用木糖生长并产丁二酸大肠埃希氏菌 BA204。重组菌株的代谢途径如图1所示。

[0013] 进一步地，所述的具体构建步骤如下：

[0014] （1） 以缺乏乳酸脱氢酶基因（ldhA），丙酮酸甲酸裂解酶基因（pflB）活性的E.coli NZN111菌株为出发菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）基因，得到同时缺乏ldhA、pflB 和PPC的感受态菌株； （2）纯化扩增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（pck）基因，构建得到过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒；

[0015] （3）将步骤（2）所述的质粒导入步骤（1）得到的感受态菌株，获得阳性转化子；

[0016] （4）利用步骤（3）的阳性转化子过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，恢复其在厌氧条件下代谢木糖的能力，得到可利用木糖代谢产丁二酸基因工程菌大肠埃希氏菌 BA204。

[0017] 三、利用本发明所述的大肠埃希氏菌 BA204发酵生产丁二酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。

[0018] 进一步地，具体步骤如下。

[0019] 将大肠埃希氏菌 BA204按1%(v/v)接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3时，按接种量10%转接至厌氧阶段发酵培养基中厌氧发酵。

[0020] 或者，将大肠埃希氏菌 BA204按1%(v/v)接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3时，经膜分离处理后，按接种量10%转接至厌氧阶段发酵培养基中厌氧发酵。

[0021] 进一步地，所述的膜分离处理采用的膜为微滤膜。

[0022] 其中所述的有氧阶段发酵培养基是现有技术中有氧培养产丁二酸大肠杆菌的常规培养基；所述的厌氧阶段发酵培养基是以木糖为碳源的产丁二酸大肠杆菌用发酵培养基。

[0023] 进一步地，所述的厌氧阶段发酵培养基中的碳源包括木糖、玉米芯水解液、稻草秸秆水解液或者甘蔗渣水解液。

[0024] 本发明的有益效果在于：

[0025] 首先，本发明以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大肠杆菌BA001为出发菌株，利用同源重组技术敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，并过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，使其高效利用木糖产丁二酸。这种通过分子生物学手段提高菌株ATP生物合成能力，使菌株能够利用木糖及含木糖的原料代谢生长，大量提高丁二酸的产量及生产能力的方法未见公开，而这种应用将大大推进丁二酸产业的进步和发展。

[0026] 其次，利用本发明所述的菌株大肠埃希氏菌 BA204的发酵结果表明新构建的重组大肠杆菌大肠埃希氏菌 BA204能够高效利用木糖发酵，并大量积累丁二酸，相比出发菌株，不能利用木糖发酵，没有丁二酸积累的特征，其产酸特征变化巨大。

[0027] 最后，厌氧发酵过程中产大量诸如乙酸等对菌株有毒害作用的副产物，因此考虑两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段进行产酸发酵。也可以选择性地采用膜分离技术，达到分离菌体的目的，再进而用于厌氧发酵。

附图说明

[0028] 图1 Escherichia coli BA204的代谢途径。

[0029] 图2线性DNA片段的电泳鉴定图。

[0030] 图3 同源重组阳性重组子的电泳鉴定图。

[0031] 图4质粒pTrc99a-pck 的双酶切电泳鉴定图。

[0032] 本发明的微生物的分类命名为大肠埃希氏菌 BA204（Escherichia coli BA204），其保藏日期为2011年6月22日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为 CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2011207。

具体实施方式

[0033] 下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。

[0034] 本发明所述的安普霉素抗性基因的来源是：pIJ773，获自南京师范大学邵蔚蓝教授处。

[0035] 本发明所述的能够诱导表达λ重组酶的质粒的来源是：pKD46，购自Introvegen公司。

[0036] 本发明所述的能够诱导产生FLP重组酶的质粒的来源是：pCP20，购自Introvegen公司。

[0037] 本发明所述的Bacillus subtilis基因组的来源是：购自中国典型培养物保藏中心。

[0038] 本发明所述的表达质粒用pTrc99a的来源是：购自Introvegen公司。

[0039] 本发明所述的出发菌株E.coli NZN111的来源是：Biotechnol Bioeng,2001,74:89～95。

[0040] 实施例1

[0041] 本实施例说明利用同源重组技术敲除出发菌株NZN111中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc 基因，得到消除安普霉素抗性菌株的过程。

[0042] 1、利用LB培养基，于37℃、有氧条件下培养大肠杆菌NZN111至OD600=0.4～0.6，制备成电转感受态。

[0043] 2、将质粒pKD46电转入感受态的大肠杆菌NZN111。电击条件为：200 Ω，25 μF，电击电压2.3 kV，电击时间4～5 ms。电击后迅速将菌体加入预冷1 mL的SOC培养基，150 r/min、30℃培养1 h之后涂布于带氨苄青霉素(amp)的LB培养基平板筛选出阳性转化子大肠杆菌NZN111 (pKD46)。

[0044] 3、在LB培养基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于30℃下诱导质粒pKD46表达出λ重组酶，制成电转感受态。

[0045] 4、以两侧带有FRT位点的安普霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，以质粒pIJ773为模板，并设计两端带有PPC同源片段的扩增引物，扩增出线性DNA同源片段，引物序列如下：

[0046] 上游带同源臂引物H1-P1，下划线为同源片段：

[0047] 5’-ATGAACGAACAATATTCCGCATTGCGTAGTAATGTCAGTATGCTCGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’。

[0048] 下游带同源臂引物H2-P2，下划线为同源片段：

[0049] 5’-AGCACGAGGGTTTGCAGAAGAGGAAGATTAGCCGGTATTACGCATACCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’。

[0050] 反应体系：带同源臂的上下游引物(100 pmol/μL)各0.5 μL；模板DNA(100 ng/μL) 0.5 μL；10×buffer 5 μL；dNTPs (10 mM)各1 μL；DMSO(100%) 2.5 μL；Pyrobest DNA聚合酶(2.5 U/μL)1 μL；ddH2O 36/35.5 μL；总体积50 μL。

[0051] 反应条件：94℃，2 min；(94℃ 45 sec；50℃ 45 sec；72℃ 90 sec；10个循环)；(94℃ 45 sec；50℃ 45 sec；72℃ 90 sec；15个循环)；72℃，5 min。

[0052] 线性DNA片段的鉴定如图2。

[0053] 5、电转线性DNA片段至已诱导表达λ重组酶的大肠杆菌NZN111(pKD46)感受态，并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行了PCR鉴定，电泳图如图3所示。

[0054] 6、阳性重组子制成感受态后倒入能诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，于42℃热激表达FLP重组酶后即可消除安普霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的均极为已经敲除抗性的菌株。

[0055] 实施例2

[0056] 本实施例说明构建过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒，能够高效利用木糖发酵，并大量积累丁二酸，得到菌株大肠埃希氏菌 BA204的方法。

[0057] 1、构建过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表达质粒，其过程包括：

[0058] （1）合成带有SacI和XbaI酶切位点的引物，

[0059] 上游引物：5’- CGAGCTCATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3’；

[0060] 下游引物：5’- GCTCTAGAGCATTCCGTCAATTAAAACAAG -3’。

[0061] （2）以Bacillus subtilis 基因组为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为：94℃，5 min；(94℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 100 s，35个循环)；72℃，10 min。纯化扩增出的pck 基因后，表达质粒用pTrc99a分别用SacI和XbaI双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-pck。质粒pTrc99a-pck 的双酶切电泳鉴定如图4所示。

[0062] 2、将质粒pTrc99a-pck导入实施例1得到的E.coli大肠杆菌NZN111的感受态，获得的阳性转化子即为本发明的新构建菌株大肠埃希氏菌 BA204。

[0063] 实施例3

[0064] 本实施例说明大肠埃希氏菌 BA204与出发菌株发酵产酸能力的对比。

[0065] 大肠埃希氏菌 BA204能够高效利用木糖发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。

[0066] 有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。

[0067] 厌氧阶段培养基为：LB+木糖(20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。

[0068] 发酵结果见表1。

[0069] 表1 Escherichia coli BA204 与出发菌株发酵产酸的结果比较

[0070]

[0071] 注:ND表示未检测到。

[0072] 实施例4

[0073] 本实施例说明大肠埃希氏菌 BA204与出发菌株发酵产酸能力的对比。

[0074] 大肠埃希氏菌 BA204能够高效利用玉米芯水解液发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。

[0075] 有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。

[0076] 厌氧阶段培养基为：LB+玉米芯水解液(总糖20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。

[0077] 发酵结果见表2。

[0078] 表2 Escherichia coli BA204 与出发菌株发酵产酸的结果比较

[0079]

[0080] 注:ND表示未检测到。

[0081] 实施例5

[0082] 本实施例说明大肠埃希氏菌 BA204与出发菌株发酵产酸能力的对比。

[0083] 大肠埃希氏菌 BA204能够高效利用稻草秸秆水解液发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。

[0084] 有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。

[0085] 厌氧阶段培养基为：LB+稻草秸秆水解液(总糖20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。

[0086] 发酵结果见表3。

[0087] 表3 Escherichia coli BA204 与出发菌株发酵产酸的结果比较

[0088]

[0089] 注:ND表示未检测到。

[0090] 实施例6

[0091] 本实施例说明大肠埃希氏菌 BA204与出发菌株发酵产酸能力的对比。

[0092] 大肠埃希氏菌 BA204能够高效利用甘蔗渣水解液发酵，并大量积累丁二酸，采用两阶段发酵方式，其特征在于按1% (v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，当有氧培养菌体OD600至0.4～0.6左右用0.3 mM的IPTG诱导至OD600=3左右时，按接种量10%转接至血清瓶中厌氧发酵，发酵48 h。

[0093] 有氧阶段培养基为：LB+ Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)。

[0094] 厌氧阶段培养基为：LB+甘蔗渣水解液(总糖20 g/L)+碱式碳酸镁0.48 g+Amp (氨苄青霉素50 μg/mL)+0.3 mM IPTG。

[0095] 发酵结果见表4。

[0096] 表4 Escherichia coli BA204 与出发菌株发酵产酸的结果比较

[0097]

[0098] 注:ND表示未检测到。