一种碱性果胶酶PL-STR及其基因和应用转让专利
申请号 : CN201110345380.9
文献号 : CN102399764B
文献日 : 2013-04-03
发明人 : 姚斌 , 罗会颖 , 苑鹏 , 孟昆 , 杨培龙 , 王亚茹 , 柏映国 , 石鹏君 , 黄火清 , 袁铁铮
申请人 : 中国农业科学院饲料研究所
摘要 :
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种碱性果胶酶PL-STR及其基因和应用。本发明提供了一种新的碱性果胶酶PL-STR，其具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述碱性果胶酶PL-STR的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明提供的碱性果胶酶PL-STR最适pH为10.0，在pH9.0-12.0之间有70％以上的酶活；具有良好的pH稳定性，在pH7.0-12.0之间稳定。最适温度60℃，在50℃及60℃下稳定，易于工业化发酵生产。作为一种新型的酶制剂，在纺织、造纸、洗涤剂、植物纤维加工、茶和咖啡发酵、油提取、含果胶工业废水处理及生物技术等行业都有应用价值。
权利要求 :
1.一种碱性果胶酶PL-STR，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种碱性果胶酶基因pl-str，其特征在于，编码权利要求1所述的碱性果胶酶。
3.根据权利要求2所述碱性果胶酶基因pl-str，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
4.包含权利要求2或3所述碱性果胶酶基因pl-str的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为pET22b(+)-pl-str，通过将权利要求2所述的果胶酶基因pl-str插入到质粒pET22b(+)上的NcoI和NotI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌重组载体pET22b(+)-pl-str。
6.包含权利要求2或3所述碱性果胶酶基因pl-str的重组菌株。
7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌BL21。
8.一种制备碱性果胶酶PL-STR的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2）培养重组菌株，诱导重组碱性果胶酶PL-STR的表达；以及
3）回收并纯化所表达的碱性果胶酶PL-STR。
9.权利要求1所述碱性果胶酶PL-STR的应用。
说明书 :
一种碱性果胶酶PL-STR及其基因和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种碱性果胶酶PL-STR及其基因和应用。
背景技术
[0002] 果胶酶(pectinases)是能协同分解果胶质的多种酶的总称。广泛存在于植物和各种微生物(细菌、真菌和放线菌)中。由于果胶质的化学结构比较复杂，能够催化其分解的果胶酶也是种类繁多。根据分解糖苷键的反应性质或降解底物的性质可以分为：果胶水解酶(pectin hydrolases)、果胶裂解酶(pectin lyases，PL)、果胶酯酶(pectin esterases，PE)和原果胶酶(Alkorta I，et al.Process Biochem 33：21-28，1998)。按其作用最适pH分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。
[0003] 果胶酶广泛应用于食品工业、饲料工业、造纸工业和纺织工业中。酸性果胶酶作用最适pH在偏酸性范围，主要用于水果榨汁和果汁澄清以及饲料工业，也是目前研究和应用较多的果胶酶。碱性果胶酶(Alkaline pectinase)则是指在碱性范围内具有较高活性的果胶酶，一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶(Polygalacturonate lyase，简称PGL)。其最适pH在8.0-10.0，可以在高pH条件下断开果胶聚合物主链，产寡聚半乳糖醛酸。目前，碱性果胶酶在植物药提取、茶和咖啡发酵、油提取，纺织、造纸、洗涤剂、植物纤维加工、含果胶工业废水处理及生物技术等行业的应用越来越受到重视，所以成为人们研究的热点(Jayani RS，et al.Process Biochemistry 40：2931-2944，2005)，具有不可估量的潜在应用价值。
[0004] 碱性果胶酶多由细菌中的杆菌属和假单胞菌属产生(Hayashi K，et al.Phytochemistry 45：1359-1363，1997)，放 线菌 (Beg QK，et al.J Ind Microbiol Biotechnol24：396-402，2000)和真菌产碱性果胶酶也有报道(Baracat et al.J Ind Microbiol11：139-142，1993)。不同来源的碱性果胶酶生化性质差异较为明显，报道的碱性果胶酶的最适作用的pH在8.5-11.0，最适温度在30-70℃之间(Singh SA，et al.Process Biochem.35：411-417，1999；Pietro AD，et al.FEMS Microbiol Lett.145：295-298，1996；Zhai C，et al.Enzyme and Microbial Technology.33：173-178，2003；Membre and Burlot，Appl Environ Microbiol.60：2017-2022，1994)。一些碱性果胶酶的基因已经被克隆，并且已经大肠杆菌、毕赤酵母等表达系统中进行了表达(Zhai C，et al.Enzyme and Microbial Technology.33：173-178，2003；王芸等，微生物学通报，35(3)：341-345，
2008)。但碱性果胶酶仍然面临着在极端碱性条件下失活或酶活很低、表达量低、生产成本高等问题，至今未得到广泛应用。
2008)。但碱性果胶酶仍然面临着在极端碱性条件下失活或酶活很低、表达量低、生产成本高等问题，至今未得到广泛应用。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种碱性果胶酶PL-STR。
[0006] 本发明的再一目的是提供编码上述碱性果胶酶的基因pl-str。
[0007] 本发明的再一目的是提供包含上述碱性果胶酶基因的重组载体。
[0008] 本发明的再一目的是提供包含上述碱性果胶酶基因的重组菌株。
[0009] 本发明的再一目的是提供一种制备碱性上述果胶酶的方法。
[0010] 本发明的再一目的是提供上述碱性果胶酶的应用。
[0011] 本发明的一种生产上述碱性果胶酶PL-STR的链霉菌Streptomyces sp.S27，于2009年6月29日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.3146，其相关信息记载于申请号为200910087938的专利中，该专利已公开于2010年9月22日。
[0012] 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的新酶。本发明人从Streptomyces sp.S27得到一个新的耐碱、极端碱性条件下有高活性、作用pH广的果胶酶。适合于在纺织、造纸、洗涤剂、植物纤维加工、茶和咖啡发酵、油提取、含果胶工业废水处理及生物技术等行业中使用。
[0013] 从上述菌株中获得了一种碱性果胶酶PL-STR，该酶蛋白含有323个氨基酸和一个终止密码子，没有预测的信号肽序列。理论分子量为33.4kDa。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
[0014] MRRTSARFKL IGAVAATAAA MTLTGVNALS GSAAEAPAPS PLAANSPIGF
[0015] GAGTTGGAGG 60
[0016] PTVTVTNASQ FVQEVQSSGS KVVQVNGTIN LSSMTKVASN KTIVGVGTSG
[0017] KITGSGLNVS 120
[0018] NVSNVIIRNL TFTGSNDDAI NVQYSTKVWI DHNDISNAND GALDIKRASD
[0019] LITVSWNRVH 180
[0020] DHDKTFLLGH SDSNGGEDSG KLRVTYDHNW FDGTNQRHPR
[0021] VRFGNPVHVL NNYYSNIGSY 240
[0022] GVASTENAGVLVEGNYFENV RDPFHRGEGS SDDGGLAARN NHFVNSGSGE
[0023] TGGSVASIPY 300
[0024] GYTADNASSV KSIVTAGAGV GKI 323
[0025] 本发明还提供了编码上述碱性果胶酶的基因。本发明通过PCR的方法分离克隆了这一碱性果胶酶基因pl-str，全长972bp，该酶的全基因序列如SEQ ID NO.2所示：
[0026] atgcgcagga cgagcgcacg cttcaagctg atcggcgccg tggccgccac ggccgccgcc 60[0027] atgaccctca ccggtgtcaa cgcgctcagc ggctcggccg cggaggcgcc ggcgccgagc 120[0028] ccgctggcgg ccaactcgcc catcggcttc ggcgccggca ccaccggcgg cgcgggcgga 180[0029] cccaccgtca ccgtgacgaa cgcgagccag ttcgtccagg aagtgcagag cagcggttcg 240[0030] aaggtcgtcc aggtaaacgg caccatcaac ctcagcagca tgaccaaggt ggcgtccaac 300[0031] aagaccatcg tcggcgtggg cacctccggg aagatcaccg gcagcgggct gaacgtcagc 360[0032] aacgtcagca acgtgatcat ccgcaacctg accttcaccg gctcgaacga cgacgccatc 420[0033] aacgtccagt actccaccaa ggtctggatc gaccacaacg acatctcgaa cgccaacgac 480[0034] ggcgccctcg acatcaagcg cgcctcggac ctcatcacgg tctcctggaa ccgcgtccac 540[0035] gaccacgaca agacgttcct gctcggacac tccgacagca acggcggcga ggacagcggc 600[0036] aagctgcggg tcacctacga ccacaactgg ttcgacggga ccaaccagcg ccacccgcgg 660[0037] gtccgcttcg gcaaccccgt ccacgttctg aacaactact acagcaacat cggcagttac 720[0038] ggcgtggcct ccaccgagaa cgccggcgtg ctggtggagg gcaactactt cgagaacgtc 780[0039] agggacccct tccaccgcgg tgagggctcc tcggacgacg gaggcctggc ggccaggaac 840[0040] aaccacttcg tcaactccgg ctcgggcgag accggcggct ccgtcgcctc catcccctac 900[0041] ggctacaccg ccgacaacgc ctcgtcggtg aagtcgatcg tgaccgcggg cgcgggcgtc 960[0042] gggaagatct ga 972[0043] 将碱性果胶酶基因pl-str的DNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对。发现与来源于Actinosynnemamirym DSM 43827(ACU35796)的果胶裂解酶的一致性为72％，与来源于Pseudonocardia sp.的果胶裂解酶的一致性为71％。说明PL-STR是一种新的碱性果胶酶，为此基因的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因材料。
[0044] 本发明还提供了包含上述果胶酶基因pl-str的重组载体，优选为pET22b(+)-pl-str。将本发明的果胶酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将果胶酶基因插入到质粒pET22b(+)上的NcoI和NotI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌表达质粒pET22b(+)-pl-str。
[0045] 本发明还提供了包含上述果胶酶基因pl-str的重组菌株，优选为重组大肠杆菌BL21(DE3)。
[0046] 本发明还提供了一种制备上述碱性果胶酶PL-STR的方法，包括以下步骤：
[0047] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0048] 2)培养重组菌株，诱导重组果胶酶PL-STR的表达；以及
[0049] 3)回收并纯化所表达的果胶酶PL-STR。
[0050] 其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21(DE3)/pl-str。
[0051] 本发明还提供了上述碱性果胶酶的应用，优选其在水解果胶及在纺织、造纸、洗涤剂、植物纤维加工、茶和咖啡发酵、油提取、含果胶工业废水处理及生物技术等行业的应用。
[0052] 本发明的碱性果胶酶的最适pH为10.0，在pH 9.0-12.0之间有70％以上的酶活；具有良好的pH稳定性，在pH 7.0-12.0之间稳定。最适温度60℃，在50℃及60℃下稳定，易于工业化发酵生产。做为一种新型的酶制剂，在纺织、造纸、洗涤剂、植物纤维加工、茶和咖啡发酵、油提取、含果胶工业废水处理及生物技术等行业都有应用价值。
附图说明
[0053] 图1碱性果胶酶基因pl-str在大肠杆菌中表达的果胶酶的SDS-PAGE分析，1，分子量标准；2纯化的重组果胶酶。
[0054] 图2本发明重组果胶酶PL-STR的最适pH值。
[0055] 图3本发明果胶酶PL-STR的pH稳定性。
[0056] 图4本发明果胶酶PL-STR最适反应温度。
[0057] 图5本发明果胶酶PL-STR的热稳定性。
[0058] 本发明的一种生产上述碱性果胶酶PL-STR的链霉菌Streptomyces sp.S27，于2009年6月29日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.3146，其相关信息记载于申请号为200910087938的专利中，该专利已公开于2010年9月22日。
具体实施方式
[0059] 试验材料和试剂
[0060] 1、菌株及载体：Streptomyces sp.S27由本发明人分离获得，宿主大肠杆菌(Escherichia coli)JM 109购自TaKaRa公 司、(Escherichia coli)BL21(DE3)，载 体pET-22b(+)购自于Novagen公司。
[0061] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。果胶、半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
[0062] 3、培养基：大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。诱导产酶培养基YD(0.5％蛋白胨、0.25％酵母提取物、0.5％果胶、0.5％多聚半乳糖醛酸、
0.1％硫酸镁、0.4％磷酸氢二钾、0.4％磷酸二氢钾，pH7.0)
0.1％硫酸镁、0.4％磷酸氢二钾、0.4％磷酸二氢钾，pH7.0)
[0063] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0064] 实施例1 Streptomyces sp.S27产酶特性分析
[0065] 将Streptomyces sp.S27用LB培养基活化后，按照1％接种量转接到诱导培养基YD中，置于28℃摇床(200转/每分钟)，诱导48小时后，以pH 9.0的0.2％(w/v)多聚半乳糖醛酸为底物，测到明显碱性果胶酶活性。
[0066] 实施例2Streptomyces sp.S27果胶酶编码基因pl-str的克隆
[0067] 利用基因组提取试剂盒提取Streptomyces sp.S27基因组DNA。根据发表的果胶裂解酶的序列比对结果找到两个保守氨基酸序列保守序列GTHV(I)WI(V)DH和HV(A)Y(V)NNYYE，并设计合成了简并引物PF00544F和PF00544R(引物序列见表1)，以Streptomyces sp.S27的总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec，51-46℃30sec(其中每个循环后复性温度下降0.5℃)，72℃1min，10个循环，然后进入第二个循环程序：94℃30sec，46℃30sec，72℃1min，25个循环后；72℃10min，琼脂糖电泳检测，得到约280bp的片段，回收后pGEM-T Easy载体相连并转化大肠杆菌JM109，经检测为阳性后送测序。
[0068] 根据测定序列结果，在NCBI的GenBank中利用BLASTX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行序列比对，初步判断该基因片段是果胶酶基因片段，并进行该片段的相似性研究。该片段长276bp，与Thermomonospora curvata DSM 43183(ACY97999)来源的果胶裂解酶的序列一致性最高为80％。
[0069] 根据测序得到的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物并将它们分别命名为D1，D2，D3(上游特异性引物)和U1，U2，U3(下游特异性引物)，见表1。通过TAIL-PCR得到已知基因片段序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后测序。
[0070] 将简并引物得到的核心片段与经TAIL-PCR得到的侧翼序列进行拼接得到plA全长基因。结果表明，该基编码区全长972bp(SEQ ID NO.1)，编码323个氨基酸(SEQ ID NO.2)和一个终止密码子。没有预测的信号肽序列。酶蛋白与来源于Actinosynnemamirum DSM 43827(ACU35796)的果胶裂解酶的氨基酸序列一致性为72％，与来源于Bacillus sp.TS-47(pdb1VBL)的果胶裂解酶的序列一致性为40％。该编码基因为一个新基因。
[0071] 表1.果胶酶PL-STR TAIL-PCR特异性引物
[0072]
[0073] aY＝C/T，K＝T/G，R＝A/G，N＝A/T/G/C；划线部分为酶切位点。
[0074] 实施例3Streptomyces sp.S27果胶酶基因pl-str的表达
[0075] 果胶酶基因pl-str与pET22b(+)连接并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达。
[0076] 根据测序及序列分析的结果设计引物pl-str-petF和pl-str-petR(引物序列见表1)，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。质粒pET22b(+)和基因片断进行双酶切(NcoI和NotI)后连接形成载体pET22b(+)-pl-str，制备BL21(DE3)感受态细胞，将重组质粒pET22b(+)-pl-str电击转化宿主菌。鉴定阳性重组子，并诱导检测酶活。取含有重组体质粒的BL21(DE3)菌株和含有pET22b(+)空质粒的BL21(DE3)菌株(作对照)，分别接种于3mL LB(加有100μg/mL的氨苄青霉素)培养液中，37℃快速振荡培养过夜。分别取100μL过夜培养液加入含100μg/mL的氨苄青霉素的10mL LB培养液(1％接种量)中，30℃振荡培养约2-3h(OD600达到0.6-0.8)后加入终浓度0.5mmol/L的诱导剂IPTG，20℃180rpm震荡培养48h。培养液12,000rpm离心5min，分别收集培养基上清和沉淀，细胞沉淀用pH9.0的缓冲液重悬，超声破碎后12,000rpm离心10min，收集上清为细胞总蛋白(CTP)。按上述酶活测定方法分别检测培养基上清和CTP酶活。结果重组酶主要细胞总蛋白中。
[0077] 大肠杆菌诱导产生的果胶酶PL-STR经Ni-NTA柱纯化(NEB)，比活为23.0U/mg。纯化PL-STR经SDS-PAGE得到电泳纯的单一条带，分子量约为35kDa，与预测分子量相近(图1，LANE 2)。
[0078] 实施例4果胶酶的酶活性分析
[0079] 酶活性测定：在pH10.0，60℃条件下，取100μL稀释的果胶酶液，加至2mL含0.2％聚半乳糖醛酸和0.05mmol/L CaCl2的甘氨酸一氢氧化钠缓冲液(pH＝10.0)中，反应
15min，用5mL 0.03mol/L的磷酸终止反应，在235nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol不饱和聚半乳糖醛酸的酶量释放-1 -1
出1μmol还原糖的酶量，不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔消光系数为4600M .cm 。
15min，用5mL 0.03mol/L的磷酸终止反应，在235nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol不饱和聚半乳糖醛酸的酶量释放-1 -1
出1μmol还原糖的酶量，不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔消光系数为4600M .cm 。
[0080] 实施例5果胶酶PL-STR的酶学性质
[0081] 1、重组果胶酶PL-STR的最适pH和pH稳定性的测定
[0082] 经纯化的果胶酶PL-STR在不同的pH(pH 8.0-12.0)，60℃下进行酶促反应以测定其最适pH。所用缓冲液为pH 7.0-8.5的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液和pH 9.0-12.0的0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液。纯化的果胶酶PL-STR在不同pH的缓冲体系，60℃下测定的pH适性结果(图2)表明：PL-STR的最适作用pH为10.0，在pH 12.0时仍有70％以上的酶活。
[0083] 将酶液在不同pH值(pH 7.0-12.0)的缓冲液中于37℃下处理1h，再测定酶活性以研究酶的pH稳定性。结果表明(图3)，PL-STR在pH范围为7.0-10.0间都很稳定，保持80％以上的酶活。在pH 11.0-12.0，保持60％以上的酶活。
[0084] 2、重组果胶酶PL-STR的最适温度及热稳定性的测定
[0085] 最适温度的测定在pH 10.0的0.1mol/L的甘氨酸-NaOH缓冲液体系及不同的温度(0～80℃)下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果(图4)表明，PL-STR的最适作用温度60℃。
[0086] 果胶酶在50℃和60℃下分别保温不同时间测定相对酶活力，绘制酶的热稳定性曲线。在50℃下非常稳定，60℃下保温20min，酶活没有损失，保温30min后，酶活损失40％(图5)。
[0087] 3、不同金属离子化学试剂对PL-STR酶活的影响
[0088] 在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1和5mmol/L。在60℃、pH10.0条件下测定酶活性。结果(表3+ 3+ 2+
2)表明，1mM和5mM的Cr 、Fe 和EDTA以及5mM的Pb 几乎完全抑制PL-STR的活性。5mM+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+
的Li，Co ，Ni ，Cu ，Mg ，和Zn 强烈抑制PL-STR的活性。Mn 、SDS和β-巯基乙醇对果胶酶PL-STR有明显的激活作用，其它离子对酶活没有影响或有一定的激活作用。
2)表明，1mM和5mM的Cr 、Fe 和EDTA以及5mM的Pb 几乎完全抑制PL-STR的活性。5mM+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+
的Li，Co ，Ni ，Cu ，Mg ，和Zn 强烈抑制PL-STR的活性。Mn 、SDS和β-巯基乙醇对果胶酶PL-STR有明显的激活作用，其它离子对酶活没有影响或有一定的激活作用。
[0089] 4、重组果胶酶PL-STR的Km值测定
[0090] 用不同浓度(1-20mg/mL)的多聚半乳糖醛酸(PGA)为底物，在pH 10.0的甘氨酸-NaOH反应体系中，60℃下测定酶活性，计算出其在60℃下的Km值。经测定，此果胶酶在60℃下以多聚半乳糖醛酸为底物的表观Km值为7.9mg/ml，最大反应速度Vmax为17.1μmol/min·mg。
[0091] 表2.不同的金属离子及化学试剂对果胶酶PL-STR的活性影响
[0092]
[0094] 实施例6果胶酶PL-STR的底物特异性
[0095] 分别以多聚半乳糖醛酸和酯化程度分别为34％，70％和85％的柑橘果胶为底物测定果胶酶活力。以PL-STR对多聚半乳糖醛酸的活力为100％，则以34％，70％和85％的柑橘果胶为底物测定果胶酶相对活力分别为43.9％，22.9％和19.3％。