一种提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法转让专利
申请号 : CN201110371080.8
文献号 : CN102399771B
文献日 : 2013-08-28
发明人 : 高红亮 , 常忠义 , 孟珺 , 张琳 , 吴琳琳 , 郭颖 , 步国建 , 韦妮
申请人 : 华东师范大学 , 上海东圣食品有限公司
摘要 :
本发明公开了一种在谷氨酰胺转胺酶分离纯化过程中可以提高其热稳定性的方法。首先在谷氨酰胺转胺酶发酵液中添加盐和糖类或其衍生物，用乙醇对发酵液进行沉淀；经离心、弃上清液，取得沉淀物；再加入氨基酸，均匀混合；经真空干燥，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂。本发明操作简便，对谷氨酰胺转胺酶的耐热性有大幅度提高。
权利要求 :
1.一种提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法，其特征在于，所述方法在谷氨酰胺转胺酶发酵液中添加盐、糖类衍生物，用乙醇对所述发酵液进行沉淀得到沉淀物；向所述沉淀物中加入氨基酸，均匀混合；经真空干燥，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂；其中，所述盐是氯化钠或谷氨酸钠；所述糖类衍生物是麦芽糖醇、木糖醇或乳糖醇；所述氨基酸是甘氨酸或半胱氨酸；所述盐的添加量为2%～10%w/v，所述糖类衍生物的添加量为0.5%～5%w/v，所述氨基酸的添加量为与所述沉淀物的质量相同；所述真空干燥在25℃-50℃真空环境下进行。
2.根据权利要求1所述的提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法，其特征在于，所述的发酵液中谷氨酰胺转胺酶的酶活为2～50u/ml。
3.根据权利要求1所述的提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法，其特征在于，所述盐的添加量为4%～6%w/v。
4.根据权利要求1所述的提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法，其特征在于，所述糖类衍生物的添加量为1%～3%w/v。
5.根据权利要求1所述的提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法，其特征在于，所述乙醇的用量与加入盐、糖类衍生物后发酵液的体积相同。
6.根据权利要求1所述的提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法，其特征在于，所述用乙醇进行沉淀的方法为向所述发酵液加入乙醇后，在0℃～4℃静置。
7.根据权利要求1所述的提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法，其特征在于，所述沉淀物通过离心、弃上清液后得到。
8.根据权利要求1所述的提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法，其特征在于，所述真空干燥的温度为35℃-40℃。
说明书 :
一种提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种提高酶制剂热稳定性的方法，具体地说是一种提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法。
背景技术
[0002] 谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase，简称TGase或TG)，由331个氨基组成的分子量约38000的具有活性中心的单体蛋白质酰基转移酶。谷氨酰胺转胺酶可以催化蛋白质之间发生交联，并产生以下作用：使蛋白质改性，改性后的蛋白质其塑性、持水性、水溶性和功能性得到改善；保护了食品中的赖氨酸免受各种化学反应的破坏；可用于包埋脂类或脂溶性物质；可以形成耐热、耐水性的膜；在形成凝胶过程中不需要热处理；通过将包含各种必需氨基酸的蛋白质之间交联，提高蛋白质的营养价值。目前，谷氨酰胺转胺酶已应用于肉制品、鱼肉制品、乳制品、植物蛋白制品、焙烤制品、固定化酶、可食性包装中。微生物产生的2+
谷氨酰胺转胺酶有许多优点：pH范围广，对Ca 无依赖性，被誉为“21 世纪超级粘合剂”。 [0003] 酶蛋白所具有的特异活性构象是分子中许多基团相互作用的结果。当环境改变或一些基团的相互作用被减弱（或完全消失）时，就会引起一大部分结构的很快崩溃，从一种有序的构象过渡到一种杂乱的构象。酶的空间结构一旦遭到破坏，活性中心的构象也随之发生改变，酶就会失活。在酶的生产销售过程中，受热失活就是酶的空间结构的解体过程。
现有工业生产中都是用冷冻干燥的方法生产谷氨酰胺转胺酶，以避免高温造成的酶失活问题。但是，这一生产方法成本高，耗时长，且销售和应用都需在低温下进行，给谷氨酰胺转胺酶的工业化应用造成很大不便。
谷氨酰胺转胺酶有许多优点：pH范围广，对Ca 无依赖性，被誉为“21 世纪超级粘合剂”。 [0003] 酶蛋白所具有的特异活性构象是分子中许多基团相互作用的结果。当环境改变或一些基团的相互作用被减弱（或完全消失）时，就会引起一大部分结构的很快崩溃，从一种有序的构象过渡到一种杂乱的构象。酶的空间结构一旦遭到破坏，活性中心的构象也随之发生改变，酶就会失活。在酶的生产销售过程中，受热失活就是酶的空间结构的解体过程。
现有工业生产中都是用冷冻干燥的方法生产谷氨酰胺转胺酶，以避免高温造成的酶失活问题。但是，这一生产方法成本高，耗时长，且销售和应用都需在低温下进行，给谷氨酰胺转胺酶的工业化应用造成很大不便。
[0004] 本发明解决了现有技术中谷氨酰胺转胺酶的生产方法中所存在的成本高、耗时长、不利于谷氨酰胺转胺酶的工业化应用等问题，提出了一种提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法，通过添加盐、糖类或其衍生物和氨基酸提高谷氨酰胺转胺酶的热稳定性，本发明方法对谷氨酰胺转胺酶的耐热性有大幅度提高，可使得到的酶制剂在生产与销售过程中减少酶活损失，提高收率，且操作简便，适合于现有企业工业化生产。
发明内容
[0005] 本发明提出了一种提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法，在谷氨酰胺转胺酶发酵液中添加盐、糖类或糖类的衍生物，用乙醇对所述发酵液进行沉淀得到沉淀物；向所述沉淀物中加入氨基酸，均匀混合；经真空干燥，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂。
[0006] 其中，所述的发酵液中谷氨酰胺转胺酶的酶活为2~50u/ml。
[0007] 其中，所述的盐包括氯化钠、谷氨酸钠；所述的糖类或糖类的衍生物包括麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇；所述的氨基酸包括甘氨酸、半胱氨酸。
[0008] 其中，所述的盐的添加量为2%~10%w/v，优选添加量为4%~6%w/v。
[0009] 其中，所述的糖类或糖类的衍生物的添加量为0.5%~5%w/v，优选添加量为1%~3%w/v。
[0010] 其中，所述的氨基酸的添加量为与所述沉淀物的质量相同。
[0011] 其中，所述乙醇的用量与加入盐、糖类或糖类的衍生物后发酵液的体积相同。 [0012] 其中，所述用乙醇进行沉淀的方法为向所述发酵液加入乙醇后，在0℃~4℃静置。 [0013] 其中，所述沉淀物通过离心、弃上清液后得到。
[0014] 其中，所述真空干燥在25℃-50℃真空环境下进行，优选温度为35℃-40℃。 [0015] 本发明的目的是提供一种提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法，可以大幅度提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性，在生产过程中提高收率，减少生产和销售的过程中酶的失活。 [0016] 本发明提供一种在谷氨酰胺转胺酶分离纯化过程中可以提高其热稳定性的方法。首先在茂原轮链丝菌（Streptoverticillium mobaraense）或其他产谷氨酰胺转胺酶微生物的发酵液中添加2%~10%的盐（w/v）和0.5%~5%（w/v）的糖类或糖类的衍生物；添加体积比为1:1的乙醇对酶进行沉淀，在0℃-4℃低温静置5~10分钟；离心，弃上清液，取得沉淀物后称重，加入等质量的氨基酸，混合均匀；最后25℃-50℃真空干燥4小时，得到谷氨酰胺转胺酶酶制剂。
[0017] 本发明的发酵液中的谷氨酰胺转胺酶酶活为2~50u/ml；氯化钠的添加量为2%~10%（w/v），优选4%~6%（w/v）；麦芽糖醇添加量应为0.5%~5%（w/v），优选1%~3%（w/v）；
真空干燥优选在35℃-40℃下进行。
真空干燥优选在35℃-40℃下进行。
[0018] 本发明提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法，其创新点在于在酶的发酵液中加入盐、糖类或糖类的衍生物和氨基酸。这三种添加剂可以稳定酶蛋白的空间构象，增强其热稳定性。
[0019] 本发明中添加的盐、糖类或糖类的衍生物和氨基酸可以提高酶蛋白的热稳定性。盐增加了酶蛋白的变性温度，本发明中所适用的盐包括氯化钠、谷氨酸钠等。加入盐后，此时蛋白质分子所固有的构象稳定性并没有增加，但介质中这种添加剂的存在，不利于蛋白质分子的展开，从而阻止了酶蛋白的受热变性，提高了其热稳定性。由于糖类或糖类的衍生物含有很多羟基，可以通过形成氢键，使之与酶蛋白形成蛋白-高分子电解质，固定酶的活性构象。本发明中所适用的糖类或糖类的衍生物包括麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇等。氨基酸类在分子中同时具有酸性和碱性官能团，在水溶液中为强电解质，与糖醇类有相似的作用，本发明中所适用的氨基酸包括甘氨酸、半胱氨酸等。
[0020] 本发明方法简单有效，可大幅度提高谷氨酰胺转胺酶的热稳定性。使在生产过程中可用真空干燥替代冷冻干燥生产谷氨酰胺转胺酶，降低成本，减少耗时，提高生产效率，同时使谷氨酰胺转胺酶的销售和应用过程可在室温下进行，不受低温限制。 具体实施方式
[0021] 结合以下具体实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
[0022] 本发明提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性的方法，具体步骤如下：
[0023] 步 骤 a：在 谷 氨 酰 胺 转 胺 酶 酶 活 为2~50u/ml 的 茂 原 轮 链 丝 菌（Streptoverticillium mobaraense）或其他产谷氨酰胺转胺酶微生物的发酵液中加入2%~10%的盐（w/v）和0.5%~5%（w/v）的糖类或糖类的衍生物。搅拌均匀，使所添加的单价盐、糖类或糖类的衍生物完全溶解，静置30分钟。优选地，盐加入量为4%~6%（w/v），糖类或糖类的衍生物加入量为1%~3%（w/v）。本发明中的盐可以是氯化钠、谷氨酸钠等，糖类或糖类的衍生物可以是麦芽糖醇、木糖醇、乳糖醇等。
[0024] 步骤b：向上述发酵液中添加等体积的乙醇对酶进行沉淀，在0℃-4℃低温静置5~10分钟，然后离心，弃上清液，得到沉淀物，称重。
[0025] 步骤c：在沉淀物中加入等质量的氨基酸，搅拌均匀，静置30分钟。本发明中的氨基酸可以是甘氨酸、半胱氨酸等。
[0026] 步骤d：放入真空干燥箱，于37℃下干燥4小时。
[0027] 通过标准氧肟酸盐测定法对本发明方法制备得到的酶制剂进行酶活检测，其步骤为：分别取2ml试剂A液和试剂B液加入磨口试管中，37℃保温15分钟，加入0.2ml酶液，反应10分钟，加A液的试管加2mlB液终止反应，加入B液的试管加入2ml A液，过滤，以第二支试管反应液作为空白对照，525nm处测定OD值。用L-谷氨酸-g-单氧肟酸做标准曲线。
[0028] 试剂A（反应液）：含0.2 M Tris-HCl、0.1M盐酸羟胺、0.01 M还原型谷胱甘肽、0.03 M Na-CBZ- Gln- Gly，pH 6.0。
[0029] 试剂B（终止液）：以下三种成分按体积比1：1：1的比例混合。3 mol/L HCl、12 % 三氯乙酸（W/V）、5 %三氯化铁 (W/V)。
[0030] 实施例1
[0031] 取酶活为25u/ml的茂原轮链丝菌（Streptoverticillium mobaraense）所产生的谷氨酰胺转胺酶发酵液200ml，添加体积比为1:1的乙醇对酶进行沉淀，在4℃低温静置10分钟。离心，弃上清液，取沉淀物。将沉淀物放入真空干燥箱，37℃，干燥4小时，所得酶粉为谷氨酰胺转胺酶的酶制剂。测定其酶活，计算收率。
[0032] 实施例2
[0033] 取酶活为25u/ml的茂原轮链丝菌（Streptoverticillium mobaraense）发酵液200ml，加入8g氯化钠（4%w/v）和2g麦芽糖醇（1%w/v），搅拌直至完全溶解，静置30分钟。
添加体积比为1:1的乙醇对酶进行沉淀，在4℃低温静置10分钟。离心，弃上清液，取沉淀物。将沉淀物放入真空干燥箱，37℃，干燥4小时，所得酶粉为谷氨酰胺转胺酶的酶制剂。测定其酶活，计算收率。
添加体积比为1:1的乙醇对酶进行沉淀，在4℃低温静置10分钟。离心，弃上清液，取沉淀物。将沉淀物放入真空干燥箱，37℃，干燥4小时，所得酶粉为谷氨酰胺转胺酶的酶制剂。测定其酶活，计算收率。
[0034] 实施例3
[0035] 取酶活为25u/ml的茂原轮链丝菌（Streptoverticillium mobaraense）发酵液200ml，加入12g氯化钠（6%w/v）和6g麦芽糖醇（3%w/v），搅拌直至完全溶解，静置30分钟。
添加体积比为1:1的乙醇对酶进行沉淀，在4℃低温静置10分钟。离心，弃上清液，取沉淀物。将沉淀物放入真空干燥箱，37℃，干燥4小时，所得酶粉为谷氨酰胺转胺酶的酶制剂。测定其酶活，计算收率。
添加体积比为1:1的乙醇对酶进行沉淀，在4℃低温静置10分钟。离心，弃上清液，取沉淀物。将沉淀物放入真空干燥箱，37℃，干燥4小时，所得酶粉为谷氨酰胺转胺酶的酶制剂。测定其酶活，计算收率。
[0036] 实施例4
[0037] 取酶活为25u/ml的茂原轮链丝菌（Streptoverticillium mobaraense）发酵液200ml，加入8g氯化钠（4%w/v）和2g麦芽糖醇（1%w/v），搅拌直至完全溶解，静置30分钟。
添加体积比为1:1的乙醇对酶进行沉淀，在4℃低温静置10分钟。离心，弃上清液，取沉淀物，称重为5g。在沉淀物中加入5g甘氨酸，搅拌均匀，静置30分钟。放入真空干燥箱，37℃，
添加体积比为1:1的乙醇对酶进行沉淀，在4℃低温静置10分钟。离心，弃上清液，取沉淀物，称重为5g。在沉淀物中加入5g甘氨酸，搅拌均匀，静置30分钟。放入真空干燥箱，37℃，