一种金黄色葡萄球菌菌株PCR检测试剂盒

摘要

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌菌株PCR检测试剂盒。本发明的技术方案为提供一种金黄色葡萄球菌PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。本试剂盒具有灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点。

权利要求

1.一种金黄色葡萄球菌PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括10×buffer缓冲液、dNTP、Mg离子、引物和荧光探针，所述引物分为上游引物和下游引物；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

2.按权利要求1所述的金黄色葡萄球菌PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括taq酶、UNG酶、阳性对照、阴性对照。

3.按权利要求1所述的金黄色葡萄球菌PCR检测试剂盒，其特征在于，引入了一个人工构建的neo内参照系统用于避免检测结果假阴性，所述内参照系统包括上游引物核苷酸序列：SEQ ID NO.4；下游引物核苷酸序列：SEQ ID NO.5；探针核苷酸序列：SEQ ID NO.6。

4.按权利要求1所述的金黄色葡萄球菌PCR检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针的

5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。

说明书

一种金黄色葡萄球菌菌株PCR检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌菌株PCR检测试剂盒。

背景技术

[0002] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA，简称金葡)是医学上重要的致病菌，其分布广泛，感染类型多样，耐药率高，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin resistant staphylococcus aureus，MRSA)的感染呈多重耐药，病死率较高，已成为临床抗感染治疗的难点。

[0003] 金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至严重到败血症、脓毒症等全身感染。

[0004] 目前临床应用的金黄色葡萄球菌的检测方法有：常规涂片镜检法、培养法、免疫学测定、仪器自动化分析鉴定系统等方法，但是这些方法都存在一定的缺陷：

[0005] 常规涂片镜检是是最基本的细菌学检查方法，但是敏感性低，特异性差；

[0006] 培养法是目前临床上发现传染源的主要途径和手段，是金黄色葡萄球菌诊断和治疗方案的重要依据，目前仍然以培养法为“金标准”，但是非常耗时，不能实现快速的目的；

[0007] 免疫学测定方法对培养基的含盐量有很高的要求，若含盐量比较高，那么蛋白的合成会受到抑制，而出现假阴性；另外，粗糙型的葡萄球菌和酵母菌偶尔也可引起非特异反应，同时某些含有血浆蛋白结合因子的链球菌和其它个别菌类(例如肠杆菌属的部分菌群)可以非特异地使乳胶颗粒凝集，而出现假阳性。

[0008] 仪器自动化分析鉴定系统，近年来，相关的革兰氏阳性球菌快速鉴定系统不断面市，如Biolog微生物自动分析系统、API 20C、ATB 32C、VITEK YBC和API Candid系统等，但这些快速鉴定系统大多数是应用于临床革兰氏阳性球菌的鉴定。

[0009] 常规PCR法虽然有简便、快速、灵敏，的优势，但是又不能精确定量和PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题。

发明内容

[0010] 本发明目的是采用聚合酶链式反应及分子信标荧光探针技术对金黄色葡萄球菌基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断金黄色葡萄球菌的存在，对金黄色葡萄球菌感染的辅助诊断。

[0011] 本发明的技术方案为提供一种金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物和下游引物；

[0012] 所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0013] 优选的，所述试剂盒还包括tap酶、UNG酶、阳性对照、阴性对照。

[0014] 优选的，所述试剂盒引入了一个人工构建的neo内参照系统用于避免检测结果假阴性，所述内参照系统包括上游引物核苷酸序列：SEQ ID NO.4；下游引物核苷酸序列：SEQ ID NO.5；探针核苷酸序列：SEQ ID NO.6。

[0015] 优选的，所述荧光探针的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。

[0016] 本发明的有益效果为利用金黄色葡萄球菌基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断金黄色葡萄球菌的存在。本试剂盒具有灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点。使用了大肠杆菌新霉素基因作为内参照基因，它在金黄色葡萄球菌基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。

附图说明

[0017] 图1：金黄色葡萄球菌nuc基因灵敏度检测结果图；

[0018] 图2：金黄色葡萄球菌nuc基因特异性结果图。

具体实施方式

[0019] 本发明采用聚合酶链式反应(PCR)及分子信标荧光探针(MoleculA.r beacon)技术对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA，简称金葡)基因中高保守特异性核酸序列(nuc基因)进行扩增检测，从而判断金黄色葡萄球菌的存在。

[0020] 从而指导临床医生对金黄色葡萄球菌感染的病人用药，帮助预后判断。

[0021] 目的基因nuc的检测：因为nuc基因是金黄色葡萄球菌特有的耐热核酸酶基因，所以对nuc基因的检测可以区分金黄色葡萄球菌(SA)和凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)的。

[0022] 所述nuc基因序列如SEQ ID NO.7所示。

[0023] 内参照原理：试剂盒设置了内参照neo基因，即大肠杆菌新霉素基因。它在金葡基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。当内参照结果为阳时，表示PCR反应体系以及操作正常；因此当目的基因nuc结果为阴时，内参照结果为阳就显得十分重要了。但当目的基因nuc结果为阳时，内参照的扩增曲线较目的基因阴性时内参照的扩增曲线要推迟，或是内参照结果为阴都是正常的。但是目的基因nuc和内参照基因neo结果都为阴时，该试验视为无效，需再重复。

[0024] 阳性对照原理：每次试验都需同时做阳性对照。阳性对照结果为阳，表明对靶基因的检测系统是正常的；而当结果为阴时，表明该次实验无效，需重复。

[0025] 阴性对照原理：为证明有否污染存在，每次试验也需同时做阴性对照。阴性对照结果为阴，表明本次试验无污染；如结果为阳，则表明该次实验无效，需重复。

[0026] 实施例1本发明试剂盒的组成

[0027] 主要原材料来源及制备方法：

[0028] Tris：分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，含量99.7％，红外合格，pH(5％水)10.3-10.9，水份0.3％，熔点167-171℃，吸收系统合格，杂质最高含量合格。

[0029] MgCl2：分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，含量不少于99％，水溶液反应合格，杂质最高含量合格。(MgCl2极易吸潮，启用新瓶后放于干燥器下保存)。

[0030] EDTA：分析纯，有合格资质的供应厂商的产品，为白色结晶状粉末，溶于水，溶液呈酸性，难溶于醇，含量不少于99.5％，水溶液反应合格，络合力试验合格，杂质最高含量合格。

[0031] HCl：分析纯，北京化学试剂厂产品或有合格资质的供应厂商的产品。

[0032] 纯化水：购买乐百氏桶装纯净水，然后经Millipore公司的Milli-QBiocel型纯水机处理，电阻率16-18MΩ。

[0033] 引物和探针：本发明所应用的引物、探针均委托Sigma和Biosearch公司合成，并经Sigma质检合格(含质谱鉴定)；

[0034] 其中nuc基因最优引物、探针序列组合如下：

[0035] 上游引物A(SEQ ID NO.1)：5’-AAAACACCCCTATCAAATGATAATC-3’；

[0036] 下游引物A(SEQ ID NO.2)：5’-GAAGAACTCCGCGACGCA-3’；

[0037] 荧光探针A(SEQ ID NO.3)：

[0038] 5’-FAM-CATTATCAATGGATAGGGGCTATTTTAATAAAATTCG-BHQ-3’。

[0039] 其中neo内参照系统的引物、探针序列组合如下：

[0040] 上游引物(SEQ ID NO.4)：5’-GACTAAACTGGCTGACGG-3’；

[0041] 下游引物B(SEQ ID NO.5)：5’-GTATTTCGTCTCGCTCAG-3’；

[0042] 荧光探针B(SEQ ID NO.6)：

[0043] 5’-TEXrd-ATGCCTCTTCCGA-BHQ-3’。

[0044] 用于PCR反应的引物，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5可视为合格引物。-20℃保存。

[0045] nuc探针：在寡核苷酸5’端标记FAM，3’端标记BHQ，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5，在FAM荧光素的激发波长494nm处有吸收峰，-20℃保存。

[0046] neo探针：在寡核苷酸5’端标记TEXrd，3’端标记BHQ，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5，在TEXrd荧光素的激发波长610nm处有吸收峰。-20℃保存。

[0047] dNTPs：dATP、dCTP、dGTP、dUTP购自上海宏谊公司，或其他有合格资质的供应商，并经出厂检测合格；按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。根据供应商质量标准为HPLC纯，无DNase和RNase污染。-20℃保存。

[0048] Taq酶：本产品在研制开发及生产过程中，所应用的Taq酶购自大连TaKaRa公司，或其他有合格资质的供应商。浓度5U/μl，含10×PCRBuffer、25mmol/LMgCl2，根据供应商质量标准：本品具有DNA聚合酶活性，无3’→5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃保温1小时后仍保持50％活性。-20℃保存。

[0049] UNG酶：本产品在研制开发及生产过程中，所应用的UNG酶购自Promega公司或其他有合格资质的供应商，按照本公司相应的质量标准进行检测合格后使用。浓度＞1U/μl，根据供应商质量标准：本品具有尿嘧啶糖基化酶活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性，3
1UUNG在50℃2min能降解至少10copies含dU的模板，使其不能产生扩增产物。-20℃保存。

[0050] 基础试剂配制：

[0051] 10×浓缩清洗液A：配制0.2N NaOH，5mL/管分装；

[0052] 10×浓缩清洗液B：配制10×TE缓冲液(pH8.0)，10mL/管分装；

[0053] 提取固形物：取直径为0.5mm和1.0mm两种玻璃珠，按质量配比约为：0.5mm∶1.0mm＝9∶1比例配制出提取固形物，每管约0.15g分装。

[0054] 10mmol/L Tris-HCl溶液的配制：称取0.12114g的Tris，加入已含60mL蒸馏水的100mL烧杯中，振摇使之充分溶解，移入100mL的容量瓶中，用10mL蒸馏水洗涤烧杯3次并移入容量瓶中，用HCl调pH值为8.0，最后用蒸馏水定容到100mL，翻转容量瓶使之充分混匀。移入试剂瓶并标记名称、浓度、配置时间。

[0055] dNTPs的配制如表1：

[0056] 表1

[0057]名称 dATP dCTP dGTP dUTP
体积 300μL 300μL 300μL 450μL

[0058] 从冰柜中取出所需试剂，平衡至室温。按上述比例加入所有试剂后用磁力搅拌器混匀。

[0059] 引物和探针的稀释：

[0060] 取出合成的引物和探针，在高速台式冷冻离心机上离心8000r/min，3min。取出待测引物和探针，计算并加超纯水稀释引物和探针到100μM，在涡旋混匀器上混合均匀，取出后在手掌型离心机离心。3

[0061] 内参照：组成为10copies/mL含内参照基因质粒；领用经分光光度计精确定量的3
含内参照基因的高浓度质粒，用1×TE作10倍梯度稀释至10copies/mL作为内参照，1mL/管分装。
6 7

[0062] 阳性对照：组成为10copies/mL-10copies/mL含目的片段质粒；领用经紫外分光光度计精确定量的含目的片段的高浓度质粒，用预先配制好的1×TE作10倍梯度稀释至6 7
10copies/mL-10copies/mL作为阳性对照，1mL/管分装。阳性对照品为含目的基因的质粒，目的基因来自美国菌种保藏中心(ATCC)的原始菌株。

[0063] 阴性对照：组成为1×清洗液B，将配制好的10×清洗液B用纯化水作10倍稀释，制得1×清洗液B作为阴性对照，1mL/管分装。

[0064] SA-PCR反应液配方如表2(44.3μl)：

[0065] 表2

[0066]

[0067] 本试剂盒组成部分如表3：

[0068] 表3

[0069]组成 规格和数量
10×浓缩清洗液A 5ml×1瓶
10×浓缩清洗液B 20ml×1瓶
提取固形物 48管
nuc-PCR反应液 1.1ml×2管
Taq DNA Polymerase(5U/μl) 50μl×1管
Uracil N-Glycosylase(UNG)(1U/μl) 20μl×1管
内参照 1ml×1管
阴性对照 1ml×1管
阳性对照(MRSA) 1ml×1管

[0070] 实施例2本发明试剂盒的使用

[0071] 一、试剂准备：

[0072] 1.取出10×浓缩清洗液A和10×浓缩清洗液B，用无菌纯水按1∶9(体积比)进行稀释，放于4℃冰箱中备用。

[0073] 2.将Taq DNA Polymerase和Uracil N-Glycosylase(UNG)瞬时离心后，放于-20℃冰箱中备用。

[0074] 3.确定需要进行的反应管数n(标本数+阴性、阳性对照)后，取出SA-PCR反应液，将n×44.3μl SA-PCR反应液/nuc-PCR反应液，n×0.5μlTaq DNA Polymerase和n×0.2μl Uracil N-Glycosylase(UNG)加入一个离心管中并振荡混匀，瞬时离心后，向每一个PCR反应管中分装45μl，盖上管盖后转移到加样区，避光放于4℃冰箱备用。

[0075] 4.将提取固形物及阳性对照、阴性对照、内参照转移到样品处理区，放于4℃冰箱中备用。

[0076] 二、样本处理：

[0077] 1.适用标本类型：痰液、尿液、胸腹水、脑脊液、血液、分泌物等。

[0078] 2.若样本初始浓度较低，建议可以先对初始样本进行增菌后检测。

[0079] 3.标本采集：

[0080] 3.1痰液：清晨从肺深部咳出的痰液，用无菌玻璃管收集1-3ml，密闭送检。取200μL至1.5mL离心管加入4倍体积的1×清洗液A，摇匀，室温放置15-30min待液化；将液化后的标本，13000r/min离心5min；去上清，沉淀加清洗液B 1ml混匀，13000r/min离心
5min；重复1.3一次；去上清，沉淀中加入100μl清洗液B备用。

[0081] 3.2尿液：用无菌玻璃管收集中段尿1-3ml，密闭送检。

[0082] 2.1摇匀尿液，取1.0ml至1.5ml离心管，13000r/min离心5min；去上清，沉淀(沉淀如不明显，可再加入尿液样本重复前步骤)加清洗液B1ml混匀，13000r/min离心5min；去上清，沉淀中加入100μl清洗液B备用。

[0083] 3.3血液：发热初期1～2天内或高峰期采血。血量1～3ml注入血培养瓶中增菌后送检(血标本必须在24小时内进行标本制备)；从血培养瓶中取100μl至1.5ml离心管中加入1ml清洗液A，颠倒管子混匀后室温静置5min，13000r/min离心5min；去上清，沉淀加1ml清洗液B混匀，13000r/min离心5min；重复3.2两遍；去上清，沉淀中加入100μl清洗液B备用。

[0084] 3.4胸腹水、脑脊液：用无菌管采集。摇匀，取1.0ml至1.5ml离心管，13000r/min离心5min；去上清，沉淀加清洗液B1ml混匀，13000r/min离心5min；去上清，沉淀中加入100μl清洗液B备用。

[0085] 3.5分泌物：无菌涤纶拭子采集后放回管中送检(标本在室温下保存不应超过1天，在4～8℃保存不超过6天)。向拭子管中加入1.0ml清洗液B，将标本管用震荡器高速震荡2min制成标本悬浮液；取出全部标本悬浮液放入1.5ml离心管中，13000r/min离心5min；去上清，沉淀加1ml清洗液B混匀，13000r/min离心5min；去上清，沉淀中加入100μl清洗液B备用。

[0086] 三、样本DNA提取：

[0087] 1、向上述样本处理中处理好的各样本管中分别加入1管提取固形物(轻弹管底尽量将固形物倒净)，用强力震荡器(如美国Vortex-Genie)高速涡旋震荡5min，瞬时离心，加入20μl内参照。

[0088] 2、阴性对照样本制备：取出阴性对照，8000r/min离心数秒，吸取100μl至1.5ml灭菌离心管中，加入20μl内参照。

[0089] 阳性对照样本制备：(同阴性对照)

[0090] 3、将待测样本、阳性对照样本和阴性对照样本瞬时离心后95℃干浴2min，即刻冰浴2-5min后13000r/min离心1min；上清液用于PCR扩增。

[0091] 四、PCR反应

[0092] 1、加样(样品处理区或者加样区)

[0093] 向准备好的PCR反应液管中分别加入5μl上清液(注意避免吸入固形提取物)待测样品，阴性对照样品，阳性对照样品，盖紧管盖后瞬时低速离心。(注意PCR反应管管壁上不可沾有反应液，不可有气泡)

[0094] 2、PCR扩增(检测区)

[0095] 将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按表4循环参数进行扩增反应。

[0096] 表4

[0097]

[0098] SA-PCR反应体系中包括：SA检测和内参照；利用仪器配套软件进行自动分析，得到各样品Ct值如表5。

[0099] 表6

[0100]

[0101] 五、检验结果的分析

[0102] 1.结果分析条件设定

[0103] 1.1ABI 7500基线(baseline放定：取2个到样品阈值(threshold)前3个循环值作为基线。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，即Ct阴性对照＝30或者“Undet.”为准。

[0104] 1.2STRATAGENE Mx3000P基线设定：选择“适合基线(Adaptive baseline)”设定时的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，即Ct阴性对照＝30或者“No Ct”为准。

[0105] 2.质控标准

[0106] 本试剂盒阴、阳性对照应同时满足以下条件：

[0107] 2.1阴性质控：SA-PCR体系中：金葡(SA-FAM)Ct值＝30或“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)，内参照(Texas Red)Ct值＜30，且有较好的对数增长曲线。

[0108] 2.2阳性质控：SA-PCR体系中：金葡(SA-FAM)Ct值≤23，且有较好的对数增长曲线；内参照(Texas Red)Ct值≤30。

[0109] 3、结果

[0110] 1.金黄色葡萄球菌结果(SA-PCR体系)判读：

[0111] 1.1金黄色葡萄球菌阴性：金葡(SA-FAM)Ct值＝30或“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)；且内参照(Texas Red)通道Ct值＜30，且有较好的对数增长曲线。

[0112] 1.2金黄色葡萄球菌阳性：金葡(SA-FAM)Ct值≤23，且有较好的对数增长曲线；内参照(Texas Red)Ct值≤30。

[0113] 1.3反应无效：金葡(SA-FAM)Ct值＝30或“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI7500)；且内参照(Texas Red)Ct值＝30或“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)。

[0114] 请参阅图1、图2、通过对本发明试剂盒灵敏度和精密度进行研究，显示其具备以下性能：

[0115] 图1为nuc基因灵敏度参比品检测结果图，所测浓度依次为1.0×106copies/5 4 3
ml、1.0×10copies/ml、1.0×10copies/ml、1.0×10copies/ml、最 低 检 出 限 为
3
1.0×10copies/mL。

[0116] 图2：nuc基因特异性结果图；如图所测为表皮葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、藤黄微球菌、微球菌、蜡样芽胞杆菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、牛链球菌、绿脓杆菌、光滑假丝酵母、热带假丝酵母、弱阳性对照、阳性对照，除弱阳性对照、阳性对照外结果全为阴性。

[0117] 本试剂盒具有的特点：

[0118] 1、具有很高的准确性、灵敏度和特异性；

[0119] 2、无须PCR后处理，完全闭管扩增和检测，采用了dUTP-UNG系统，有助于避免扩增产物的污染；

[0120] 3、操作简单、耗时短(2～3小时)；

[0121] 4、结果客观可靠，仪器自动收集和分析数据。

[0122] 综上，与实验室普通PCR定量检测相比，本产品准确性高、特异性强，而且在灵敏度和精密度都有了很大的改进，提高。

[0123] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。