霍乱弧菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒

摘要

本发明涉及一种用于恒温扩增快速检测霍乱弧菌的引物及探针，其中正向引物序列为SEQ ID NO：1，反向引物序列为SEQ ID NO：2；P1探针的序列为SEQ ID NO：3：P2探针的序列为SEQ ID NO：4。同时本发明还提供一种包含上述引物探针序列的，用于恒温扩增快速检测霍乱弧菌的试剂盒，以及应用方法。本发明的试剂盒根据待检菌株的保守基因序列设计引物和探针，从而保证检测方法的特异性。且具有与PCR检测方法相似灵敏度，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可。结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用通用型核酸扩增物快速检测板检测即可，简单、快速、安全、无污染，特别适用于食品检测机构。

权利要求

1.一种切刻内切酶核酸恒温扩增检测霍乱弧菌的引物及探针的组合，其中：正向引物序列为SEQ ID NO:1；

反向引物序列为SEQ ID NO:2；

P1探针的序列为SEQ ID NO:3；

P2探针的序列为SEQ ID NO:4。

2.如权利要求1所述的引物及探针的组合，其特征在于所述的P1探针的5´端标记生物素，P2探针的3´端标记FITC。

说明书

霍乱弧菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于致病微生物检测技术领域，具体涉及一种霍乱弧菌的切刻内切酶核酸恒温扩增快速检测试剂盒。

背景技术

[0002] 霍乱弧菌(vbrio cholera)是霍乱(cholera)的病原菌。霍乱，又称为亚细亚霍乱或传染性霍乱，是由O1血清群和O139血清型霍乱弧菌引起的一种烈性、猝发性的急性细菌性传染病，其危害性仅次于鼠疫。它可引起流行、爆发和大流行。临床特征为剧烈腹泻、呕吐、大量米泔样排泄物、水电解质紊乱和周围循环衰竭，严重休克者可并发急性肾功能衰竭。由于霍乱流行迅速，且在流行期间发病率及死亡率均高，危害极大，因此早期迅速和正确的诊断，对治疗和预防本病的蔓延有重大意义。在我国，霍乱主要发生在夏秋季节，高峰期在7-8月间。2004年年末印度洋大地震和海啸中遇难人数突破15万，重灾区最先出现的疫情就有霍乱。

[0003] 霍乱弧菌现有的检测方法主要有常规分离鉴定法、普通PCR检测法、荧光定量PCR检测法、胶体金免疫层析试验法等。目前尚未见用切刻内切酶核酸恒温扩增技术检测上述菌株的试剂盒及其检测方法的报道。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种霍乱弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒，以克服现有技术的不足，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。

[0005] 本发明的主要原理如下：

[0006] (1)设计一对5′端带切刻内切酶识别序列的引物和一对分别由生物素和FITC标记的探针；

[0007] (2)把引物和目标菌的模板DNA加入到模板预处理反应液，在Taq Platinum DNA聚合酶作用下，通过几个预变性和扩增的循环过程，把切刻内切酶识别序列引入到待扩增序列中，作为NEMA恒温扩增的模板；

[0008] (3)切刻内切酶识别NEMA模板上的识别序列，在其中一条核酸链上切割形成切口，暴露其3′端；

[0009] (4)在具有链置换活性的Bst DNA聚合酶的作用下，以暴露的3′端为起点，以未被切断的另一条核酸链为模板，合成新的双链核酸，旧链被剥离下来成为下一轮核酸合成的模板，同时在新合成的双链核酸上恢复切刻内切酶识别位点；

[0010] (5)切割、延伸和剥离的步骤重复进行，扩增出大量靶核酸序列；

[0011] (6)扩增产物利用通用型核酸扩增物快速检测板检测；

[0012] 核酸扩增完成后，在反应管中加入探针与扩增产物杂交。把检测板水平放置在操作台上，取杂交产物10μL加入检测板的样品孔中，再加入100μL缓冲液进行层析，10min左右判读结果。

[0013] 通用型核酸扩增物快速检测板(杭州优思达生物技术有限公司批号20101026-2)的上C为质控区，T为检测区。检测板在质控区C和检测区T均出现红色条带，为阳性结果，表明样本中含有检测的目标物；仅在质控区C出现红色条带，为阴性结果，表明样本中为检出目标物；质控区C和检测区T内均无红色条带出现，表明快速检测板失效。

[0014] 本发明的一个方面涉及用于恒温扩增快速检测霍乱弧菌的引物及探针，其中正向引物序列为SEQ ID NO：1：

[0015] 5-TGATTATATGCTCAGCTCTTCCTGGTTCCTCAACGCTTCTGT-3；

[0016] 反向引物序列为SEQ ID NO：2：

[0017] 5-GATTTCATTATCCGGCTCTTCGGCATCTGCACCTGCTTTGTA-3。

[0018] 其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

[0019] P1探针的序列为SEQ ID NO：3：

[0020] P1：5-TGGTTCCTCAACGCTTCTGTGTGGTAT-3 5端标记生物素；

[0021] P2探针的序列为SEQ ID NO：4：

[0022] P2：5-CAACGGCAACCTACAAAGCAGGTGC-3 3端标记FITC。

[0023] 本发明的另一个方面涉及一种霍乱弧菌的恒温扩增快速检测试剂盒，包括如下的组分：

[0024] (1)模板预处理反应液：

[0025] 每23μL包括10×Taq Platinum buffer II反应缓冲液，0.1～1.0mmol/L dNTP，0.1～1.0μmol/L正向引物，0.1～1.0μmol/L反向引物，Taq Platinum DNAPolymerase
2.5U；

[0026] 所述的10×Taq Platinum buffer II反应缓冲液成分为：200mM Tris-HClpH8.8，100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，20mM MgCl2；

[0027] (2)NEMA恒温扩增反应液：

[0028] 每46μL包括10×NEBuffer 3反应缓冲液，0.1～1.0mmol/L dNTP，5％～30％DMSO，0.1～1.0μmol/L正向引物，0.1～1.0μmol/L反向引物和100μg/mL牛血清蛋白(BSA)；

[0029] 其中所述的10×NEBuffer 3反应缓冲液成分为：100mmol/L NaCl，50mmol/LTris-HCl，10mmol/L MgCl2，1mmol/L dithiothreitol pH 7.9；

[0030] (3)Nt.BspQI切刻内切酶：4U/μL；

[0031] (4)Bst DNA聚合酶：2U/μL；

[0032] (5)5′端标记生物素探针P1和3′端标记FITC的探针P2各10μmol/L[0033] (6)通用型核酸扩增物快速检测板。型号：3号。

[0034] 上述试剂盒应用于检测食品中的霍乱弧菌，其使用方法，依次包括下列步骤(1)-(4)：

[0035] (1)待检样品或细菌DNA的提取：

[0036] 提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6～2.0范围内，浓度在10～100ng/μL范围内；

[0037] (2)模板预处理：

[0038] 将装有23μL模板预处理反应液的反应管加入2μL待检模板DNA，于94℃水浴7min后迅速放入60℃的水浴中50s；然后94℃水浴20s和60℃水浴50s过程反复进行5个以上循环；产物用于NEMA模板；

[0039] (3)NEMA恒温扩增反应：

[0040] 在装有46μL NEMA扩增反应液的反应管中加入2μL预处理过的模板DNA，1.0μL Nt.BspQI切刻内切酶和1.0μL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57℃的水浴中60min，反应结束后取出；

[0041] (4)产物检测：

[0042] 反应结束后，反应管中加入探针P1和P2各0.5μL，90℃水浴3min自然冷却至恒温，用通用型核酸扩增物快速检测板检测产物。检测线T和质控线C均显示红色，说明待检样品为阳性。

[0043] 本发明的试剂盒根据待检菌株的保守基因序列设计5′端带切刻内切酶识别序列的引物，保证检测方法的特异性。本发明采用改进的切刻内切酶核酸恒温扩增(NEMA)技术，该技术特异性强，具有与PCR检测方法相似灵敏度，并且不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用通用型核酸扩增物快速检测板检测即可，简单、快速、安全、无污染，特别适用于食品检测机构。

具体实施方式

[0044] 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，但实例仅限于说明，并不限于此，其中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

[0045] 实施例1对霍乱弧菌O1/O139标准菌株的检测

[0046] 按下列配方制作霍乱弧菌O1/O139(ATCC 25872)的切刻内切酶核酸恒温扩增检测试剂盒：

[0047] 1)模板预处理反应液：

[0048] 每23μL含有2.5μL 10×Taq Platinum buffer II，1.0μL 2.5mmol/L dNTP，1.0μL 10μmol/L正向引物，1.0μL 10μmol/L反向引物，1.0μL 2.5U/μLTaq Platinum DNA Ploymerase和16.5μL ddH2O(灭菌双蒸水)。

[0049] 其中所述的正向引物SEQ ID NO：1：

[0050] 5-TGATTATATGCTCAGCTCTTCCTGGTTCCTCAACGCTTCTGT-3；

[0051] 反向引物序列为SEQ ID NO：2：

[0052] 5-GATTTCATTATCCGGCTCTTCGGCATCTGCACCTGCTTTGTA-3。

[0053] 其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

[0054] 2)NEMA恒温扩增反应液：

[0055] 每46μL含有5μL 10×NEBuffer 3，1.0μL 2.5mmol/L dNTP，1.0μL 10μmol/L正向引物，1.0μL 10μmol/L反向引物，0.5μL 10mg/ml BSA，4μLDMSO和33.5μL ddH2O(灭菌双蒸水)。

[0056] 其中所述的正向引物SEQ ID NO：1：

[0057] 5-TGATTATATGCTCAGCTCTTCCTGGTTCCTCAACGCTTCTGT-3；

[0058] 反向引物：SEQ ID NO：2：

[0059] 5-GATTTCATTATCCGGCTCTTCGGCATCTGCACCTGCTTTGTA-3。

[0060] 其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

[0061] 3)Nt.BspQI切刻内切酶：4U/μL；

[0062] 4)Bst DNA聚合酶：2U/μL；

[0063] 5)探针P1和P2：10μmol/L；

[0064] 探针P2的序列为SEQ ID NO：4：

[0065] P1：5-TGGTTCCTCAACGCTTCTGTGTGGTAT-3 5端标记生物素；

[0066] 其中所述的探针P1的序列为SEQ ID NO：3

[0067] P2：5-CAACGGCAACCTACAAAGCAGGTGC-3 3端标记FITC。

[0068] 6)核酸薄层层析检测板。型号：3号；

[0069] 按照以下(1)-(4)程序进行检测：

[0070] (1)待检样品(霍乱弧菌O1/O139(ATCC 25872))DNA的提取：

[0071] 提取待检样品霍乱弧菌O1/O139 ATCC 25872核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6～2.0范围内，浓度在10～100ng/μL范围内。

[0072] 将装有23μL模板预处理反应液的反应管加入2μL待检模板DNA，于94℃水浴7min后迅速放入60℃的水浴中50s；然后94℃水浴20s和60℃水浴50s过程反复进行5个以上循环；产物用于NEMA模板。

[0073] (3)进行NEMA恒温扩增反应：

[0074] 将装有46μL NEMA恒温扩增反应液的反应管中加入2μL预处理过的模板DNA，1.0μL Nt.BspQI切刻内切酶和1.0μL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57℃的水浴中60min。
反应结束后取出；

[0075] (4)产物检测：

[0076] 反应结束后，反应管中加入探针P1和P2各0.5μL，90℃水浴3min自然冷却至恒温，用通用型核酸扩增物快速检测板检测产物。在质控区C和检测区T均出现红色条带，说明待检样品为霍乱弧菌。从而证明本发明的引物和探针在检测霍乱弧菌时不会产生假阴性。

[0077] 实施例2对副溶血性弧菌标准菌株的检测

[0078] 按下列配方制作副溶血性弧菌(ATCC 17802)的切刻内切酶核酸恒温扩增检测试剂盒：

[0079] 1)模板预处理反应液：

[0080] 每23μL含有2.5μL 10×Taq Platinum buffer II，1.0μL 2.5mmol/L dNTP，1.0μL 10μmol/L正向引物，1.0μL 10μmol/L反向引物，1.0μL 2.5U/μLTaq Platinum DNA Ploymerase和16.5μL ddH2O(灭菌双蒸水)。

[0081] 其中所述的正向引物SEQ ID NO：1：

[0082] 5-TGATTATATGCTCAGCTCTTCCTGGTTCCTCAACGCTTCTGT-3；

[0083] 反向引物序列为SEQ ID NO：2：

[0084] 5-GATTTCATTATCCGGCTCTTCGGCATCTGCACCTGCTTTGTA-3。

[0085] 其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

[0086] 2)NEMA恒温扩增反应液：

[0087] 每46μL含有5μL 10×NEBuffer 3，1.0μL 2.5mmol/L dNTP，1.0μL 10μmol/L正向引物，1.0μL 10μmol/L反向引物，0.5μL 10mg/ml BSA，4μLDMSO和33.5μL ddH2O(灭菌双蒸水)。

[0088] 其中所述的正向引物SEQ ID NO：1：

[0089] 5-TGATTATATGCTCAGCTCTTCCTGGTTCCTCAACGCTTCTGT-3；

[0090] 反向引物：SEQ ID NO：2：

[0091] 5-GATTTCATTATCCGGCTCTTCGGCATCTGCACCTGCTTTGTA-3。

[0092] 其中正向引物和反向引物中下划线部分为切刻内切酶识别位点；

[0093] 3)Nt.BspQI切刻内切酶：4U/μL；

[0094] 4)Bst DNA聚合酶：2U/μL；

[0095] 5)探针P1和P2：10μmol/L；

[0096] 探针P2的序列为SEQ ID NO：4：

[0097] P1：5-TGGTTCCTCAACGCTTCTGTGTGGTAT-3 5端标记生物素；

[0098] 其中所述的探针P1的序列为SEQ ID NO：3

[0099] P2：5-CAACGGCAACCTACAAAGCAGGTGC-3 3端标记FITC。

[0100] 6)核酸薄层层析检测板。型号：3号；

[0101] 按照以下(1)-(4)程序进行检测：

[0102] (1)待检样品(副溶血性弧菌ATCC 17802)DNA的提取：

[0103] 提取待检样品副溶血性弧菌ATCC 17802核酸，其中提取的样品DNA OD260/OD280在1.6～2.0范围内，浓度在10～100ng/μL范围内。

[0104] 将装有23μL模板预处理反应液的反应管加入2μL待检模板DNA，于94℃水浴7min后迅速放入60℃的水浴中50s；然后94℃水浴20s和60℃水浴50s过程反复进行5个以上循环；产物用于NEMA模板。

[0105] (3)进行NEMA恒温扩增反应：

[0106] 将装有46μL NEMA恒温扩增反应液的反应管中加入2μL预处理过的模板DNA，1.0μL Nt.BspQI切刻内切酶和1.0μL Bst DNA聚合酶后，迅速放入57℃的水浴中60min。
反应结束后取出；

[0107] (4)产物检测：

[0108] 反应结束后，反应管中加入探针P1和P2各0.5μL，90℃水浴3min自然冷却至恒温，用通用型核酸扩增物快速检测板检测产物。质控区C显示红色条带，检测区T无红色条带出现，说明待检样品不是霍乱弧菌。这个结果也证实了本发明的引物和检测试剂盒在应用的时候不会产生假阳性。

[0109] 实施例3：对未感染霍乱弧菌食品样品的检测

[0110] 将食品样品按照实施例1描述的方法进行DNA的提取和扩增检测，用通用型核酸扩增物快速检测板检测产物。结果质控区C显示红色条带，检测区T没有红色条带出现，说明待检样品没有受到霍乱弧菌的感染。

[0111] 本发明的引物、探针和试剂盒还可以对其它的样品进行霍乱弧菌的检测。