用于甜瓜枯萎病抗性鉴定的功能性分子标记一及其用途

摘要

本发明公开了用于甜瓜枯萎病抗性鉴定的功能性分子标记一，该分子标记一所采用的引物序列为：CAPS1：正向引物为5’-TGCTCCTTTGGCTTCCTGT-3’，反向引物为5’-GAGTCTATTGTTTCGCTTCA-3’。该功能性分子标记一用于甜瓜枯萎病的分子辅助育种，或者用于鉴定甜瓜枯萎病抗性基因。

权利要求

1.用于甜瓜枯萎病抗性鉴定的功能性分子标记一，其特征是： 所述分子标记一所采用的引物序列为： CAPS1：正向引物为5’- TGCTCCTTTGGCTTCCTGT -3’ 反向引物为5’- GAGTCTATTGTTTCGCTTCA -3’ 。

2.如权利要求1所述的功能性分子标记一的用途，其特征是：用于甜瓜枯萎病的分子辅助育种。

3. 如权利要求1所述的功能性分子标记一的用途，其特征是：用于鉴定甜瓜枯萎病抗性基因。

说明书

用于甜瓜枯萎病抗性鉴定的功能性分子标记一及其用途

[0001] 本发明是申请日为2010.04.15，申请号为201010147650.0的《用于甜瓜枯萎病抗性鉴定的功能性分子标记及其用途》的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明属于蔬菜抗病分子标记育种技术领域，具体涉及一种甜瓜枯萎病抗性基因Fom-2功能性分子标记及其应用，从而为甜瓜枯萎病抗性的标记辅助选择提供一种新型分子标记。

背景技术

[0003] 甜瓜(Cocumis melo L.)作为葫芦科(Cucurbitaceae)植物中一种重要的园艺作物，具有较高的商业品价值和经济价值，是我国重要的经济作物之一。近年来随着甜瓜种质资源商品化和种植面积的不断扩大，病虫害发生日益严重，迫使生产上大量使用化学试剂，严重影响了甜瓜的产量和品质(Sherf and MacNab 1986)。其中甜瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌导致的一种世界范围内毁灭性的土传病害，导致甜瓜90％以上的经济损失(Leach JG1938；Martyn RD 1987)。目前已经鉴定分离得到4种枯萎病菌生理小种，分别为生理小种0，1，2和1-2。遗传分析表明，2个独立的基因Fom-1和Fom-2分别控制对生理小种0，2和0，1的抗性(Risser et al.1976；Risser and Mas 1965；Robinson et al.1976)。其中Fom-2基因已经通过图位克隆的方法得到分离(Joobeur et al.2004)。Fom-2基因属于NBS-LRR类的R基因，这类基因编码NBS(nucleotide binding site，NBS)和LRR(leucine-rich repeat，LRR)两个比较保守的结构域。通常植物专化抗性是由于宿主对抗性蛋白产生的无毒基因的识别，进而引发一个信号级联反应和防御反应(Hammond Kosack and Jones 1997；Martin et al.2003)。植物的R基因不断变化来识别产生变异的无毒基因，这有利于人们在分子水平上发现和认识自然选择。现在人们已从许多物种中克隆得到R基因，并验证了它们在抗性和不抗材料间的功能多样性。许多研究表明拟南芥和其他几个物种R基因存在序列的多态性，这种种间或种内影响表型的基因序列多态性的识别有利于功能性分子标记的发展(Andersen and Lubberstedt，2003)。

[0004] 目前培育优良抗枯萎病甜瓜品种成为解决甜瓜枯萎病害问题的有效途径之一，分子辅助选择(MAS)手段的发展能大大缩短甜瓜枯萎病抗性育种进程。但目前抗病育种过程中所使用的分子标记与目标基因存在一定遗传距离，易发生重组交换而分离，从而影响选择的准确性。

[0005] 功能性分子标记是与表型相关的功能基因基序中功能性单核苷酸多态性位点开发而成的新型分子标记，功能性分子标记的开发首先需要鉴定出群体中与表型相关的功能基因的功能性基序的序列。AS-PCR和CAPS方法已成功应用于基于SNPs的一系列功能性分子标记的开发(Chiapparino et al.2004；Kim et al.2006；Yeam et al.2005)。功能性分子标记不需要复杂昂贵的仪器设备或繁琐的操作步骤，因此非常适合应用于分子育种过程。随着越来越多的功能基因及其等位基因的分离和注释，功能性分子标记已成为一类新型分子标记，可以大大提高标记的效率。

发明内容

[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种与甜瓜枯萎病抗性基因Fom-2相关的功能性分子标记，其适用于甜瓜的抗枯萎病的辅助选择。

[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于甜瓜枯萎病抗性鉴定的功能性分子标记，

[0008] 该分子标记所采用的CAPS引物序列为以下任意一种：

[0009] CAPS1：正向引物为5’-TGCTCCTTTGGCTTCCTGT-3’ (SEQ ID NO：3)[0010] 反向引物为5’-GAGTCTATTGTTTCGCTTCA-3’ (SEQ ID NO：4)，[0011] CAPS2：正向引物为5’-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3’ (SEQ ID NO：5)[0012] 反向引物为5’-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3’ (SEQ ID NO：6)，[0013] CAPS3：正向引物为5’-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3’(SEQ ID NO：7)[0014] 反向引物为5’-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3’(SEQ ID NO：8)；

[0015] 或者，该分子标记所采用的AS-PCR引物序列为：

[0016] AS-PCR：正向引物为5’-GTGTAACACAAATTCCTCAACA-3’ (SEQ ID NO：9)[0017] 反向引物为5’-GACGTAGCATTGCTTCTGTAGA-3’ (SEQ ID NO：10)。

[0018] 本发明还同时提供了上述功能性分子标记的用途：用于甜瓜枯萎病的分子辅助育种，或者用于鉴定甜瓜枯萎病抗性基因。

[0019] 发明人发现了甜瓜枯萎病抗性基因Fom-2在抗病与感病种质的LRR区域有3个SNP位点，甜瓜枯萎病抗性基因Fom-2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。枯萎病抗性和感病材料在序列表SEQ ID NO：1的281bp处有一个A-G的碱基突变，在1075bp处有一个A-G的碱基突变，在1216bp处有一个T-C的碱基突变(图1)。突变后的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所述。

[0020] 根据上述SEQ ID NO：1的序列的SNP特征，分别设计引物，开发FMs，所述的CAPS和AS-PCR方法的引物对分别为：

[0021] CAPS1：正向引物为5’-TGTTTGGAGAAAGTTGAAAGTC-3’

[0022] 反向引物为5’-ACCATACAAACCTATCTCTATT-3’；

[0023] CAPS2：正向引物为5’-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3’

[0024] 反向引物为5’-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3’；

[0025] CAPS3：正向引物为5’-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3’

[0026] 反向引物为5’-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3’。

[0027] AS-PCR：正向引物为5’-GTGTAACACAAATTCCTCAACA-3’

[0028] 反向引物为5’-GACGTAGCATTGCTTCTGTAGA-3’。

[0029] 该CAPS及AS-PCR引物对能成功鉴定出甜瓜抗病及感病种质(图2、3)，并且在F2世代中呈单基因遗传分离规律(表1、2)，应用上述两种方法可以成功鉴定出甜瓜种质对枯萎病抗性的基因型(表3)。

附图说明

[0030] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

[0031] 图1是本发明的甜瓜抗病及感病种质Fom-2基因LRR区域SNP位点图；

[0032] 图1中：Fom-2-R代表枯萎病抗病基因型，Fom-2-S代表枯萎病感病基因型；

[0033] 图2是CAPS方法鉴定甜瓜抗病及感病种质对比图；

[0034] 图2中：FF为抗病纯合基因型，Ff为抗病杂合基因型，ff为感病纯合基因型，M为DNA分子量标准；

[0035] 图3是AS-PCR方法鉴定甜瓜抗病及感病种质对比图；

[0036] 图3中：FF为抗病纯合基因型，Ff为抗病杂合基因型，ff为感病纯合基因型，M为DNA分子量标准。

具体实施方式

[0037] 实施例1、本发明的主要步骤和内容为：根据数据库中甜瓜枯萎病抗性基因Fom-2设计引物，以甜瓜抗病及感病种质及它们F1、F2世代基因组DNA为模板，链式聚合酶反应(PCR)方法扩增目的片段、测序，然后应用生物信息学然间对序列进行分析。采用CAPS和AS-PCR两种方法开发枯萎病抗性相关的FMs，并在F1、F2世代验证其有效性和可靠性。应用上述两种标记方法，提取生产上应用的不同甜瓜种质基因组DNA，鉴定其枯萎病抗性的基因型。

[0038] 具体步骤如下：

[0039] (1)在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中找到甜瓜枯萎病抗性基因Fom-2的序列信息，Fom-2基因登录号为AY583855。Fom-2基因属于NBS-LRR类的R基因，编码NBS和LRR两个比较保守的结构域。

[0040] (2)设计引物并合成，在Fom-2基因LRR区两端设计引物，引物序列如下：

[0041] Fom-2：正向引物：GAGTCTATTGTTTCGCTTC

[0042] 反向引物：TGCTCGTCTCTGGGTCACCTTC。

[0043] (3)基因组DNA的提取

[0044] (a)分别取0.5g上述甜瓜抗病(Cantaloupe，高抗枯萎病材料)和感病种质(仙果027-5，高感枯萎病材料)、F1、F2的不同甜瓜种质嫩叶于研钵中，液氮状态下研磨，加入600μl 65℃预热的2×CTAB(30μl巯基乙醇混匀)，转移到离心管中，65℃保温1小时。

[0045] (b)加入600μl的氯仿：异戊醇(24/1的体积比)轻轻摇匀，4℃，13000rpm离心，10分钟。

[0046] (c)取上清，重复(b)步骤一次。

[0047] (d)取步骤(c)所得的上清于另一离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，静置5分钟，13000rpm，离心10分钟。

[0048] (e)倒去上清，加入700μl Wash Buffer漂洗DNA沉淀，离心，重复一次。

[0049] (f)加15μlTE-Rnase，37℃保温1小时。

[0050] (g)加入2mol/L NaCl 100μl+100％乙醇250μl混匀，-20℃静置30min，13000rpm离心10分钟。

[0051] (h)倒去上清，加入500μl 70％(体积比)乙醇，漂洗，倒去乙醇，重复一次，常温晾干。

[0052] (i)加入30-50μl ddH2O或TE，回溶，-20℃保存备用。

[0053] 注：2×CTAB配方：

[0054] CTAB： 4g

[0055] 1M Tris-HCl(pH8.0)： 20ml

[0056] EDTA： 1.488g

[0057] NaCl： 16.352g

[0058] 先用70ml ddH2O溶解，再定容至200ml灭菌，冷却后0.2-1％2-巯基乙醇(400μl)氯仿-异戊醇(24∶1)：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

[0059] TE-Rnase：15μl TE加入1/100体积的Rnase。

[0060] Wash Buffer：10mmol/L乙酸氨

[0061] 75％(体积比)乙醇

[0062] (4)链式聚合酶反应(PCR)的试剂与条件：

[0063] 首先将下列试剂混和在一起

[0064]

[0065] PCR反应条件为：94℃预变性3min后，94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸1.5min，35个循环后72℃延伸10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。对目的条带进行克隆测序，具体方法如下：

[0066] (a)连接反应，离心管顺序加入以下各组分：

[0067] H2O： 2μl

[0068] T4DNALigase 10×Buffer： 1μl

[0069] pUCM-T载体： 1μl

[0070] PCR产物： 4μl

[0071] PEG4000： 1μl

[0072] T4DNALigase： 1μl；

[0073] (b)感受态细胞的制备(CaCl2法制备感受态细胞)：

[0074] ①挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12h左右，直至对数生长后期。

[0075] ②将菌液以1∶100-1∶150的比例(重量比)接种于100ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养2h左右，至OD600＝0.5左右。

[0076] ③将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下10000rpm离心10min。

[0077] ④弃上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液30ml轻轻悬浮细胞，冰上放置10min后，4℃下10000rpm离心10min。重复操作一次。

[0078] ⑤弃上清，加3ml预冷的含15％(体积比)甘油的0.1mol/L的CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置5min后，即成感受态细胞，分装成200μl的小份，置于-70℃保存备用。

[0079] (c)热激法转化大肠杆菌DH5α：

[0080] ①取上述(b)步骤制备的感受态细胞悬浮液200μl，摇匀后加入4μl上述(a)步骤的连接产物，用枪头轻轻吹打均匀，冰浴30分钟；

[0081] ②42℃保温90秒，迅速放入冰中，冰浴5分钟；

[0082] ③加入37℃预热的1ml LB液体培养基(Amp-)，混匀，37℃保温1个小时，使细胞恢复正常生长状态；

[0083] ④3000rpm离心10分钟；

[0084] ⑤弃去上清，余下的200μl用枪头轻轻吹打均匀，使细菌充分悬浮后均匀涂布于+含15μl X-Gal(20mg/ml)和100μl IPTG(24mg/ml)的LB筛选平板培养基上(Amp)；

[0085] ⑥37℃正面向上放置半个小时后，倒置培养8-12小时，观察。

[0086] LB培养基配方：

[0087] 100ml体系中加入以下各组分：

[0088] 蛋白胨(Typtone)： 1g

[0089] 酵母提取物(Yeast Extract)： 0.5g

[0090] NaCl： 1g

[0091] NaOH(1mol/L)： 100μl

[0092] 先用70ml ddH2O溶解，再定容至100ml，高压高温灭菌后4℃保存。

[0093] (5)质粒纯化：

[0094] (a)在超净工作台中用无菌枪头挑取单个白色菌落，接种于含50μg/ml Amp的5mlLB培养液中，37℃培养过夜。

[0095] (b)取1-2ml菌液于Epeendorf管中，12000rpm离心1分钟；

[0096] (c)加入100μl Solution I，用枪头充分悬浮菌液；

[0097] (d)加入200μl Solution II，颠倒Epeendorf管，冰浴3分钟；

[0098] (e)加入150μl预冷的Solution III，颠倒Epeendorf管，冰浴5分钟；

[0099] (f)4℃，12000rpm离心5分钟，上清液加入等体积的苯酚/氯仿混匀；

[0100] (g)4℃，12000rpm离心5分钟，上清液加入2倍体积的乙醇，室温放置5分钟；

[0101] (h)4℃，12000rpm离心5分钟，用70％乙醇漂洗一下，凉干沉淀，50μl TE融解沉淀，-20℃保存备用。

[0102] 其中：

[0103] Solution I：100ml体系：

[0104] 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)： 2.5ml

[0105] 0.5mol/L EDTA(pH8.0)： 2.0ml

[0106] 20％Glucose(1.11mol/L)： 4.5ml

[0107] dH2O： 91ml

[0108] 高温高压灭菌后4℃保存。

[0109] SolutionII：100ml体系：

[0110] 10％SDS： 10ml

[0111] 2mol/LNaOH： 10ml

[0112] 加灭菌水至100ml，充分混匀，室温保存，最好现用现配。

[0113] SolutionIII：100ml体系：

[0114] KOAc： 29.4g

[0115] CH3COOH： 11.5ml

[0116] 加灭菌水至100ml，高温高压灭菌后4℃保存。

[0117] 序列测定与分析：序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成。将所得序列在Genebank及分子生物学软件DNAMAN、ClustalW等分析，得到SNP位点信息(图1)。

[0118] (6)CAPS方法

[0119] 采用dCAPS 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)软件设计引物，引物序列如下：

[0120] CAPS1：正向引物5’-TGTTTGGAGAAAGTTGAAAGTC-3’

[0121] 反向引物5’-ACCATACAAACCTATCTCTATT-3’

[0122] CAPS2：正向引物5’-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3’

[0123] 反向引物5’-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3’

[0124] CAPS3：正向引物5’-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3’

[0125] 反向引物为5’-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3’

[0126] 反应体系和条件同上，PCR产物分别采用AccI，EcoRI和XbaI限制性内切酶进行酶切，三种内切酶均采用20μl的反应体系如下：

[0127] 反应体系：

[0128]

[0129] 补充dd H2O至20μl；

[0130] 将混合溶液置于37℃，TaqI体系置于65℃条件下各保温4小时，产物采用HDA-GT12TM(eGene，USA)毛细管电泳系统进行检测。

[0131] 利用CAPS标记分析F2群体遗传规律，3个SNP位点均呈1∶2∶1的分离比例(表1)，符合孟德尔单基因遗传规律，因此CAPS方法可以有效区分抗性和敏感植株。

[0132] 表1、CAPS方法鉴定的SNP位点在F2世代中遗传分离

[0133]位点 引物 FF类型 Ff类型 ff类型 有效值 比例
位点1 CAPS1 23 47 25 95 1∶2∶1
位点2 CAPS2 21 48 25 94 1∶2∶1
位点3 CAPS3 23 46 23 92 1∶2∶1

[0134] (7)AS-PCR方法

[0135] 将SNP位点置于引物的3’端，合成等位基因特异性引物，我们在位点2和3处设计了5条AS-PCR引物，配对得到6个引物组合，优化PCR反应条件，筛选到一条特异性引物对，通过PCR方法直接区分高抗和高感种质。

[0136] 引物对序列如下：

[0137] AS-PCR：正向引物为5’-GTGTAACACAAATTCCTCAACA-3’

[0138] 反向引物为5’-GACGTAGCATTGCTTCTGTAGA-3’。

[0139] PCR反应体系(25μl)如下：

[0140]

[0141]

[0142] 反应条件：94℃变性5min，94℃30s、56℃30s、72℃45s，共30个循环，72℃延伸7min，采用3％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

[0143] 随即选取100株F2代甜瓜遗传分离植株进行上述试验，结果76株扩增到清晰的目的条带，24株无条带，符合3∶1的单基因分离遗传学规律(表2)，因此AS-PCR方法可以有效区分Fom-2抗性和敏感植株。

[0144] 表2、AS-PCR方法鉴定的SNP位点2和3在F2世代中遗传分离

[0145]

[0146] 实施例2、

[0147] 选取浙江地区栽培面积较多的薄皮和厚皮甜瓜品种及当地的特色品种，共计34个(表3)。采用AS-PCR及CAPS方法对其进行枯萎病抗性筛选。

[0148] 其 中CAPS 方 法，我 们 采 用 特 异 性 扩 增 引 物：正 向 引 物 CAPS2-F：5’-GGAAGTGAGG-TGTTGAATT-3’与反向引物CAPS2-R：5’-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3’)，以待测品种基因组DNA为模板进行特异性PCR(反应体系和PCR反应条件同上)。产物纯化TM
后采用EcoR I限制型内切酶进行酶切，HAD-GT12 全自动毛细管核酸分析系统进行电泳分析，数据校正后，记录并分析结果。

[0149] AS-PCR方 法 中，我 们 采 用 特 异 性 扩 增 引 物：正 向 引 物 2-3F1：5’-GTGTAACACAAA-TTCCTCAACA-3’与反向引物2-3R1：5’-GTGTAACACAAATTCCTCATCA-3’)，以待测品种基因组DNA为模板进行特异性PCR(反应体系和PCR反应条件同上)，产物经
1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，观察电泳结果，记录并分析结果。

[0150] 表3、常见甜瓜栽培品种Fom-2型与枯萎病抗性鉴定

[0151]

[0152]

[0153] 我们采用AS-PCR与CAPS两种方法对常规栽培品种进行Fom-2功能性分子标记，两种方法得到相同的结果。从试验结果可以看出，我们从34份栽培品种中筛选到枯萎病抗性材料11份，其中包含纯合抗病品种2个，杂合抗病品种9个，为今后枯萎病抗性育种提供了良好的种质资源。

[0154] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。