结核杆菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒转让专利
申请号 : CN201110432511.7
文献号 : CN102399901B
文献日 : 2013-07-24
发明人 : 袁静 , 黄留玉 , 刘威 , 尹志涛 , 邹大阳 , 熊鸿燕
申请人 : 中国人民解放军疾病预防控制所
摘要 :
本发明公开了结核杆菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。该专用引物包含由FIP、BIP、LF、LB、F3和B3共6条引物组成的引物组合，本发明LAMP检测方法可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到结核杆菌，不需要复杂仪器，可针对纯菌试样以及临床痰液、脑脊液样本等进行检测。本发明为结核杆菌的检测提供了一个新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测结核杆菌。
权利要求 :
1.用于对结核杆菌进行LAMP检测的专用引物，是根据序列表中序列1所示的结核杆菌的特异性保守靶序列IS6110设计的，用以定性检测待测样品中的结核杆菌；所述用于对结核杆菌进行LAMP检测的专用引物命名为JH164引物组合，由以下三组引物对混合得到，第一组引物对：引物1—F3，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物2—B3，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；第二组引物对：引物3—FIP，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4—BIP，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；第三组引物对：引物5—LF，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6—LB，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。
2.根据权利要求1所述的专用引物，其特征在于：所述JH164引物组合中各引物对（FIP和BIP）：（LF和LB）：（F3和B3）的摩尔比为40：20：5。
3.一种结核杆菌的LAMP检测试剂盒，包含有权利要求1或2所述的结核杆菌的LAMP检测的专用引物。
4.根据权利要求3所述结核杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为结核杆菌的基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系。
5.根据权利要求4所述结核杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为双蒸水。
6.根据权利要求3或4或5所述结核杆菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括：20mM pH8.8的Tris·HCl，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱，8mM MgSO4，1.4mM dNTP each，JH164引物组合：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3；Bst DNA聚合酶、双蒸水、钙黄绿素指示剂和结核杆菌的基因组DNA。
说明书 :
结核杆菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法，特别是涉及结核杆菌的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒。
背景技术
[0002] 结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。结核病又称为痨病和“白色瘟疫”，是一种古老的传染病，自有人类以来就有结核病。迄今为止，结核病仍为严重的传染病。据统计，世界人口中1/3感染有结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，约三分之一的人口已感染了结核杆菌，受感染人数超过4亿。我国现有肺结核病人约500万，主要集中在25岁及以上人群，其中涂阳肺结核病人150万，每年约有13万人死于结核病，死亡平均年龄为55.2岁。据研究，受结核菌感染的人群中，10％的人会发展为结核病。如果不采取有效的控制措施，在未来的
10年，我国可能有近5000万的结核病感染者。
10年，我国可能有近5000万的结核病感染者。
[0003] 结核病是青年人容易感染的一种慢性和缓发的传染病，一年四季都可以发病，15岁到35岁的青少年是结核病的高发峰年龄；结核病的潜伏期4-8周；80％的结核病感染发生在肺部，其它部位(颈淋巴、脑膜、腹膜、肠、皮肤、骨骼)也可继发感染；人与人之间呼吸道传播是该病传染的主要方式；传染源为接触排菌的肺结核患者。
[0004] 环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi(Notomi T，Okayama H，MasubuchiH，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res 2000；28(12)：63.)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(Imai M，Ninomiya A，Minekawa H，et al.Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method.J Virol Methods.2007；141(2)：173-80.) 利 用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人(Hayashi N，Arai R，Tada S，Taguchi H，Ogawa Y.Detection and identification of Brettanomyces/Dekkera sp.yeasts with a loop-mediated isothermal amplification method.Food Microbiol.2007；24(7-8)：778-85.)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其它与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、虹彩病毒、人类疮疹病毒8型、造血组织坏死病毒(工HHNV)、番茄斑萎病毒和番茄黄化曲叶病毒等。但是迄今为止，市场上还未见用于检测结核杆菌的LAMP专用引物与试剂盒问世。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种特异性和灵敏度较高的用于检测结核杆菌的LAMP检测专用引物。
[0006] 本发明所提供的用于对结核杆菌进行LAMP检测的专用引物，是根据如序列表中序列1所示的结核杆菌的特异性保守靶序列IS6110设计的，用以定性检测待测样品中的结核杆菌。
[0007] 具体来讲，所述用于对结核杆菌进行LAMP检测的专用引物命名为JH164引物组合，由以下三组引物对混合得到，第一组引物对：引物1(F3)，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，引物2(B3)，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；第二组引物对：引物3(FIP)，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，引物4(BIP)，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；第三组引物对：引物5(LF)，其核苷酸序列如序列表中序列6所示，引物6(LB)，其核苷酸序列如序列表中序列7所示。
[0008] 所述JH164引物组合中各引物对(FIP和BIP)∶(LF和LB)∶(F3和B3)的摩尔比为40∶20∶5。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种结核杆菌的LAMP检测方法。
[0010] 本发明所提供的结核杆菌的LAMP检测方法，可包括以下步骤：
[0011] 1)以待测物的基因组DNA为模板，在上述专用引物的引导下进行LAMP扩增；
[0012] 2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果，绿色表示待测样品中存在结核杆菌，橙色表示待测样品中不存在结核杆菌；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，浊度上升表示待测样品中存在结核杆菌，浊度无变化表示待测样品中不存在结核杆菌。
[0013] 在上述结核杆菌的LAMP检测方法中，所述步骤1)中的待测样品包括纯菌、痰液和脑脊液等；所述25μl LAMP反应体系可包括：待测物的基因组DNA 2μl，20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，引物加入量为：40pmol序列表中序列2(FIP)和序列3(BIP)所示引物，20pmol序列表中序列4(LF)和序列5(LB)所示引物，5pmol序列表中序列6(F3)和序列7(B3)所示引物。
[0014] 所述步骤1)中的LAMP扩增条件可为：置60-65℃恒温40-60min(优选为50min)。
[0015] 所述步骤2)中钙黄绿素指示剂的添加量可为1μl(终反应体系为26μl)，包含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰。
[0016] 本发明的第三个目的是提供一种结核杆菌的LAMP检测试剂盒。
[0017] 本发明所提供的结核杆菌的LAMP检测试剂盒，包含有上述结核杆菌的LAMP检测的专用引物。所述试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为结核杆菌的基因组DNA，所述阴性对照为不含DNA的LAMP扩增体系，如双蒸水。
[0018] 具体的，所述结核杆菌的LAMP检测试剂盒包括：20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTP each，JH164引物组合：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3；Bst DNA聚合酶、双蒸水、钙黄绿素指示剂和结核杆菌的基因组DNA(25μl LAMP反应体系中使用2μl)。
[0019] 采用以上设计，本发明具有以下优点：
[0020] 1)高特异性：6条引物对结核杆菌靶序列的8个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；
[0021] 2)高灵敏度：灵敏度比普通PCR高10倍；
[0022] 3)结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果(钙黄绿素显色)，也可以直接用浊度仪判断结果；
[0023] 4)操作简单：只要将检测样品(靶核酸)和检测试剂一起放入60-65℃恒温水浴锅中50分钟后就可以判断结果；
[0024] 5)快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应一小时内即可完成，且产率可达到0.5mg/mL。
[0025] 综上所述，本发明可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到结核杆菌，不需要复杂仪器，为结核杆菌的检测提供了一个新的技术平台，可用于畜牧业生产单位、基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测结核杆菌，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。
[0026] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
[0027] 图1为5套引物的LAMP扩增曲线
[0028] 图2为本发明结核杆菌LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果
[0029] 图3为本发明结核杆菌LAMP检测方法特异性的钙黄绿素指示剂染色检测结果[0030] 图4为本发明结核杆菌LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果
[0031] 图5为本发明结核杆菌LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素指示剂染色检测结果[0032] 图6为结核杆菌的PCR检测结果
具体实施方式
[0033] 实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0034] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0035] 实施例1、用于对结核杆菌进行LAMP检测的引物设计
[0036] 从美国基因数据库检索获得结核杆菌序列(GenBank号：CP002992.1)，通过BLAST软件进行同源性分析，获得结核杆菌的特异性保守靶序列IS6110(序列表中序列1)，再根据该保守靶DNA序列，用软件Primer design V4设计用于对结核杆菌进行LAMP检测的引物，设计出5套引物(JH164、JH118、JH99、JH75、JH54)，经过实验对比(参见实施例2)，最终选取了由6条引物组成的引物组合JH164(6条引物可以任意比例组配，实施例2反应体系中给出了一种具体优化组配作为示例)，其引物序列如表1所示。
[0037] 表1用于对结核杆菌进行LAMP检测的引物JH164
[0038]
[0039] 实施例2、本发明结核杆菌的LAMP检测方法的建立
[0040] 用表1所列的用于对结核杆菌进行LAMP检测的引物组合JH164(含六条引物)对肠炎结核杆菌(来自中国人民解放军疾病预防控制所传染病控制中心)进行LAMP检测，以获得最佳反应体系及反应条件，同时以其它4套引物(JH118、JH99、JH75、JH54)为对照，具体方法如下：
[0041] 一、最佳反应体系的确定
[0042] 1)以含结核杆菌基因组DNA(用Promega的Wizard Genomic DNA purification Kit 商品化DNA提取试剂盒提取待测样品中的核酸)为模板，在引物组合JH164(含六条引物)的引导下进行LAMP扩增，其中，25μl LAMP反应体系包括：含结核杆菌的基因组DNA 2μl，20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，分别添加(4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM)MgSO4，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase(购自NEB公司)，加入的引物量为：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3；反应条件为置63℃恒温水浴锅中孵育50min。
[0043] 2)反应结束后进行结果判定：在反应液中添加1μl的(终反应体系为26μl)含有0.5mM钙黄绿素和10mM氯化锰的钙黄绿素颜色指示剂，根据反应液的颜色变化判断结果(原理：钙黄绿素是金属离子指示剂，能指示反应液中Mg2+的变化。)，绿色表示待测样品中存在结核杆菌(阳性)，橙色表示待测样品中不存在结核杆菌(阴性)；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果(原理：LAMP反应的过程中会产生焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，浊度仪可以根据浊度的变化来判断LAMP反应)，浊度上升表示待测样品中存在结核杆菌(阳性)，浊度无变化表示待测样品中不存在结核杆菌(阴性)。
[0044] 在8mM MgSO4条件下，JH164、JH118、JH99、JH75和JH54扩增产物的浊度变化检测结果如图1所示，由图1可以看出，JH164的扩增效果最好，因此将JH164引物组合定为本发明用于对结核杆菌进行LAMP检测的专用引物。
[0045] 在JH164引物组合的引导下，用上述含有不同浓度MgSO4的反应体系检测待测样品中的结核杆菌，结果含有8mM MgSO4的反应体系的检测效果最好，因此，将本发明最佳的结核杆菌的LAMP检测体系定为(25μl)：待测物的基因组DNA 2μl，20mM Tris·HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，加入的引物量为：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，
5pmol F3和B3。
5pmol F3和B3。
[0046] 二、最佳反应条件的确定
[0047] 在步骤一确定的相同的反应体系下，在不同反应条件下对含结核杆菌的基因组DNA进行LAMP检测，以确定最佳反应条件，具体方法包括以下步骤：
[0048] 1)以含结核杆菌的基因组DNA为模板，在实施例1获得的六条引物的引导下进行LAMP扩增，其中，25μl LAMP反应体系包括：含结核杆菌的基因组DNA 2μl，20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTP each，8U Bst DNA polymerase，加入的引物量为：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3。LAMP的扩增条件为：置60-65℃恒温40-60min。
[0049] 2)结果判定
[0050] 反应结束后，用与步骤一相同的方法进行结果判定。检测结果表明，本发明最佳的结核杆菌LAMP扩增条件为：置60-65℃恒温40-60min。
[0051] 实施例3、本发明结核杆菌的LAMP检测方法的特异性、灵敏性
[0052] 一、本发明结核杆菌的LAMP检测方法的特异性检测
[0053] 分别以结核杆菌(菌株来自解放军309医院)；脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎链球菌、军团菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯杆菌(以上菌株均来自国家CDC)；副溶血弧菌、肠炎沙门氏菌、甲型副伤寒沙门、福氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、肠侵袭性大肠杆菌、致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌(以上菌株均来自中国人民解放军疾病预防控制所传染病控制中心)的基因组DNA为模板。以双蒸水为阴性对照，检测实施例2获得的最佳的结核杆菌的LAMP检测方法的特异性，反应体系和反应条件与实施例2相同。
[0054] 本发明结核杆菌LAMP检测方法特异性的浊度仪检测结果如图2所示(1为阴性对照双蒸水；2为结核杆菌；3为脑膜炎奈瑟氏菌(NM29019)；4为肺炎链球菌(SP112-07)；5为军团菌(LP9135)；6为流感嗜血杆菌(M5216)；7为肺炎克雷伯杆菌(46117)；8为副溶血弧菌；9为肠炎沙门氏菌；10为甲型副伤寒沙门；11为福氏志贺氏菌；12为宋内志贺氏菌；13为肠侵袭性大肠杆菌；14为致病性大肠杆菌；15为肠产毒性大肠杆菌。)，从图2中可以看出，只有结核杆菌(2)发生了LAMP反应，其余均未发生；本发明结核杆菌LAMP检测方法特异性的钙黄绿素指示剂染色检测结果如图3所示(1为阴性对照双蒸水；2为结核杆菌；3为脑膜炎奈瑟氏菌(NM29019)；4为肺炎链球菌(SP112-07)；5为军团菌(LP9135)；6为流感嗜血杆菌(M5216)；7为肺炎克雷伯杆菌(46117)；8为副溶血弧菌；9为肠炎沙门氏菌；10为甲型副伤寒沙门；11为福氏志贺氏菌；12为宋内志贺氏菌；13为肠侵袭性大肠杆菌；14为致病性大肠杆菌；15为肠产毒性大肠杆菌)，其中只有2号试管显示出绿色，表明检测到结核杆菌；钙黄绿素指示剂染色方法和浊度仪检测方法的结果一致，表明本发明的结核杆菌的LAMP检测方法具有较高的特异性，可以特异性地检测到结核杆菌。
[0055] 二、本发明结核杆菌的LAMP检测方法的灵敏度检测
[0056] 测试本发明LAMP检测方法和普通PCR方法检测结核杆菌的灵敏度，方法为：提取2 3 4 5 6
结核杆菌总DNA后定量，然后以10倍梯度(1倍、10倍、10 倍、10 倍、10 倍、10 倍、10 倍、
7
10 倍)进行稀释使1-8模板中总DNA的浓度分别为1010ng/μl、101ng/μl、10.1ng/μl、
1.01ng/μl、101pg/μl、10.1pg/μl、1.01pg/μl、0.101pg/μl，再以经梯度稀释的DNA为模板，分别用本发明的LAMP检测方法与普通PCR方法(引物序列为F3和B3)进行灵敏度检测。
结核杆菌总DNA后定量，然后以10倍梯度(1倍、10倍、10 倍、10 倍、10 倍、10 倍、10 倍、
7
10 倍)进行稀释使1-8模板中总DNA的浓度分别为1010ng/μl、101ng/μl、10.1ng/μl、
1.01ng/μl、101pg/μl、10.1pg/μl、1.01pg/μl、0.101pg/μl，再以经梯度稀释的DNA为模板，分别用本发明的LAMP检测方法与普通PCR方法(引物序列为F3和B3)进行灵敏度检测。
[0057] 本发明结核杆菌LAMP检测方法灵敏度的浊度仪检测结果如图4所示(代号1-8模板对应浓度分别为：101ng/μl、10.1ng/μl、1.01ng/μl、101pg/μl、10.1pg/μl、1.01pg/μl、0.101pg/μl、0.010pg/μl)，代号1-5浊度上升表示检测到结核杆菌，表明引物组合JH164对结核杆菌的最低检测灵敏度为10.1pg/μl；本发明结核杆菌LAMP检测方法灵敏度的钙黄绿素指示剂颜色反应检测结果如图5所示(代号1-8模板对应浓度分别为：101ng/μl、10.1ng/μl、1.01ng/μl、101pg/μl、10.1pg/μl、1.01pg/μl、0.101pg/μl、
0.010pg/μl)，其中1-5号试管显示出绿色，检测到结核杆菌，表明用钙黄绿素作为指示剂的最低检测灵敏度也为10.1pg/μl，和浊度仪结果一致；对照结核杆菌的PCR检测结果如图6所示(代号1-8模板对应浓度分别为：101ng/μl、10.1ng/μl、1.01ng/μl、101pg/μl、10.1pg/μl、1.01pg/μl、0.101pg/μl、0.010pg/μl，M为DNA marker D2000)，结果
1-4号有条带出现，表明用PCR方法检测的灵敏度为101pg/μl。由图5和图6检测结果比较得知，本发明结核杆菌的LAMP检测方法可检测到10.1pg/μl，而且钙黄绿素指示剂染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，而普通PCR方法能检测到101pg/μl，表明本发明结核杆菌的LAMP检测方法比普通PCR检测方法的灵敏度高10倍。
0.010pg/μl)，其中1-5号试管显示出绿色，检测到结核杆菌，表明用钙黄绿素作为指示剂的最低检测灵敏度也为10.1pg/μl，和浊度仪结果一致；对照结核杆菌的PCR检测结果如图6所示(代号1-8模板对应浓度分别为：101ng/μl、10.1ng/μl、1.01ng/μl、101pg/μl、10.1pg/μl、1.01pg/μl、0.101pg/μl、0.010pg/μl，M为DNA marker D2000)，结果
1-4号有条带出现，表明用PCR方法检测的灵敏度为101pg/μl。由图5和图6检测结果比较得知，本发明结核杆菌的LAMP检测方法可检测到10.1pg/μl，而且钙黄绿素指示剂染色方法及浊度仪检测方法的结果一致，而普通PCR方法能检测到101pg/μl，表明本发明结核杆菌的LAMP检测方法比普通PCR检测方法的灵敏度高10倍。
[0058] 实施例4、制备结核杆菌的LAMP检测试剂盒
[0059] 将LAMP 反 应 体 系 混 合 物( 包 括：20mM Tris·HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，0.1％Tween20，0.8M甜菜碱(betaine)，8mM MgSO4，1.4mM dNTP each，JH164引物组合：40pmol FIP和BIP，20pmol LF和LB，5pmol F3和B3)、Bst DNA聚合酶、双蒸水(阴性对照)、钙黄绿素指示剂(用染色法检测时使用)和结核杆菌的基因组DNA(阳性对照)2μl共同包装，再配以产品使用说明书(记载染色法和浊度法两种检测方法)，得到本发明结核杆菌的LAMP检测试剂盒。