一种Bt蛋白Cry69Aa1、其编码基因及应用转让专利
申请号 : CN201110403674.2
文献号 : CN102408474B
文献日 : 2013-04-10
发明人 : 郑爱萍 , 李平 , 关鹏 , 朱军 , 邓其明 , 李双成 , 王世全
申请人 : 四川农业大学
摘要 :
本发明提供了一种新的Bt蛋白Cry69Aa1及其编码基因，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。本发明蛋白可以用于制备Bt杀虫剂，所述基因可以转化棉花、玉米、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。
权利要求 :
1.一种Bt蛋白Cry69Aa1，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体。
5.由权利要求4所述表达载体转化的宿主细胞。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其为植物宿主细胞。
7.含有权利要求1所述蛋白的杀虫剂，所述杀虫剂对甜菜夜蛾和棉铃虫具有杀虫活性。
8.权利要求1所述蛋白在植物育种中的应用。
9.权利要求1所述蛋白在培育转基因植物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述转基因植物为农作物。
说明书 :
一种Bt蛋白Cry69Aa1、其编码基因及应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Bt蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
[0002] 在人类生产过程中，虫害是造成农业生产损失及影响人类健康的重要因素，据FAO统计，全世界农业生产每年因虫害造成的经济损失高达14％，病害损失达12％，草害损失达11％。损失额高达1260亿美元，相当于中国农业总产值的一半，英国的4倍多。另外，蚊媒病在预防医学中占有重要位置，其中登革热和黄热病等蚊媒病传播力强、流行面广、发病率高、危害性大。据WHO统计，全世界每年感染登革热人数多达8000万，我国的海南省在1980和1986年曾经暴发过两次登革热，发病分别达到437469例和113589例。登革热和黄热病主要由埃及伊蚊传播。
[0003] 为了减少这些损失，多年来，对农作物害虫及蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，农副产品中农药残留量增加，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点。并且避免了化学防治带来的一系列问题。因此，生物防治技术成了人们研究的热点。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。
[0004] 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal crystal proteins，简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要的基因来源。
[0005] 自1981年Schnepf从菌株HD-1中克隆了第一个能表达杀虫活性的基因以来(Adang M.J et al，Gene，1985，36(3)：289～300.)，人们已经分离克隆了500多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N，et al.Microbiol Mol Biol Rev，1998，62：807-813.)。一般而言，Cry1，Cry2和Cry9等毒蛋白对鳞翅目害虫有效；其中研究的最多的是Cry1和Cry9类蛋白，它们编码的杀虫晶体蛋白分子量为130-140kD，许多基因目前已被广泛应用于植物的鳞翅目害虫的防治(Kozie，M.G.，et al.Bio/Technology，1993，11：194-200；王飞，2001，硕士论文，南开大学.)。苏云金芽胞杆菌以色列亚种(B.thuringiensis subsp.israelensis，简称Bti)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性，被广泛运用于蚊虫的防治(Goldberg L J，et al.Mosqito News，37：355-358.)。同时，Cyt蛋白具有溶细胞性，对某些Cry蛋白具有增效作用及延缓昆虫的抗性(Wu，D.，et al.Mol.Microbiol.13：965-972.)。
[0006] 自本世纪初发现苏云金芽胞杆菌至今已有100多年的历史，在农作物和园艺植物害虫、森林害虫以及卫生害虫的防治方面得到广泛的应用，也起到良好的效果。但是，由于大规模和反复使用苏云金芽胞杆菌，许多昆虫种群已相继在不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。以Bt杀虫晶体蛋白为基础的杀虫剂的使用已有50多年的历史，最初一直没有检测到昆虫对Bt的抗性，但是，上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(McGaughey，W.H.1985.Science.229：193-195)，原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodia interpunctella)在Dipel(Bt subsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性(Tabashnik，B.E.，et al.1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91：
4120-4124)，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯夏.1996.昆虫学报，
39(3)：238-244；)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性(Schnepf，E.，et al.Mol.Biol.Rev.65(3)：775-806)。另外，有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问题(Regis L，et al.，2000.Instituto Oswaldo Cruz，95：
207-210.)，但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现(Georghiou G P，and Wirth M C，1997.Applied and Environmental Microbiology，
63：1095-1101.)。
4120-4124)，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯夏.1996.昆虫学报，
39(3)：238-244；)。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性(Schnepf，E.，et al.Mol.Biol.Rev.65(3)：775-806)。另外，有研究证明Bti在大田的使用中尚未发现抗性问题(Regis L，et al.，2000.Instituto Oswaldo Cruz，95：
207-210.)，但是蚊虫对其抗性问题不断在实验室中得到证实，这种情况也可能会在大田中出现(Georghiou G P，and Wirth M C，1997.Applied and Environmental Microbiology，
63：1095-1101.)。
[0007] 为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力基因资源是解决这个问题的有效途径，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。
发明内容
[0008] 本发明的第一个目的在于针对上述不足提供一种新的Bt毒力蛋白资源。
[0009] 本发明的另一个目的在于提供编码所述蛋白的基因。
[0010] 本发明的再一个目的在于提供上述蛋白及基因的应用。
[0011] 本发明从四川省沐川原始森林地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)新菌株MC28。该菌株已于2008年10月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，保藏号为CGMCC No.2719。(该菌株的保藏证明及其保藏号已经在专利号为200910078894.5专利上公开)[0012] 通过对MC28的毒力测试表明，MC28对鳞翅目害虫、双翅目害虫等等，均具有极高的毒力。从MC28基因组及质粒测序结果中发现该菌株存在一个新的cry基因，进一步设计其全长基因引物，克隆得到cry69Aa1基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示，全长为3651bp，分析表明，GC含量为38.07％，编码1216个氨基酸组成的蛋白。经测定，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。在softberry网站采用bacterial sigma 7.0promoter程序对全序列进行预测表明，在基因编码区上游含有RNA聚合酶活化位点的序列，将其命名为cry69Aa1。Cry69Aa1蛋白的氨基酸组成如表1。
[0013] 表1 Cry69Aa1蛋白的氨基酸组成
[0014]氨基酸 百分比％ 氨基酸 百分比％
Ala(A)： 5.84 Met(M)： 1.64
Cys(C)： 1.15 Asn(N)： 8.55
Asp(D)： 4.93 Pro(P)： 4.77
Glu(E)： 6.00 Gln(Q)： 4.03
Phe(F)： 4.19 Arg(R)： 5.35
Gly(G)： 6.41 Ser(S)： 7.40
His(H)： 2.80 Thr(T)： 6.66
Ile(I)： 6.58 Val(V)： 6.09
Lys(K)： 4.03 Trp(W)： 1.48
Leu(L)： 8.06 Tyr(Y)： 4.03
Ala(A)： 5.84 Met(M)： 1.64
Cys(C)： 1.15 Asn(N)： 8.55
Asp(D)： 4.93 Pro(P)： 4.77
Glu(E)： 6.00 Gln(Q)： 4.03
Phe(F)： 4.19 Arg(R)： 5.35
Gly(G)： 6.41 Ser(S)： 7.40
His(H)： 2.80 Thr(T)： 6.66
Ile(I)： 6.58 Val(V)： 6.09
Lys(K)： 4.03 Trp(W)： 1.48
Leu(L)： 8.06 Tyr(Y)： 4.03
[0015] 应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将某个氨基酸替换为其它氨基酸。例如在非活性区段，将第1180位的Thr替换为Ser，将第1197位的Gly替换为Ala，将第1201位的Gly缺失，将第1107位增加一个Ala或增加Gly，不影响其活性。因此，本发明Bt蛋白还包括SEQ ID No.2所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有Cry69Aa1蛋白同等活性的由Cry69Aa1衍生得到的蛋白质。
[0016] 本发明提供了编码上述Bt蛋白Cry69Aa1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0017] 此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
[0018] 本发明的基因和蛋白质可以从菌株MC28中克隆或分离得到，或者通过DNA或肽合成的方法得到。
[0019] 可将本发明基因与表达载体可操作地连接，得到能够表达本发明蛋白的重组表达载体，进而可以通过诸如农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表达载体导入宿主，得到转cry69Aa1基因的转化体，例如农作物或者果树等植物，使其具备抗虫活性。
[0020] 此外，还可以通过发酵本发明菌株MC28，得到含有Cry69Aa1蛋白的发酵液，将其制备成杀虫剂，用于农作物害虫的防治。本领域技术人员还可以将上述基因转化细菌或真菌，通过大规模发酵生产本发明Bt蛋白。
[0021] 本发明还提供了Bt蛋白Cry69Aa1在植物育种中的应用。
[0022] 本发明提供了Bt蛋白Cry69Aa1在培育转基因植物中的应用。
[0023] 本领域技术人员还可以根据本发明公开的基因，将其转化到各种农作物中，如棉花、玉米、水稻、油菜、辣椒，使其具备相应的抗虫活性。从而降低农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。例如：利用密码子的简并性，将cry69Aa1基因设计具有水稻偏好密码子的基因序列，再将合成的cry69Aa1基因序列与载体pCAMBIA1300连接，通过农杆菌介导转入到水稻基因组中，从而得到具有抗虫活性的转基因水稻品种。
[0024] 本发明提供Cry69Aa1蛋白是一种新的Bt蛋白，具有较好的杀虫活性，将其用于制备转基因植物，能够特异性杀灭害虫，并降低农药的使用量，降低成本，减少环境污染。目前还没有害虫或昆虫对该蛋白产生抗性的报道，因此，本发明的Bt蛋白Cry69Aa1具有重要的经济价值和应用前景，适合大规模应用于提高植物的抗虫性中。
附图说明
[0025] 图1为本发明克隆得到的cry69Aa1全长基的凝胶电泳图，其中M，DNA marker；1，cry69Aa1基因。
[0026] 图2显示的是重组质粒pET-69Aa的酶切鉴定图谱，其中1，重组质粒pET-69Aa；2，重组质粒pET-69Aa的EcoR I+Sal I双酶切产物；3，插入的DNA；M，DNAmarker。
[0027] 图3显示的是cry69Aa1基因在E.coli BL21(DE3)中的SDS-PAGE检测图；其中M，蛋白marker；1，含有重组质粒pET-69Aa的E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导后菌体裂解液；2，含有重组质粒pET-69AaE.coli BL21(DE3)未经IPTG诱导菌体裂解液；3，含有pET-28a的E.coli BL21(DE3)表达蛋白。
具体实施方式
[0028] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0029] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0030] 实施例1 cry69Aa1基因的克隆
[0031] 本发明从四川省沐川原始森林地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)新菌株，该菌株已于2008年10月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，保藏号为CGMCC No.2719。
[0032] 本例通过如下方法克隆得到cry69Aa1基因的全长序列。
[0033] 采用基因组DNA纯化试剂盒(购自赛百盛公司)提取菌株BtMC28的总DNA。设计引物序列如下：
[0034] P1：5’ATGAATGGAGGAGAGAAGATGAAT 3’
[0035] P2：5’TTATTGGCTCTTCATACAAATC 3’
[0036] PCR反应体系：
[0037]
[0038] 热循环反应：94℃预变性5min；94℃变性50s，54℃退火50s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。扩增反应产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察PCR扩增结果。结果如图1所示，通过扩增得到了约为3600bp的序列，将该序列进行测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，与目的序列一致。
[0039] 实施例2 cry69Aa1基因的表达及杀虫活性测定
[0040] 根据cry69Aa1基因开放阅读框两端序列，设计并合成一对特异引物cry69F：5′-CGGAATTCATGAATGGAGGAGAGAAGAT-3′cry69R：5′-CGCGTCGACTTATTGGCTCTTCATACAAA-3′，分别在5’端引物加EcoR I和Sal I酶切位点，EcoR I和Sal I酶切位点用下划线标出。以MC28总DNA为模板进行扩增，反应程序和扩增条件同实施例1，扩增的产物采用EcoR I和Sal I进行双酶切，酶切产物与同样进行双酶切后的载体pET-28a(+)连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，提取其质粒酶切电泳验证了插入片断大小符合预期目的后(图
2)，再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)。将重组质粒命名为pET-69Aa，含重组质粒的重组子命名为E.coli.BL21(69Aa)。将阳性转化子于LB培养基中，在200r/min、37℃过夜培养，再将培养液按照1∶100的比例转接到含有400mLLB培养液的1L三角瓶中，200r/min、37℃培养，当培养液的OD值达到0.6-0.8时，加入0.6mmol/L IPTG进行诱导表达20h，离心培养液收集菌体，弃上清，加入30mL 10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)超声波破碎，用SDS-PAGE对表达蛋白进行检测。
2)，再转入受体菌E.coli.BL21(DE3)。将重组质粒命名为pET-69Aa，含重组质粒的重组子命名为E.coli.BL21(69Aa)。将阳性转化子于LB培养基中，在200r/min、37℃过夜培养，再将培养液按照1∶100的比例转接到含有400mLLB培养液的1L三角瓶中，200r/min、37℃培养，当培养液的OD值达到0.6-0.8时，加入0.6mmol/L IPTG进行诱导表达20h，离心培养液收集菌体，弃上清，加入30mL 10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)超声波破碎，用SDS-PAGE对表达蛋白进行检测。
[0041] SDS-PAGE分析表明cry69Aa1基因的表达产物在菌体超声破碎后的沉淀中(图3)，分子量约为130kDa左右，与预测的蛋白分子量相符。
[0042] 实施例3 杀虫活性测定
[0043] Cry69Aa1基因表达产物分别对甜菜夜蛾，棉铃虫及伊蚊的进行杀虫活性测定。首先将获得的Cry69Aa1蛋白配制成从1μg/ml到100μg/ml 6个不同浓度，选老嫩适中的卷2
心菜叶片洗净，晾干；紫外灯下照射15min，剪成2×2cm 大小，分放在不同浓度Cry69Aa1蛋白液中，浸泡5min；取出沥去多余的液体，放在消毒的培养皿中晾干，以LB液体培养基浸泡的叶片作为对照，每个培养皿放4片叶片；每个培养皿选放健康的2-3龄棉铃虫(或甜菜夜蛾)30头；每处理重复3次，置室内，于3d后观察幼虫死亡情况，用SPSS 10.0软件计算LC50。
心菜叶片洗净，晾干；紫外灯下照射15min，剪成2×2cm 大小，分放在不同浓度Cry69Aa1蛋白液中，浸泡5min；取出沥去多余的液体，放在消毒的培养皿中晾干，以LB液体培养基浸泡的叶片作为对照，每个培养皿放4片叶片；每个培养皿选放健康的2-3龄棉铃虫(或甜菜夜蛾)30头；每处理重复3次，置室内，于3d后观察幼虫死亡情况，用SPSS 10.0软件计算LC50。
[0044] 结果表明(表1)：表达产物对这两种虫都具有较好的杀虫活性。对棉铃虫半致死浓度LC50为25.77μg/mL；对甜菜夜蛾的LC50为22.07μg/mL。E.coli.BL21(DE3)作为阴性对照，生测结果表明，E.coli.BL21(DE3)对以上三种昆虫不具杀虫活性。
[0045] 表1 Cry69Aa1对三种昆虫的杀虫活性
[0046]
[0047] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。