本发明涉及一种DiI显微颗粒简易制作及其标记神经元的方法，其中DiI显微颗粒简易制作方法包括以下步骤：将DiI颗粒溶解于纯乙醇或二甲基亚砜中，形成质量体积浓度为0.01～0.1g/mL DiI溶液；将0.01～0.1g/mL DiI溶液加入人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液中；DiI溶液迅速以薄膜形式漂浮于人工脑脊液或磷酸盐缓冲液上，并向四周移动、扩散，析出粒径为3-10微米的DiI显微颗粒。本发明方法操作简单，成本低。
1.一种DiI显微颗粒简易制作方法，其特征在于，包括以下步骤：将DiI颗粒溶解于纯乙醇或纯二甲基亚砜中，形成0.01～0.1g/mL DiI溶液；
将DiI溶液加入人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，DiI溶液迅速以薄膜形式漂浮于人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液上，析出粒径3-10微米的DiI显微颗粒。
2.如权利要求1所述的一种DiI显微颗粒简易制作方法，其特征在于，将DiI溶液分次加入人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，一次加入1-5微升。
3.如权利要求2所述的一种DiI显微颗粒简易制作方法，其特征在于，将DiI溶液装入玻璃微电极中，将玻璃微电极的尖端伸入人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，使用微量注射仪脉冲式一次推入1-5微升DiI溶液。
4.如权利要求3所述的一种DiI显微颗粒简易制作方法，其特征在于，玻璃微电极的尖端内径为50-200微米。
5.一种DiI显微颗粒标记神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：
在固定于载玻片上的脑片上滴加人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液，形成人工脑脊液层或0.1mol/L磷酸盐缓冲液层；然后，将0.01～0.1g/mL DiI溶液加入人工脑脊液层或0.1mol/L磷酸盐缓冲液层中；DiI溶液会迅速以薄膜形式漂浮于人工脑脊液层或
0.1mol/L磷酸盐缓冲液层上，析出粒径3-10微米的DiI显微颗粒；
使用尖端封闭的玻璃管微电极，将步骤1）制作好的DiI颗粒压入脑片的脑组织内；然后，以人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液清洗脑片或用软毛笔轻轻刷拭以去除附在脑片表面的DiI颗粒；
所述0.01～0.1g/mL的DiI溶液为DiI颗粒溶解于纯乙醇或纯二甲基亚砜中形成。
6.如权利要求5所述的一种DiI显微颗粒标记神经元的方法，其特征在于，步骤1）中的脑片在滴加人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液前，使用0.015～0.02g/mL的多聚甲醛固定液进行固定。
7.如权利要求5所述的一种DiI显微颗粒标记神经元的方法，其特征在于，还包括以下步骤：
将埋入DiI颗粒的脑片避光存放于0.01～0.02g/mL多聚甲醛固定液中，于37℃烘箱或室温下孵育1-4天。
8.如权利要求5所述的一种DiI显微颗粒标记神经元的方法，其特征在于，步骤1）形成的人工脑脊液层或0.1mol/L磷酸盐缓冲液层的厚度为200-500微米。
9.如权利要求5所述的一种DiI显微颗粒标记神经元的方法，其特征在于，步骤1）中将0.01～0.1g/mL DiI溶液分次加入人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，一次加入
10.如权利要求9所述的一种DiI显微颗粒标记神经元的方法，其特征在于，步骤1）中通过将0.01～0.1g/mL的DiI溶液装入玻璃微电极中，将玻璃微电极的尖端伸入人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，使用微量注射仪脉冲式一次推入1-5微升的DiI溶液。
DiI显微颗粒简易制作及其标记神经元的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学实验领域，适用于生理、病理条件下动物的离体脑片上特定脑区神经元标记，以便对神经元形态及其变化、神经元树突棘数目等进行显微观察、定性和定量分析。【背景技术】
[0002] 以荧光染料标记特定脑部位神经元，并借助荧光显微镜或激光共聚焦显微镜对这些标记的神经元进行形态学定性或树突棘的量化研究，对于分析神经元之间联系、神经信号处理、神经系统疾病病理都是不可或缺的生物医学实验技术，几乎所有进行神经科学研究的实验室都需要应用此类技术。亲脂性羰花青染料（lipophilic carbocyanine dyes）能够清晰标记神经元形态细节，是在神经科学实验中十分重要而常用的一类荧光示踪剂。此类荧光染料包括种类较多，具有极强的亲脂特性，当以合适的技术给予脑组织后，它们会接触到细胞膜，掺入其中并沿着细胞膜扩散，从而完整地勾勒出细胞轮廓，达到标记、显示神经元的目的。
[0003] DiI（英 文：1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate）就是最常用的一种亲脂性羰花青染剂。目前，应用DiI标记神经元时，常采用向组织注射溶液或埋入固体两种形式进行给药。如果使用注射溶液的方法给药，则DiI与其它非羰花青类神经元示踪剂在具体给药技术和神经元标记效果等方面没有太大差异。但是，当将固体DiI埋入活的或固定的离体脑切片后，则该染料可以十分清晰显示单个神经元形态，藉此可以对神经元进行动态或静态观察，分析神经元树突棘的形态、数目变化等。此类技术应用十分广泛，在标记神经元方面具有其它标记技术所无法比拟的优点。然而，该技术的关键是：埋入脑组织中的DiI荧光染料颗粒要尽可能小，只有当其大小在数个微米的条件下，才可能高清晰的标记出单个神经元。如若埋入脑组织的DiI染料颗粒过大，显微镜下只能观察到以固体染料为中心的波及较大脑组织范围的超强荧光区域，根本不能显示单个神经元形态。因此，如何得到DiI的显微颗粒，就成了制约该类实验成功的瓶颈。
[0004] 目前，医药公司生产的DiI颗粒体积过大（大者可达到数个毫米大小甚至更大），根本不能直接用于以固体颗粒埋入脑组织的方法标记单个神经元。为保证DiI的标记效果，实验者只能从购买的DiI晶体中（或将购买的DiI机械研磨）于显微镜下挑选出尽可能小的晶体颗粒。条件好的实验室会自己制作染料“枪弹”。其基本步骤是首先用DiI包裹微米级的钨微粒，制成染料的“枪弹”，并装入专门制作的“基因枪”内，再将染料“枪弹”射入特定脑结构内，标记神经元。这一技术的缺点是“枪弹”制作过程复杂、成本高、技术难度较大并需要“基因枪”。因此，研究人员希望有一种简便易行、成本低廉、操作方便的制作DiI显微颗粒的技术并用之高质量标记神经元技术。【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种成本低、便于操作和实现的DiI显微颗粒制作方法以及利用这些颗粒高质量显示单个神经元形态的生物医学方法。
[0006] 为了实现上述目的，本发明一种DiI显微颗粒简易制作方法采用如下技术方案：
[0007] 一种DiI显微颗粒简易制作方法，包括以下步骤：
[0008] 将DiI颗粒溶解于纯乙醇或纯二甲基亚砜中，形成0.01～0.1g/mLDiI溶液；
[0009] 将DiI溶液加入人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，DiI溶液迅速以薄膜形式漂浮于人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液上，析出粒径3-10微米的DiI显微颗粒。
[0010] 将DiI溶液分次加入人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，一次加入1-5微升。
[0011] 将DiI溶液装入玻璃微电极中，将玻璃微电极的尖端伸入人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，使用微量注射仪脉冲式一次推入1-5微升DiI溶液。
[0012] 玻璃微电极的尖端内径为50-200微米。
[0013] 为了实现上述目的，本发明一种DiI显微颗粒标记神经元的方法采用如下技术方案：
[0014] 一种DiI显微颗粒标记神经元的方法包括以下步骤：
[0015] 1）DiI显微颗粒制作
[0016] 在固定于载玻片上的脑片上滴加人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液，形成人工脑脊液层或0.1mol/L磷酸盐缓冲液层；然后，将0.01～0.1g/mL DiI溶液加入人工脑脊液层或0.1mol/L磷酸盐缓冲液层中；DiI溶液会迅速以薄膜形式漂浮于人工脑脊液层或0.1mol/L磷酸盐缓冲液层上，析出粒径3-10微米的DiI显微颗粒；
[0017] 2）DiI显微颗粒埋入
[0018] 使用尖端封闭的玻璃管微电极，将步骤1）制作好的DiI颗粒压入脑片的脑组织内；然后，以人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液清洗脑片或用软毛笔轻轻刷拭以去除附在脑片表面的DiI颗粒；
[0019] 所述0.01～0.1g/mL的DiI溶液为DiI颗粒溶解于纯乙醇或纯二甲基亚砜中形成。
[0020] 步骤1）中的脑片在滴加人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液前，使用0.015～0.02g/mL的多聚甲醛固定液进行固定。
[0021] 3）脑片孵育
[0022] 将埋入DiI颗粒的脑片避光存放于0.01～0.02g/mL多聚甲醛固定液中，于37℃烘箱或室温下孵育1-4天。
[0023] 步骤1）形成的人工脑脊液层或0.1mol/L磷酸盐缓冲液层的厚度为200-500微米。
[0024] 步骤1）中将0.01～0.1g/mL DiI溶液分次加入人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，一次加入1-5微升。
[0025] 步骤1）中通过将0.01～0.1g/mL的DiI溶液装入玻璃微电极中，将玻璃微电极的尖端伸入人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，使用微量注射仪脉冲式一次推入1-5微升的DiI溶液。
[0026] 相对于现有技术，本发明具有以下优点：本发明DiI显微颗粒简易制作及其标记神经元的方法，通过将购买得到的大颗粒的DiI颗粒溶于纯乙醇或纯二甲基亚砜中形成质量体积浓度为0.01～0.1g/mL DiI溶液，然后将DiI溶液滴入与乙醇或二甲基亚砜互不相溶的人工脑脊液或磷酸盐缓冲液中，使DiI溶液迅速以薄膜形式漂浮于人工脑脊液或磷酸盐缓冲液上，并向四周移动、扩散析出细小的DiI显微颗粒，该方法操作简单、成本低；本发明的关键在于控制DiI溶液的浓度和滴入人工脑脊液或磷酸盐缓冲液中体积来控制析出的DiI显微颗粒的粒径在3-10微米，以方便进行神经元标记；在脑片上形成的人工脑脊液层或磷酸盐缓冲液层的厚度控制在200-500微米，可以使形成的DiI显微颗粒附着于脑组织表面，不会因为人工脑脊液层或磷酸盐缓冲液层厚度过大，随着内部液体的流动被带到不需要标记的脑组织部位。【附图说明】
[0027] 图1为振动切片机切取的活或固定的离体脑片示意图。
[0028] 图2为离体脑片平铺置于载玻片上的示意图。
[0029] 图3显示离体脑片上覆盖一层aCSF液体或0.1mol/L磷酸盐缓冲液，预先装好DiI溶液的玻璃微电极尖端置于aCSF液体或磷酸盐缓冲液中，迅速排出少量液体，并产生微小DiI颗粒。
[0030] 图4显示封闭的玻璃微电极尖端将DiI微颗粒压入离体脑片内。【具体实施方式】
[0031] 以下结合附图和发明人给出的具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0032] 请参阅图1至图4所示，DiI显微颗粒标记神经元方法包括4个步骤，即脑片制作、DiI颗粒制作、DiI颗粒埋入和脑片孵育。
[0033] （1）脑片制作。
[0034] 用以标记神经元的脑片可以是活或固定的脑片，分别参照脑片膜片钳或免疫组织化学脑片制作技术进行。两种脑片均必需以振动切片机切片，片厚200-350微米。活的脑片切下后于通氧的人工脑脊液(arificial cerebrospinal fluid,aCSF)孵育，而固定的离体脑片则放于质量体积浓度为0.015～0.02g/mL的多聚甲醛固定液中。
[0035] （2）DiI显微颗粒制作。
[0036] 对于已经固定的脑片1，将切好的脑片1平放于载玻片2上，并在其上滴加少量人工脑脊液3（或0.1mol/L磷酸盐缓冲液），滴加的液体量以浸没整个脑片为准。然后，快速倾斜载玻片以倾去脑片上的人工脑脊液（或磷酸盐缓冲液），或用吸水纸在脑片边缘吸去多余的液体，使脑片上覆盖一薄层（200-500微米后）液体即可（脑片上不能有肉眼可见的流动液体）。最后，在体视显微镜或倒置显微镜下，将事先注入质量体积浓度为0.01～0.1g/mL DiI溶液（以纯乙醇或纯二甲基亚砜DMSO作溶剂，0.01～0.1g DiI颗粒溶于1mL纯乙醇或纯二甲基亚砜DMSO中；浓度可以依据具体情况调节，浓度愈高形成的颗粒体积愈大）的玻璃微电极4的（尖端内径50-200微米）尖端贴近“靶”神经元所在脑部位的切片表面，但不进入该部位的脑片组织，在电极尖端达到目的位置后，立即用微量注射仪（picospritzer）脉冲式推出1-5微升DiI溶液，由于遇到不相溶的液体，此时DiI溶液会迅速以薄膜形式漂浮于人工脑脊液（或磷酸盐缓冲液）上，并向四周移动、扩散形成粒径3-10微米的DiI显微颗粒。至此，DiI显微颗粒便制作成功。根据标记的面积，可以通过微量注射仪重复分次注入1-5微升DiI溶液，以形成足够多的DiI晶体颗粒。如果没有微量注射仪，也可用其它方法使DiI溶液从电极内流出（比如用电极蘸取一点DiI溶液（1-5微升），然后迅速将电极尖端放置在“靶”神经元所在脑部位，DiI溶液会靠重力和扩散作用，离开电极并形成DiI晶体颗粒）。对于活的脑片，可将脑片置于小培养皿中，并加入已通氧的aCSF液体使其刚好没过脑片，然后依照上述方法制作DiI显微颗粒。
[0037] （3）DiI显微颗粒埋入。
[0038] 预先拉制好尖端直径为20-50微米左右的玻璃管微电极5，并将电极尖端以高温加热封闭。体视显微镜或倒置显微镜下定位要标记的神经元所在的脑部位，选择位于靶区域表面的DiI颗粒，以电极尖端轻轻触压，将其埋入脑组织内。最后，以aCSF或0.1mol/L磷酸盐缓冲液清洗脑片或用软毛笔轻轻刷拭以去除附在脑片表面的DiI颗粒。
[0039] （4）将含DiI的活脑片浸于通氧的aCSF（活脑片）中避光孵育1天，然后浸于质量体积浓度为0.01～0.02g/mL多聚甲醛固定液中2小时后，裱片观察。如为固定液固定的脑片，则直接将埋入DiI颗粒的脑片避光存放于质量体积浓度为0.01～0.02g/mL多聚甲醛固定液中，于37℃烘箱或室温下孵育1-4天，而后裱片并于激光共聚焦显微镜下观察。
[0040] 本发明中单独制作DiI显微颗粒，可以将质量体积浓度为0.01～0.1g/mL DiI溶液（以纯乙醇或纯二甲基亚砜作溶剂）滴入人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，每次滴入1-5微升，DiI溶液迅速向四周移动、扩散析出粒径3-10的DiI显微颗粒。
