一株降解酞酸酯的真菌及其应用转让专利
申请号 : CN201110331007.8
文献号 : CN102409000B
文献日 : 2012-10-31
发明人 : 蔡信德 , 郭杨 , 韩蕊 , 杜文婷 , 杨子江 , 李诗殷
申请人 : 环境保护部华南环境科学研究所
摘要 :
本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，公开了一株降解酞酸酯的真菌及其在受污染土壤生物处理和环境污染修复中的应用。一株降解酞酸酯的真菌是棒束梗霉(Isaria sp.)F3CCTCC No.M 2011299。棒束梗霉(Isaria sp.)F3在纯培养条件下7天内对邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)三种酞酸酯的混合体系的总降解率为52.7～66.2％，其中DMP降解率61.5～78.4％、DEP 53.7～68.1％、DOP 29.5～53.7％。30d内将灭菌土壤中300mg/kgPAEs降解69.0％，可显著提高DMP、DEP、DOP复合污染土壤植物修复的效率。与其它菌株相比，该菌株具有高效的酞酸酯降解能力。
权利要求 :
1.一株降解酞酸酯的真菌，是棒束梗霉（Isaria sp.）F3CCTCC No.M2011299，已于2011年8月29日在位于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏。
2.权利要求1所述的真菌在降解酞酸酯中的应用，其特征在于：所述的酞酸酯为邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯或邻苯二甲酸二正辛酯中的一种以上。
说明书 :
一株降解酞酸酯的真菌及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体涉及一株降解酞酸酯的真菌及其在受污染土壤生物处理和环境污染修复中的应用。
背景技术
[0002] 邻苯二甲酸酯又名酞酸酯(phthalic acid esters，PAEs)，是由一个刚性平面芳烃和两个可塑的非线性脂肪侧链组成，通常用酞酸酐与各种醇类之间的酯化反应获得。
[0003] PAEs广泛存在于水体、土壤及空气中。随着塑料薄膜的广泛农用，以及大量城镇污水和垃圾被排放到农田，酞酸酯(phthalic acid esters，PAEs)已成为农田土壤中最常见的有机污染物之一，是“第二个全球性PCB污染物”。由于PAEs的雌激素效应，以及致畸、致癌和致突变特性，对生态环境、食品安全和人体健康构成严重威胁。人类通过皮肤、呼吸、食物链等途径长期接触环境雌激素PAEs，可对人体造成慢性危害，主要表现为生殖毒性。美国EPA已经列出了6种PAEs作为优控物。在我国环境优先污染物中有3种肽酸酯化合物：邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)。因此，修复PAEs污染的水土环境已成为研究的热点。
[0004] 尽管PAEs能够通过物理作用、臭氧氧化、紫外光解等途径降解和转移，但是微生物降解是环境界中PAEs矿化的主要途径。生物修复被认为是目前去除环境中有机物的最经济有效的方法。
[0005] 近年来，PAEs的细菌降解已得到广泛研究，但真菌降解PAEs的报道较少。与细菌相比，丝状真菌具有较强的穿透力，可深入接触土壤颗粒内部污染物，因而对污染物的降解率会较高；另外，菌丝生长可将土壤穿出众多微小孔隙，有利于营养物质流通。利用丛枝菌根真菌(AM)可以促进PAEs在土壤中的降解、降低其在植物中的残留，但是AM需与特殊寄主植物的根系结合这一特性将限制这一技术的广泛应用，对于根系未能接触到的土壤中的污染物来说，可能降解困难。另外，目前以单一PAE为降解对象的报道较多，但对于实际土壤环境而言，PAE污染往往是多种单体同时存在的复合污染，生物修复过程将由于污染物之间的相互作用、以及微生物与植物共同作用等变得更为复杂。
发明内容
[0006] 针对现有PAEs污染土壤、水体环境修复技术中存在的不足，本发明的首要目的在于提供一株能高效、快速降解PAEs的真菌。
[0007] 本发明的另一目的在于提供上述真菌在污染土壤生物处理和环境污染修复中的应用。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0009] 一株降解酞酸酯的真菌，是棒束梗霉(Isaria sp.)F3，已于2011年8月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉市武汉大学内)，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC No.M 2011299。
[0010] 上述的菌株F3来源于广东省某地PAEs污染农田的耕层(0～20cm)土，经人工富集、筛选及纯化所得到，菌株命名为F3。该菌株具有以下分类学特征：在察氏培养基培养7d菌落直径2.5cm，丝绒状至毛状，米黄色，反面桔黄色；在PDA培养基培养7d菌落直径4cm，丝绒状至毛状，米白色，反面桔黄色；在查氏酵母膏琼脂培养基培养7d直径2.5-3.0cm，绒毛状，白色，反面桔黄色。电子显微镜下观察，该菌株菌体的形态为气生菌丝透明，分生孢子单细胞，长椭圆形至棱形、细柱形。此外，该菌株的18S rDNA序列与Isaria(棒束梗霉属)的同源性达97.1％。结合以上分类学形态特征和18S rDNA序列的比对结果，该菌株命名为棒束梗霉(Isaria sp.)F3。
[0011] 将棒束梗霉(Isaria sp.)F3用于降解酞酸酯(phthalic acid esters，PAEs)：棒束梗霉(Isaria sp.)F3在纯培养条件下7天内对邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)三种酞酸酯的混合体系的总降解率为52.7～
66.2％，其中DMP降解率61.5～78.4％、DEP 53.7～68.1％、DOP 29.5～53.7％。30d内将灭菌土壤中300mg/kgPAEs降解69.0％，可显著提高DMP、DEP、DOP复合污染土壤植物修复的效率。与其它菌株相比，该菌株具有高效的酞酸酯降解能力。
66.2％，其中DMP降解率61.5～78.4％、DEP 53.7～68.1％、DOP 29.5～53.7％。30d内将灭菌土壤中300mg/kgPAEs降解69.0％，可显著提高DMP、DEP、DOP复合污染土壤植物修复的效率。与其它菌株相比，该菌株具有高效的酞酸酯降解能力。
[0012] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0013] 棒束梗霉(Isaria sp.)F3对邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)三种酞酸酯的混合体系的总降解率为52.7～66.2％，其中DMP降解率61.5～78.4％、DEP 53.7～68.1％、DOP 29.5～53.7％。30d内将灭菌土壤中300mg/kgPAEs降解69.0％，可显著提高DMP、DEP、DOP复合污染土壤植物修复的效率。与其它菌株相比，该菌株具有高效的酞酸酯降解能力。
附图说明
[0014] 图1是棒束梗霉(Isaria sp.)F3对混合体系中酞酸酯的降解效果。
[0015] 图2是棒束梗霉(Isaria sp.)F3对土壤介质中酞酸酯的降解效果。
[0016] 图3是棒束梗霉(Isaria sp.)F3与植物联合作用对土壤介质中酞酸酯的降解效果。
具体实施方式
[0017] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0018] 实施例1
[0019] 棒束梗霉(Isaria sp.)F3的筛选分离和鉴定及其对酞酸酯降解性能
[0020] 称取受PAEs污染的新鲜水稻土10g，装入有90mL去离子水、3g玻璃珠的250mL三角瓶，30℃、180r/min振荡30min，静置30min。然后取10mL上清液，加入含有140mL PAEs的真菌培养基(MYEA)(其配方为：麦芽膏提取物0.2％；酵母膏提取物0.2％，余量为0.02％氯霉素溶液，调节pH值为7.0即可；若配成固体培养基则加入2％琼脂；所述百分比为质量体积比)中进行3次梯度驯化。每个梯度3种PAEs(DMP、DEP和DOP)浓度依次为200、400、600mg/L(PAEs总浓度600、1200、1800mg/L)，每次取10mL菌液转入140mL新鲜培养基中，
30℃、120r/min培养7d，加入0.02％氯霉素抑制细菌生长。最后取1mL菌液平板涂布(真菌培养基)，30℃培养7d，将不同形态的菌落分别平板划线得到单菌落，斜面保存。
30℃、120r/min培养7d，加入0.02％氯霉素抑制细菌生长。最后取1mL菌液平板涂布(真菌培养基)，30℃培养7d，将不同形态的菌落分别平板划线得到单菌落，斜面保存。
[0021] 该菌株具有以下分类学特征：在察氏培养基培养7d菌落直径2.5cm，丝绒状至毛状，米黄色，反面桔黄色；在PDA培养基培养7d菌落直径4cm，丝绒状至毛状，米白色，反面桔黄色；在查氏酵母膏琼脂培养基培养7d直径2.5-3.0cm，绒毛状，白色，反面桔黄色。电子显微镜下观察，该菌株菌体的形态为气生菌丝透明，分生孢子单细胞，长椭圆形至棱形、细柱形。此外，该菌株的18S rDNA序列与Isaria(棒束梗霉属)的同源性达97.1％。该菌株18S rDNA的测序由上海英骏生物技术有限公司负责，其序列见序列表。
[0022] 结合以上分类学形态特征和18S rDNA序列的比对结果，证实该菌株为棒束梗霉(Isaria sp.)F3。
[0023] 实施例2
[0024] 棒束梗霉(Isaria sp.)F3对酞酸酯的降解
[0025] 接种环挑取筛选出的真菌，分别接入5g/L葡萄糖溶液，摇床30℃、120r/min培养36h诱导孢子萌发和菌丝生长。分光光度计测定菌液660nm处的OD值，适当稀释使其浓度一致(OD660≈0.8)。将10mL菌液加入90mL PAEs无机盐培养基(3种PAEs浓度分别为0、
25、50、75、100mg/L，总浓度0、75、150、225、300mg/L)，25℃、120r/min培养7d，以不接种的PAEs无机盐培养基为非生物降解对照。每个处理进行3个平行样，均在无菌条件下操作。
7d后取样分析培养液中的PAHs含量及生物量。实验结果见图1。
25、50、75、100mg/L，总浓度0、75、150、225、300mg/L)，25℃、120r/min培养7d，以不接种的PAEs无机盐培养基为非生物降解对照。每个处理进行3个平行样，均在无菌条件下操作。
7d后取样分析培养液中的PAHs含量及生物量。实验结果见图1。
[0026] 在不同浓度条件下，F3对3种PAEs降解率的大小顺序均是DMP＞DEP＞DOP；在纯培养条件下7d内对邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)三种酞酸酯的混合体系的总降解率为52.7～66.2％，其中DMP降解率61.5～78.4％、DEP 53.7～68.1％、DOP 29.5～53.7％。
[0027] 本实施例说明分离所得到的棒束梗霉(Isaria sp.)F3对三种酞酸酯混合物具有较好的降解能力。
[0028] 实施例3
[0029] 生长因子对棒束梗霉(Isaria sp.)F3降解效果的影响
[0030] 1、选取PAEs浓度、C∶N和pH作为影响因子((NH4)2SO4为N源)，设计成L27(33)正交实验，表头如表1所示。
[0031] 2、向一系列装有50mL不同碳氮比的PAEs无机盐培养基的锥形瓶中接入数量相同的优势真菌孢子(OD660≈0.8)，设3个重复；用未接种的PAEs无机盐培养基为对照。振荡培养(120rpm，25℃)7d，测定∑PAEs的降解率和菌液pH值，结果如表2所示。
[0032] 上述无机盐培养基的配制方法为(g·L-1)：KH2PO4 1.0g/L，(NH4)2SO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，CaCl2 0.1g/L，FeCl3 0.01g/L，pH 7.0；蒸馏水定容至1.0L，pH 7.0，121℃蒸汽灭菌30min。
[0033] 表2的结果表明：棒束梗霉(Isaria sp.)F3在条件为pH值7.0、C∶N为20∶1时对PAEs的降解效果较好。试验结束时，菌液pH在5.0-7.0的范围。
[0034] 本实施例说明，本发明的棒束梗霉(Isaria sp.)F3对PAEs具有较强的耐受能力和较宽的pH适用范围(5.0-9.0)。
[0035] 表1生长因子对棒束梗霉(Isaria sp.)F3降解效果影响正交试验的表头设计[0036]
[0037] 表2棒束梗霉(Isaria sp.)F3在不同条件下对酞酸酯的降解效果
[0038]
[0039] 实施例4
[0040] 棒束梗霉(Isaria sp.)F3对酞酸酯人工污染土壤的降解效果
[0041] 1.试验用土壤取自华南农业大学农场水稻田耕作层，经风干、碾碎后过5.0mm筛。土壤有机质含量为2.32％，TN含量为0.10％，TP含量为0.073％，TK含量为2.00％，pH
5.56，质地为中壤土。
5.56，质地为中壤土。
[0042] 2.上述土壤经进一步碾碎过0.8mm和0.3mm筛。取少量过0.3mm筛的土壤，加入5g/L PAEs储备液，使3种PAEs浓度均为1000mg/kg(总浓度3000mg/kg)，待溶剂挥发后与未污染土混合，制成5个浓度的人工污染土壤(3种PAEs浓度均依次达到0、25、50、75、
100mg/kg，总PAEs浓度为0、75、150、225、300mg/kg)。每个样品50g，设3个平行，装入洁净玻璃培养皿中，以相应浓度的不接种土壤为对照，所有样品一天内121℃灭菌2次，每次
20min。菌种用液体真菌培养基扩大培养7d(25℃，120r/min)，菌液(OD660≈0.8)按1％(质量比)接种培养皿。根据实施例2的结果，用灭菌NH4SO4溶液调节C∶N，1mol/L NaOH调节pH值，混合均匀后补充无菌水，使含水量保持在30％，对照组只添加无菌水。培养皿
25℃避光培养30d。30d后取土样10g左右，冷冻干燥均质化，测定PAEs残余浓度。
100mg/kg，总PAEs浓度为0、75、150、225、300mg/kg)。每个样品50g，设3个平行，装入洁净玻璃培养皿中，以相应浓度的不接种土壤为对照，所有样品一天内121℃灭菌2次，每次
20min。菌种用液体真菌培养基扩大培养7d(25℃，120r/min)，菌液(OD660≈0.8)按1％(质量比)接种培养皿。根据实施例2的结果，用灭菌NH4SO4溶液调节C∶N，1mol/L NaOH调节pH值，混合均匀后补充无菌水，使含水量保持在30％，对照组只添加无菌水。培养皿
25℃避光培养30d。30d后取土样10g左右，冷冻干燥均质化，测定PAEs残余浓度。
[0043] 从表4和图2可以看出，30d后添加菌株F3的污染土壤中PAEs降解率为62.0-69.6％，而不接种F3的对照中PAEs降解率3.5-11.3％，所以本试验土壤中PAEs的降解主要贡献者是菌株F3。
[0044] 本实例说明菌株F3对土壤介质中的DMP、DEP和DOP均具有一定降解能力。
[0045] 表4 30d后土壤中PAEs含量和总降解率(mg/kgDW)
[0046]
[0047] 实施例5
[0048] 棒束梗霉(Isaria sp.)F3对酞酸酯人工污染土壤植物修复的强化效果[0049] 1.试验所用土壤来源、类型和基本性质、添加PAEs污染物的方式与实施例3同。菌种用液体真菌培养基扩大培养7d(25℃，120r/min)，菌液(OD660≈0.8)按1％(质量比)接种于盆栽土壤中。
[0050] 供试植物为大豆(Glycine max(L.)Merr.)，购自广东省农科院蔬菜研究所。
[0051] 2.污染土壤约9kg，分装9盆(每盆1kg)。3盆接种1％所选菌株的菌液后种植大豆，3盆不接种菌液种植大豆，余下3盆污染土壤作自然降解对照(即CK组)。在接种菌液和种植作物前采集土壤样品，测定PAEs含量。
[0052] 大豆种子栽入干净水稻土育苗，出苗1周后移入装有污染土壤的陶瓷盆中，每盆5株，生长过程中进行一次间苗，每盆保留3株苗。试验共进行90d，常规田间管理。收获时，采集土壤样品，测定试验终止时土壤的PAEs。结果见表5和图3。从试验结果看，3种PAEs发生了自然降解作用(降解率为62.6％)，种植作物后PAEs的降解有所提高(降解率为63.9％)，但接种棒束梗霉(Isaria sp.)F3显著地提高了土壤PAEs的降解(降解率为
87.8％)。
87.8％)。
[0053] 本实例说明，菌株F3有效地提高了土壤介质中的DMP、DEP和DOP的生物修复效率。
[0054] 表5棒束梗霉(Isaria sp.)F3强化植物修复PAEs的效果(mg/kg DW)
[0055]
[0056] 1)：表中数值为DMP、DEP、DOP均值之和。
[0057] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。