金针菇抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途

摘要

一种金针菇抗肿瘤有效组分提取物，它是由金针菇子实体粉碎后用70%-95%的乙醇加热提取，提取液蒸馏回收乙醇，然后加水分散，用低极性非质子有机溶剂萃取，回收有机溶剂所得的金针菇抗肿瘤有效组分提取物，它含有十六烷酸，十八烷酸，9,12-十八碳二烯酸，9,12,15-十八碳三烯酸，麦角甾醇，22,23-二氢麦角甾醇，麦角甾烷-5,8,22-三烯-3-醇（Ergosta-5,8,22-trien-3-ol），麦角-8（14）-烯-3-醇（Ergost-8(14)-en-3-ol）和部分未知物。该提取物具有明显的抑制人肝癌细胞HepG2的作用，可以用于制备抗肿瘤药物。本发明公开了其制法。

权利要求

1.一种金针菇抗肿瘤有效组分提取物，其特征是：它是由金针菇子实体粉碎后用

70%-95%的乙醇加热提取，提取液蒸馏回收乙醇，然后加水分散，用低极性非质子有机溶剂萃取，回收有机溶剂所得的金针菇抗肿瘤有效组分提取物，它含有十六烷酸，十八烷酸，9,12 -十八碳二烯酸，9,12,15-十八碳三烯酸，麦角甾醇，22,23-二氢麦角甾醇，麦角甾烷-5,8,22-三烯-3-醇（Ergosta-5,8,22-trien-3-ol），麦角-8（14）-烯-3-醇（Ergost-8(14)-en-3-ol）和部分未知物。

2.一种制备权利要求1所述的金针菇抗肿瘤有效组分提取物的方法，其特征是它包括如下步骤：步骤1. 将金针菇子实体粉碎后用70%-95%的乙醇回流提取，冷却，过滤，浓缩提取液得浸膏；

步骤2. 将步骤1的浸膏加水分散，用低极性非质子有机溶剂萃取，萃取液蒸馏回收溶剂后，即得金针菇抗肿瘤有效组分提取物。

3.根据权利要求2所述的金针菇抗肿瘤有效组分提取物的方法，其特征是：所述的低极性非质子有机溶剂是乙醚或乙酸乙酯。

4.权利要求1所述的金针菇抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的金针菇抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征是：所述的抗肿瘤药物是抑制人肝癌细胞HepG2药物。

说明书

金针菇抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途

[0001] 技术领域：

[0002] 本发明涉及一种植物提取物、含有它的药物组合物及其制备方法和用途。具体地说，本发明涉及金针菇提取物、含有它的药物组合物及其制备方法和用途。属于食用菌有效成分提取制备方法和医药用途应用技术领域。

[0003] 背景技术：

[0004] 肿瘤是当今世界上危害人类健康的最严重疾病之一，世界各国的专家学者都在积极研究寻找治疗肿瘤的方法和药物，尤其对食用菌中抗肿瘤物质的研究十分活跃，有关这方面的动物实验及初步临床观察表明食用菌中的多糖和某些蛋白对动物移植肿瘤有较强的抑制作用，能增强机体的免疫功能，减轻放疗、化疗的毒性反应。

[0005] 金针 菇Flammulina velutipes (Curt.:Fr.) Sing.，又 名金 钱 菌、朴 菇、冬菇、毛柄金钱菌，属真菌门 (Eumycota)，担子菌亚门 (Basidiomycotina)，层菌纲 (Hymenomycetes)，伞菌目 (Agaricales)�，口蘑科 (Tricholomataceae)，小火焰菌属 (Flammulina)、或金钱菌属 (Collybia)，是中外著名的食用菌之一，也是当今市场上十分走俏的天然保健食品之一。金针菇广泛分布于中国、日本、俄罗斯西伯利亚和小亚西亚以及欧洲、北美洲、澳大利亚等地。在我国，北起黑龙江，南至广东，东起福建，西至四川的广大区域内，均有金针菇分布 (郭美英主编, 《中国金针菇生产》, 北京: 中国农业出版社,2000.)。

[0006] 金针菇作为一种食用菌不仅营养丰富，而且富含多种活性物质。从上世纪七十年代起，日本、美国等国学者已经开始对金针菇进行抗肿瘤方面的基础研究，随后引起了国际研究学者的广泛兴趣。研究表明，其活性成分主要为蛋白质和多糖类成分。蛋白质类包括Flammulin、Velutin、Flammin和Velin等四种核糖体失活蛋白、真菌免疫调节蛋白、金针菇毒素、火菇素、火菇蛋白原、酶和凝集素等 (Maruyama H., Ikekawa T., International Journal of Medicinal Mushrooms, 2007, 9(2): 109-122. Kenji, F., Michika, H., Sadaki, A., et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2008, 72(12): 3107-3113.)。多糖类包括SFA1、胞外多糖、FVP2、PA3DE和PA5DE等 (M.Y.K. Leung, K.P. Fung, Y.M. Choy, Immunopharmacology, 1997, 35: 255-263. K.S. Shin, K.W. Yu, H.K. Lee1, et al, Food Technol. Biotechnol., 2007, 45 (3): 319-326.)。这些成分具有抗肿瘤，抗病毒，抗虫，抗真菌，抗人的免疫缺陷病毒 (HIV)，降低血清胆固醇，降压，提高机体免疫力等广泛药理活性。特别是抗肿瘤作用研究得最多，对肉瘤-180、艾氏腹水瘤等均有抑制作用。其机理被认为是免疫调节作用，即在机体免疫功能受损的情况下，能够增强T细胞功能，激活淋巴细胞及吞噬细胞，促进抗体产生，并能够诱导干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α的产生，它对肿瘤的抑制生长作用是通过恢复和提高整个机体的免疫能力。

[0007] 此外，曹培让等从金针菇深层发酵菌丝体中分得5种化台物：大豆异黄酮，染料木素，6-甲氧基大豆素，腺苷，腺嘌呤 (曹培让, 王淑芳, 徐贵祥, 等. 中草药, l992,23(10): 511.)。陈智毅等采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法 (HS-SPME-GC-MS) 测定金针菇中的挥发性成分，得到5种酯类成分，4种醛类成分，烯烃、醇类、呋喃类各1种 (陈智毅, 刘学铭, 施英, 等. 食用菌学报, 2009, 16(1), 73-75.)。汪金玉等采用水蒸汽蒸馏法提取金针菇中挥发性成分，应用GC-MS法分离出30个组分，并鉴定出苯乙醛、邻苯二甲酸异丁酯、邻苯二甲酸丁酯、软脂酸、软脂酸乙酯、亚麻酸等6个组分 (汪金玉, 陈康, 林励, 等. 时珍国医国药, 2008, 19(5), 1145-1146.)。Lee等从金针菇中测定出C10:0、C14:0、C16:0、C18:0、C18:1、C18:2六种脂肪酸的含量 (KJ Lee, IJ Yun, KH Kim, et al, Journal of Food Composition and Analysis, 24 (2011) 175-178.)。然而，未见上述物质的药理学或生物活性研究的报道。

[0008] 康洁等对金针菇菌丝体95%乙醇提取物的化学成分进行了研究，共得到20余个化合物，包括7个甾体、3个氨基酸、3个环二肽类化合物、2个黄酮、2个核苷类化合物、2个多元醇类化合物、1个倍半萜、一个神经酰胺。其中17个化合物为首次从金针菇发酵菌丝体中得到。单体化合物药理筛选结果表明：麦角甾醇和鸟嘌呤核苷有较强的抑制乙酰胆碱酯酶的作用，而甘露醇和核糖醇有较强的改善东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的作用 (康洁. 构菌，海漆和蒙桑化学成分及生物活性研究[D], 北京：中国协和医科大学, 2006.)。

[0009] 中国专利申请03132324.3《富锗金针菇多糖及其制法和用途》，200610036622.52+
《一种高活性金针菇多糖-肽-Fe 鳌合物及其制备方法》，200810222271.6《一种金针菇提取物及其获得方法与应用》以及200910010576.5《重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法及应用》涉及了金针菇功效及用途，但都是关于金针菇中蛋白质或多糖类物质，未涉及脂溶性成分。

[0010] 金针菇干品中粗脂肪含量约为8.89～9.23% (JH. Yang, HC. Lin, JL. Mau, Food Chemistry, 2007, 72: 465-471.)，经查阅国内外文献，有关金针菇脂溶性成分的研究较少，特别是在抗肿瘤药用方面，目前尚未见到有关金针菇脂溶性成分抗肿瘤作用研究与应用方面的报道。

[0011] 发明内容：

[0012] 本发明的目的之一是，提供一种金针菇脂溶性抗肿瘤有效组分及其制备方法。

[0013] 本发明的目的之二是，提供所说有效组分在制备抗肿瘤及相关药物中的应用。

[0014] 本发明的技术方案如下：

[0015] 一种金针菇抗肿瘤有效组分提取物，它是由金针菇子实体粉碎后用70%-95%的乙醇加热提取，提取液蒸馏回收乙醇，然后加水分散，用低极性非质子有机溶剂萃取，回收有机溶剂所得的金针菇抗肿瘤有效组分提取物，它含有十六烷酸，十八烷酸，9,12 -十八碳二烯酸，9,12,15-十八碳三烯酸，麦角甾醇，22,23-二氢麦角甾醇，麦角甾烷-5,8,22-三烯-3-醇（Ergosta-5,8,22-trien-3-ol），麦角-8（14）-烯-3-醇（Ergost-8(14)-en-3-ol）和部分未知物。

[0016] 一种制备上述的金针菇抗肿瘤有效组分提取物的方法，它包括如下步骤：

[0017] 步骤1. 将金针菇子实体粉碎后用70%-95%的乙醇回流提取，冷却，过滤，浓缩提取液得浸膏；

[0018] 步骤2. 将步骤1的浸膏加水分散，用低极性非质子有机溶剂萃取，萃取液蒸馏回收溶剂后，即得金针菇抗肿瘤有效组分提取物。

[0019] 上述的金针菇抗肿瘤有效组分提取物的方法，所述的低极性非质子有机溶剂是乙醚或乙酸乙酯。

[0020] 本发明进一步提供了金针菇抗肿瘤有效组分提取物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。以抑制人肝癌细胞（HepG2）增殖能力为活性指标进行抗肿瘤活性实验。实验结果表明，在体外细胞毒实验中，可以明显抑制HepG2的增殖，具有细胞毒作用，可用于制备抗肿瘤治疗药物。

[0021] 有益效果：

[0022] 1、本发明的优点和效果在于采用溶剂提取、萃取等常规方法，从金针菇中提取得到了新的具有抗肿瘤作用的有效组分——脂溶性成分，该有效组分经实验证明具有体外抑制人肝癌细胞（HepG2）生长的活性。

[0023] 2、本发明拓展了抗肿瘤药物的原料渠道，扩大了金针菇的用途，使金针菇从普通食品发展成为抗肿瘤药物的新原料，可显著提高金针菇的附加值；同时，为从食用菌中筛选发现新的抗肿瘤药物提供了新思路。

[0024] 具体实施方式：

[0025] 以下所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0026] 实施例1. 金针菇抗肿瘤有效组分提取物的制备

[0027] 将鲜金针菇子实体5000 g粉碎，用95%乙醇回流提取2小时，乙醇量为金针菇质量的3倍，过滤后的残渣重复提取1次，过滤，合并二次乙醇提取液34 L，回收乙醇至近无醇味，继续浓缩至600 ml，加水分散，加等体积的乙醚萃取4次，合并乙醚萃取液2400 ml，无水硫酸钠脱水干燥，回收乙醚，约得乙醚提取物10 g。

[0028] 金针菇抗肿瘤有效组分提取物经过气质联机分析鉴定主要含有十六烷酸、十八烷酸、9,12 -十八碳二烯酸、9,12,15-十八碳三烯酸、麦角甾醇、22,23-二氢麦角甾醇、麦角甾烷-5,8,22-三烯-3-醇（Ergosta-5,8,22-trien-3-ol）、麦角-8（14）-烯-3-醇（Ergost-8(14)-en-3-ol）和部分未知物。

[0029] 实施例2. 金针菇抗肿瘤有效组分提取物的制备

[0030] 将鲜金针菇子实体50℃下鼓风烘干，粉碎，用70%乙醇回流提取2小时，乙醇量为金针菇质量的10倍，过滤后的残渣重复提取1次，合并乙醇提取液；回收乙醇，加水分散，加乙醚萃取4次，合并乙醚萃取液，无水硫酸钠脱水干燥，回收乙醚，即得金针菇抗肿瘤有效组分提取物，得率约为3%。气质联机分析鉴定结果同实施例1。

[0031] 实施例3抗肿瘤活性实验

[0032] 以实施例1或实施例2得到的金针菇有效部位为受试药物，体外培养人肝癌细胞-1HepG2，取指数生长期的细胞，用胰酶消化后，1500 r·min 离心5 min，将细胞重悬于培养
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基中，细胞浓度调至为2×10 个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，放置细胞培养箱（37℃, 5%CO2）中培养24 h。之后加入受试药物20 μL，阴性对照组加入终浓度-1
为0.5%DMSO，各组均设3个复孔。分别在加药24 h、48h、72 h后，每孔加入5 mg·mL MTT试剂20 μL，继续置于37℃培养4 h。每孔加入DMSO 100 μL，振荡混匀，测定各孔在波长
570 nm处的吸光度值。计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。

[0033] 表1 金针菇提取物抗肿瘤活性实验（HepG2）

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