一种用酶解法制备乙醛脱氢酶的工艺

摘要

本发明涉及一种用酶解法制备乙醇脱氢酶的工艺，其特征在于，包括以下步骤：1)缓冲溶液：将CBP液和α-淀粉酶液按体积比为5∶1-2混合均匀，得缓冲溶液；取啤酒酵母和所述缓冲溶液置反应罐中，搅拌均匀；2)在搅拌下调pH值至7-8，在42-50℃条件下搅拌反应22h-28h，得酶解啤酒酵母液；3)上述酶解啤酒酵母液经离心、超滤浓缩，得浓缩液；4)上述浓缩液经干燥得乙醛脱氢酶酶粉。本发明的原料获取简单，制备设备简单、过程操作简单且时间不长。

权利要求

1.一种用酶解法制备乙醛脱氢酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）缓冲溶液：将萝卜几丁质结合蛋白液和α-淀粉酶液按体积比为5:1-2混合均匀，得缓冲溶液；取啤酒酵母和所述缓冲溶液置反应罐中，搅拌均匀，所述啤酒酵母的质量g与缓冲溶液的体积ml之比为1:1；

2）在搅拌下调pH值至7-8，在42-50℃条件下搅拌反应22h-28h，得酶解啤酒酵母液;

3）上述酶解啤酒酵母液经离心、超滤浓缩，得浓缩液；

4）上述浓缩液转入冷冻干燥机中冷冻干燥，或用-15℃以下的冷丙酮洗涤脱水干燥，得乙醛脱氢酶酶粉；

所述步骤3）具体包括：

301）上述酶解啤酒酵母液抽入离心机，经1200-1500r/min常温离心收集上清液，残渣压滤再收集上清液，合并两次上清液，残渣保留备用;

302）上述合并上清液抽入离心机，经14000-17000r/min常温离心收集上清液，残渣保留备用；

303）将步骤302）所得的上清液经超滤浓缩，得浓缩液。

2.根据权利要求1所述的用酶解法制备乙醛脱氢酶的方法，其特征在于，步骤1）中的所述啤酒酵母为废弃啤酒酵母泥，即生产啤酒后过滤出的啤酒酵母。

说明书

一种用酶解法制备乙醛脱氢酶的工艺

【技术领域】

[0001] 本发明涉及一种用酶解法制备乙醛脱氢酶的工艺。【背景技术】

[0002] 乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，EC 1.2.1.n，英文缩写ALDH)和乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，EC 1.1.1.1，英文缩写ADH)在人体内共同组成乙醇脱氢酶系，负责催化体内的乙醇分解代谢。其中ALDH催化ADH的产物乙醛脱氢CH3CHO生成无毒+ +害的乙酸CH3COOH，反应需要辅酶I(NAD)或辅酶II(NADP)参加：

[0003]

[0004] ALDH主要有两种：细胞质同工酶(ALDH1)和线粒体同工酶(ALDH2)。前者对乙醛的亲和力比后者低。二者为同工酶，是乙醇代谢途径中的最重要的酶之一。因此，ALDH在药疗上有广泛的应用，它在酒精性中毒、酒精性肝病、上消化道癌及胃癌等疾病的临床诊断及治疗上起着重要作用。近年来，在食品、保健品上也有一定应用和发展。【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种用酶解法制备乙醛脱氢酶的工艺，制备简单、快速。

[0006] 上述目的通过以下技术方案实现：

[0007] 一种用酶解法制备乙醛脱氢酶的工艺，其特征在于，包括以下步骤：

[0008] 1)缓冲溶液：将CBP液(CBP：萝卜几丁质结合蛋白)和α-淀粉酶液按体积比为5∶1-2混合均匀，得缓冲溶液；取啤酒酵母和所述缓冲溶液置反应罐中，搅拌均匀；

[0009] 2)在搅拌下调pH值至7-8，在42-50℃条件下搅拌反应22h-28h，得酶解啤酒酵母液；

[0010] 3)上述酶解啤酒酵母液经离心、超滤浓缩，得浓缩液；

[0011] 4)上述浓缩液经干燥得乙醛脱氢酶酶粉。

[0012] 由上述方案可知，本发明通过CBP液和α-淀粉酶液对啤酒酵母按设置条件进行酶解以获取酶解啤酒酵母液，再经离心、超滤浓缩和干燥得乙醛脱氢酶酶粉，其中，离心、超滤浓缩和干燥这些步骤皆为常规技术手段；本发明的原料获取简单，制备设备简单、过程操作简单且时间不长。

[0013] 进一步的方案是，所述步骤1)的α-淀粉酶液由以下工艺制得：混合步骤3)的残渣和步骤4)的残渣得混合物，将所述混合物加入pH6.0-pH7.0、0.01mol/L磷酸缓冲液，混合物的质量g与磷酸缓冲液的体积ml之比为1∶2，搅拌0.5h，经离心、超滤浓缩，得α-淀粉酶液。本方案使得本制备工艺可以废物利用，在刚开始制备乙醛脱氢酶时，可以先从其它地方获取α-淀粉酶液，之后就可以在生产过程中利用相应的残渣来生产α-淀粉酶液。

[0014] 进一步的方案是，步骤2)中的所述啤酒酵母为废弃啤酒酵母泥，即生产啤酒后过滤出的啤酒酵母；这些废弃啤酒酵母泥可由啤酒厂提供，可以废物回收利用，低成本低耗环保。

[0015] 进一步的方案是，步骤1)中，所述啤酒酵母的质量(g)与缓冲溶液的体积(ml)之比为1∶1。

[0016] 进一步的方案是，所述步骤3)具体包括：

[0017] 301)上述酶解啤酒酵母液抽入离心机，经1200-1500r/min常温离心收集上清液，残渣压滤再收集上清液，合并两次上清液，残渣保留备用；

[0018] 302)上述合并上清液抽入离心机，经14000-17000r/min常温离心收集上清液，残渣保留备用；

[0019] 303)将步骤302)所得的上清液经超滤浓缩，得浓缩液。

[0020] 进一步的方案是，所述步骤4)具体为，上述浓缩液转入冷冻干燥机中冷冻干燥，或用-15℃以下的冷丙酮洗涤脱水干燥，得乙醛脱氢酶粉。【附图说明】

[0021] 图1是本发明的制备工艺流程图；

[0022] 图2是本发明制备工艺中所采用的设备流程图；

[0023] 图3为酶解时温度对酶活力的影响的示意图；

[0024] 图4为酶解时反应时间对酶活力的影响的示意图；

[0025] 图5为酶解时PH值对酶活力的影响的示意图；

[0026] 图6为酶解时啤酒酵母与缓冲溶液的质液比对酶活力的影响的示意图。【具体实施方式】

[0027] 结合图1、图2和表1，本发明包括以下步骤：

[0028] 1)取100kg废弃啤酒酵母泥(废弃啤酒酵母泥是生产啤酒后过滤出的啤酒酵母，由青岛啤酒厂(珠海)提供，当然也可以用其他公司的废弃啤酒酵母泥或其它啤酒酵母)置反应罐中，加入100L缓冲溶液，搅拌均匀，该100L缓冲溶液包括75L的酶活力为800U/mL的CBP液(CBP液的酶活力的较佳范围为500-1000U/mL)和25L的酶活力为1.17U/mL的α-淀粉酶液(α-淀粉酶液的酶活力的较佳范围为1.17-1.36U/mL)；其中，CBP液可以按由本申请人于2011年1月30日在中国申请的专利申请号为201110033110.4、名称为《一种高分子冷凝聚法制备萝卜几丁质结合蛋白的方法》的发明专利中所记载的技术方案来制备。

[0029] 2)在搅拌下调pH值至8，在搅拌速度100r/min、45℃的条件下保温反应25h，得酶解啤酒酵母液；

[0030] 3)上述酶解啤酒酵母液抽入离心机，先用低速离心(1500r/min，常温)收集上清液，残渣再经过压滤机压滤一次再收集上清液，合并两次上清液，残渣保留备用；

[0031] 4)上述合并上清液再经管式离心机离心(15000r/min，常温)，收集上清液约185L，酶活力达0.19U/ml，残渣保留备用；

[0032] 5)将步骤4)所得的上清液泵入超滤机，经超滤(过滤条件：收集分子量为10000道尔顿以上的物质)得浓缩液约30L，酶活力0.62U/mL；

[0033] 6)将浓缩液转入冷冻干燥机中冷冻干燥或用-15℃以下的冷丙酮洗涤脱水三次，得ALDH酶粉(即干粉)1.54kg，酶活力达11U/g。

[0034] 表1 制备过程中的相关数据

[0035]步骤 总体积/L 酶活力U/mL 总活力/U 活力回收/％
上清液 185 0.19 35150 100
浓缩液 30 0.62 18600 52.9
干粉(g) 1540g 11U/g 16940 48.2

[0036] 由上述表1可知，100kg废弃啤酒酵母泥得干酶粉1.54kg，产率为1.54％。

[0037] 几个技术参数的确定：

[0038] 结合图3，酶解时温度的选择：依照上述步骤1)配置五份反应溶液(即加入缓冲溶液的废弃酒酵母泥)，然后均在搅拌下调pH值至7，搅拌速度50r/min，分别在40℃、45℃、50℃、55℃、65℃温度下进行反应28h(即要求除了温度条件，其他条件一致)，经检测，ALDH酶活力分别为0.017U/mL、0.101U/mL、0.079U/mL、0.0715U/mL、0.0037U/mL。

[0039] 结合图4，酶解时反应时间的选择：依照上述步骤1)配置反应溶液(即加入缓冲溶液的废弃酒酵母泥)，在搅拌下调pH值至8，在搅拌速度100r/min、50℃的条件下保温反应，然后分别在反应时间为0小时、3小时、16小时、22小时、25小时、28小时、30小时、40小时的时刻对酶解啤酒酵母液进行检测，ALDH酶活力分别为0.041U/mL、0.055U/mL、0.112U/mL、0.133U/mL、0.161U/mL、0.125U/mL、0.134U/mL、0.137U/mL。

[0040] 结合图5，酶解时PH值的选择：依照上述步骤1)配置五份反应溶液(即加入缓冲溶液的废弃啤酒酵母泥)，分别在搅拌下调pH值至为5、6、7、8、9，然后均在搅拌速度120r/min、45℃的条件下保温反应25h(即要求除了pH值条件，其他条件一致)，经检测，ALDH酶活力分别为0.105U/mL、0.123U/mL、0.168U/mL、0.17U/mL、0.113U/mL。

[0041] 结合图6，酶解时啤酒酵母与缓冲溶液的质液比的选择：依照上述步骤1)配置五份不同质液比(啤酒酵母的质量(g)与缓冲溶液的体积(ml)之比)的反应溶液(即加入缓冲溶液的废弃啤酒酵母泥)，质液比分别为0.33、0.4、0.5、0.67、1、1.5、2，均在搅拌下调pH值至7，在搅拌速度80r/min、42℃的条件下保温反应22h(即要求除了质液比条件，其他条件一致)，经检测，ALDH酶活力分别为0.034U/mL、0.055U/mL、0.056U/mL、0.095U/mL、0.152U/mL、0.053U/mL、0.035U/mL。

[0042] 因此，要使酶解啤酒酵母液的酶活力较高，较佳条件为：质液比为1∶1、pH值为7-8、温度为42-50℃、反应时间为22-28h。

[0043] 在生产过程中，我们利用步骤3)的残渣和步骤4)的残渣来制备α-淀粉酶液：混合步骤3)的残渣和步骤4)的残渣得混合物，将该混合物加入pH6.0-pH7.0、0.01mol/L磷酸缓冲液，混合物的质量(g)与磷酸缓冲液的体积(ml)之比为1∶2，搅拌0.5h，先离心(1200-1500r/min，常温)收集上清液，残渣重复一次离心(14000-17000r/min，常温)收集上清液，合并两次上清液，经超滤(过滤条件：收集分子量为10000道尔顿以上的物质)浓缩，得α-淀粉酶液，经检测，酶活力达1.17-1.36U/mL，比活力为63.3-76.8U/mg蛋白质。

[0044] 酶解啤酒酵母液、上清液、浓缩液和酶粉的活力测定工艺：于石英比色皿中加入+ +pH8.0、0.05mol/L Tris-Hcl缓冲液1.95mL，0.015mol/L NAD(或NADP)溶液(以上述Tris-Hcl缓冲液配制)0.2mL，0.14mol/L 4MP(四甲基吡唑，用上述Tris-Hcl缓冲液配制)0.25mL，0.25mL酶液(酶解啤酒酵母液或上清液或浓缩液或酶粉的稀释液)，混匀，25℃保温恒定后，加入同样保温的45％(质量百分浓度)乙醛0.25mL。对照加入0.25mL 0.1％(质量/体积)牛血清白蛋白(以上述Tris-Hcl缓冲液配制)代替酶液。在340nm波长下测定光吸收(A340)值，每隔30s读一次数，共读3min。以A340对时间(s)作图，求出每分钟A340上升值(ΔA340)。以每分钟催化产生1nmol NADH(还原态辅酶I)或NADPH(还原态辅酶II)的酶量为一个酶活力单位(U)。依下式计算：

[0045] U/ml＝ΔA340×2.9/(0.25×6.22)

[0046] U/g酶＝U/mL×稀释倍数/酶质量

[0047] 萝卜几丁质结合蛋白的活力测定工艺：以溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)为底物。挑取少量底物于研钵内，加入定量1/15mol/L pH6.2的磷酸盐缓冲液，研磨破壁，不断加入上述缓冲液，研磨，使悬浮液在450nm波长下，光吸收值达0.6～0.9个光吸收单位，即为底物悬浮液；酶活性测定时，在25℃下以上述磷酸盐缓冲液为对照，于测定比色皿内加入底物悬浮液2.5ml，迅速加入0.1ml酶液(酶粉的稀释液)，搅匀，立即读取光吸收值(A)后，每隔30s读一次数，共读3min。求出平均光吸收值(ΔA)。以在上述条件下每分钟在450nm波长下光吸收值下降0.001个单位的酶量为1个酶活力单位(U)，依下式计算酶活力单位：

[0048] 酶活力单位(U/ml)＝ΔA450/(0.001×3×0.1)

[0049] 酶活力单位(U/g)＝U/mL×稀释倍数/酶质量(g)

[0050] α-淀粉酶的活力测定工艺：取酶液、1％可溶性淀粉溶液(1g可溶性淀粉加入0.01mol/L pH6.9磷酸缓冲液100ml，该磷酸缓冲液内含0.05mol/L NaCl)分别在25℃水浴中保温恒定，各取0.5ml，迅速混匀，于25℃下准确反应3min，立即加入1.0ml显色剂(1g
3，5-二硝基水杨酸中加入少量蒸馏水，搅匀，加入20ml 2mol/L NaOH水溶液，使其溶解，然后加入30.0g四水酒石酸钾钠，待其溶解后以蒸馏水定容至100ml)终止反应。置沸水浴中加热5min，冷却后用4ml蒸馏水稀释。在540nm波长下测定吸光值(A540)，并以1ml显色剂中加入1ml上述缓冲液同样保温冷却再用4ml蒸馏水稀释为对照。以A540值于葡萄糖标准曲线上，查出还原糖含量。在上述条件下每分钟从可溶性淀粉中释放1μmol/L还原糖的酶量为1个酶活力单位。

[0051] 蛋白质含量测定：蛋白质含量测定按Bradford(1976)工艺，并以牛血清白蛋白为标准蛋白质。

[0052] 本发明不局限于上述实施例，基于上述实施例的、未做出创造性劳动的简单替换，应当属于本发明揭露的范围。