一种对重金属铜高度敏感的生物传感器的制备方法及其产品

摘要

本发明涉及大肠杆菌生物传感器制备方法及其产品，制备方法的技术方案是：(1)利用Red重组系统，敲除野生型大肠杆菌E.coli MC4100基因组中copA、cueO和cusA三个基因；(2)利用交叉PCR技术构建融合报告基因PcopA::gfpmut2；(3)将步骤2所得片段克隆到pMD18-T载体上；(4)将载体PcopA::gfpmut2-T经双酶切切下目的条带连接到pET28a载体上；(5)将步骤4所得融合报告载体转化至步骤1的ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三基因突变菌株。上述方案得到产品是由野生型大肠杆菌E.coli MC4100缺失copA、cueO和cusA三个基因，并转化入融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a，本发明产品具有特异、敏感、快速、简便、高效和高性价比等特点，适用于铜离子的野外实时实地监测。

权利要求

1.一种对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：

(1)利用条件复制质粒pKD46和pCP20，利用Red重组系统，敲除野生型大肠杆菌E.coli MC4100基因组中copA、cueO和cusA三个基因，构建ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三基因突变菌株；

(2)利用交叉PCR技术构建含有报告基因gfpmut2与大肠杆菌copA基因启动子PcopA及转录终止子SoxS相融合的融合报告基因PcopA::gfpmut2；

(3)将步骤2所得片段克隆到pMD18-T载体上，构建PcopA::gfpmut2-T重组载体；

(4)测序分析正确的重组载体PcopA::gfpmut2-T经双酶切切下目的条带连接到pET28a载体上，构建融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a(5)将步骤(4)所得融合报告载体转入步骤1构建的ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三基因突变菌株。

2.根据权利要求1所述对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法，其特征在于：步骤(1)中ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三基因突变菌株的制备依次包括有如下步骤：1、引物信息及合成；2、单突变菌ΔcopA的制备；3、双突变菌ΔcopA-ΔcueO的制备；4、三突变菌ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA的制备；其中上述步骤2中的单突变菌ΔcopA的制备具体是：一、pKD46/MC4100菌株制备；二、带FRT位点的cat基因PCR扩增；三、pKD46/MC4100电转感受态细胞的制备；四、电转化cat基因；五、cat基因的PCR鉴定；六、pCP20的转化；

七、cat抗性基因的消除；八、ΔcopA单突变菌的纯化。

3.根据权利要求1或2所述对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法，其特征在于：融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a制备依次包括有如下步骤：(一)试剂盒提取质粒pET28a；(二)pET28a质粒的双酶切及其回收；(三)目的片断与载体的连接反应；(四)将连接好的重组质粒转入DH5α感受态细胞中；(五)阳性克隆的鉴定。

4.按照权利要求1的制备方法得到的对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器，其特征在于：由野生型大肠杆菌E.coli MC4100缺失copA、cueO和cusA三个基因，并转入融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a。

说明书

一种对重金属铜高度敏感的生物传感器的制备方法及其产

品

技术领域

[0001] 本发明涉及一种通过分子生物学手段，利用代谢工程改造的细菌菌株，具体涉及一种对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法及其产品。 背景技术

[0002] 铜是动植物所必需的微量元素，人体缺铜会造成贫血、腹泻等疾病，但过量的铜对人和动、植物也可造成危害。研究发现过量的重金属铜对于所有的生命体都是有毒的，人体内铜的过量沉积参与了很多疾病的发生和发展，铜可蓄积于人体重要器官，如肝、肾、脑等，特别是某些患有染色体隐性疾病的人，由于胆汁排泄铜的功能紊乱，铜蓄积于肝，引起肝脏损坏，出现慢性、活动性肝炎症状，如印度儿童肝硬化、Tyrolean婴儿慢性间质性肝炎和Wilson病，当铜蓄积于脑部，可引起神经组织病变，出现小脑运动失常甚至出现帕金森综合症或阿尔茨海默病。当铜沉积在近侧肾小管时，则可引起氨基酸尿、糖尿、蛋白尿、磷酸盐尿和尿酸尿。当铜沉积在眼角膜周围时，在后弹力层上出现铁锈样环，影响眼睛的正常功能。研究显示铜对原核细胞作用靶点主要是一些具有重要功能的铁硫蛋白的铁硫中心。 [0003] 随着工农业的发展，很多含有铜离子的污染物排放入江河湖泊中，污染土壤、水源甚至是日常食用的粮食蔬菜，其中在金属矿山开采、冶金、金属加工、机械制造、有机合成及其它工业所产生的废水中大多含有铜，其中以金属加工、电镀工厂所排废水中含铜最高，每升废水含铜几十至几百毫克。水体中含铜量达0.01mg/L时对水体自净有明显的抑制作用；
超过3mg/L，会产生异味；超过15mg/L，就无法饮用。若用含铜废水灌溉农田，铜在土壤和农作物中积累，会对农作物，特别是对水稻和大麦生长不利，并会污染粮食。还有铜盐的广泛使用，如常见的波尔多液、硫酸铜、氧化铜、王铜、三氯化铜等作为农药会污染蔬菜。人们过多的暴露于高铜的环境以及高铜饮食都是很强的致病因素，最近研究还显示铜对于男性生殖具有不利影响，因此对环境以及食品中铜离子检测已不容忽视。现有的对铜的分析检测方法主要有极谱法、原子吸收分光光度法和电感耦合法，但这 些方法，往往存在操作繁琐，需要专用的仪器及实验室配备等弊端。利用模式生物对特定化学物质反应的生物检测技术克服了如上不足，因此有必要发展一种快速、特异、敏感的生物传感器来检测环境中铜离子的含量。

[0004] 生物检测技术的基本原理即是利用模式生物对特定化学物质的分子反应机理。对于生物检测技术而言需要三种必需的元件：针对特定或具有相似性质的化学物质的感应器；由感应器控制的启动子；受此启动子控制的报告基因。在设计生物检测技术时，由于细菌具有在环境中大量存在、生长快速、低成本及易维护等优点而受到研究人员普遍亲睐。在过去的研究中利用生物检测法来检测环境中的特定污染物已经引起了极大的关注，至今已经研发了一系列针对特定有机物和无机化合物的生物传感器，如：重金属、甲苯及其衍生物等。

[0005] 现在对铜离子测定的生物检测技术也有所研发，其中比较清楚大肠杆菌针对铜离子的反应机理，大肠杆菌具有精细的调控系统使得细胞内铜离子保持在较低的水平，CopA是一类P-型ATPase，作用是将细胞质内的铜离子向核周质泵出；CueO是一类氧化酶，作用+ 2+是在核周质内将Cu 氧化为Cu ，防止核周质内铜离子进入细胞质(铜离子只有一价形式可以穿过细胞膜)；当大肠杆菌处在低浓度的铜离子环境中，CopA和CueO会被大量的诱导表达，其受到CueR调节子的调节。高浓度的铜离子会激活Cus系统，使得铜离子从核周质向外环境泵出。这个机理提供了一个很好的检测模式，研究人员尝试利用copAp::lux和CueRCopA::LuxCDABE融合报告基因以野生型E.coli作为宿主菌来检测铜离子，这些方法特异性不错，但是敏感性不是很高，更重要的是野生型大肠杆菌长期处于高铜的环境会由于自身的保护机制而产生铜离子耐受，其作为检测铜的宿主菌会造成检测结果的不稳定，所以必须采用新的方法提高生物学检测方法检测铜离子的敏感度。

发明内容

[0006] 本发明的目的是通过基因敲除、基因融合技术构建一种对铜离子高度敏感的大肠杆菌生物传感器来快速、灵敏检测铜离子，以解决以野生型大肠杆菌作为宿主菌的生物检测法敏感性不高等问题，并可以克服物理化学等方法存在的操作繁琐、需要专用的仪器及实验室配备等弊端。

[0007] 本发明所述大肠杆菌报告菌株，名称为E.coli WMC-006，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，普通微生物中心，编号CGMCC No.4624。

[0008] 实现上述目的，本发明的一种对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的制备方法的技术方案是：包含以下步骤：

[0009] (1)利用条件复制质粒pKD46和pCP20，利用Red重组系统，敲除野生型大肠杆菌E.coli MC4100基因组中copA、cueO和cusA三个基因，构建 ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三基因突变菌株；

[0010] (2)利用交叉PCR反应构建含有报告基因gfpmut2与大肠杆菌copA基因启动子PcopA及转录终止子SoxS相融合的融合报告基因PcopA::gfpmut2；

[0011] (3)将步骤2所得片段克隆到pMD18-T载体上，构建PcopA::gfpmut2-T重组载体； [0012] (4)测序分析正确的重组载体PcopA::gfpmut2-T经双酶切切下目的条带连接到pET28a载体上，构建融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a；

[0013] (5)将步骤(4)所得融合报告载体转入步骤1构建的ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三基因突变菌株。

[0014] 通过上述步骤可以方便地构建一种对重金属铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器。

[0015] 上述制备方法的进一步设置是：步骤(1)中ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三基因突变菌株的制备依次包括有如下步骤：1、引物信息及合成；2、单突变菌ΔcopA的制备；3、双突变菌ΔcopA-ΔcueO的制备；4、三突变菌ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA的制备；其中上述步骤2中的单突变菌ΔcopA的制备具体是：一、pKD46/MC4100菌株制备；二、带FRT位点的cat基因PCR扩增；三、pKD46/MC4100电转感受态细胞的制备；四、电转化cat基因；五、cat基因的PCR鉴定；六、pCP20的转化；七、cat抗性基因的消除；八、ΔcopA单突变菌的纯化；所述的报告基因选用选用编码增强型绿色荧光蛋白的gfpmut2基因，融合报告基因PcopA::gfpmut2的制备依次包括有如下步骤：1、引物信息及合成；2、E.coli MC4100细菌基因组DNA的提取；3、PCR扩增PcopA；4、PCR扩增gfpmut2-soxSCo基因；5、交叉PCR获得融合报告基因PcopA::gfpmut2；6、PCR产物胶回收；融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a制备依次包括有如下步骤：(一)试剂盒提取质粒pET28a；(二)pET28a质粒的双酶切及其回收；(三)目的片断与载体的连接反应；(四)将连接好的重组质粒转入DH5α感受态细胞中；(五)阳性克隆的鉴定。

[0016] 本发明进一步设置中报告基因选用选用编码水母Aequorea Vicroria绿色荧光蛋白(GFP)的GFP基因的优点是：(1)易于检测。GFP荧光反应不需要外加底物和辅助因子，只需紫外光或蓝光激发，即可发出绿色荧光，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别；

[0017] (2)荧光稳定。GFP对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光照；GFP在pH7-12范围内也能正常发光；对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数都有较强抗性； [0018] (3)无毒害。从目前的研究结果来看，GFP对生活的细胞基本无毒害，对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞仍可连续传代；

[0019] (4)通用性。表现在GFP的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次是GFP没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光；

[0020] (5)易于构建载体。由于GFP分子量较小，仅为27～30kD，编码GFP的基因序列也很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。 [0021] (6)可进行活细胞定时定位观察。对活细胞中蛋白的功能研究，更能接近自然真实的状态。稳定的GFP蛋白较之细菌性荧光素酶(～0.1)有更高的量子产量(0.88)。而5 6
且，只需大约10 ～10 个GFP分子即可检测出荧光信号。

[0022] 在此，我们使用一种由GFPmut2基因编码的GFP蛋白，它比野生型GFP蛋白亮100多倍。从pGFPmut2质粒(购自Clonetech)DNA中获得含GFPmut2基因的DNA片段，利用交叉PCR技术进行基因融合，将copA启动子序列与gfpmut2基因及转录终止子SoxS序列融合后连接到T载体，经测序正确后切下融合目的基因连接到pET28a载体形成融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a。在此构建中，基因组中cueR基因编码产生的CueR蛋白结合于copA启动子序列。当存在铜离子时，刺激PcopA::gfpmut2融合基因的表达，产生GFPmut2蛋白，产生的GFPmut2蛋白的量或其荧光强度与铜离子呈剂量依赖关系，所以通过测定荧光强度可以反映铜离子的含量。

[0023] 本发明的对铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器的技术方案是：由野生型大肠杆菌E.coli MC4100缺失copA、cueO和cusA三个基因，并转化入融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a，命名为E.coli WMC-006，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号CGMCC No.4624，保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间2011年2月28日，分类名称：大肠埃希氏菌Escherichina coli。

[0024] 本发明的对铜离子高敏感的大肠杆菌生物传感器解决了野生型大肠杆菌作为宿主菌的生物检测法敏感性不高等问题，可以克服物理化学等方法受到实验条件限制等的弊端，并且特异性好，敏感性高。

[0025] 附图说明

[0026] 图1单基因敲除流程图；

[0027] 图2利用交叉PCR技术进行基因融合示意图；

[0028] 图3融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a的构建流程图；

[0029] 图4cat基因PCR电泳图；

[0030] 图5copA::cat/MC4100菌株PCR鉴定电泳图；

[0031] M：1kb DNA ladder；1-2：引物CopA-No/Co，copA::cat突变菌与野生型细菌PCR产物大小分别为2044bp、3535bp；3-4：引物CueO-No/Co，cueO::cat突变菌与野生型细菌PCR产物大小分别为2044bp、2586bp

[0032] 图6单突变菌的PCR鉴定电泳图；

[0033] M：1kb DNA ladder

[0034] 1-3：引物CopA-No/Co，野生型细菌、copA::cat突变菌、ΔcopA(copA基因已缺失) [0035] 4-6：引物CueO-No/Co，野生型细菌、cueO::cat突变菌、ΔcueO(cueO基因已缺失) [0036] 7-9：引物CusA-No/Co，野生型细菌、cusA::cat突变菌、ΔcusA(cusA基因已缺失) [0037] 图7双突变菌的PCR鉴定电泳图；

[0038] M：1kb DNA ladder；1-3：ΔcopA-ΔcueO 突 变 菌 CueO-No/Co、CopA-No/Co、CusA-No/Co三对引物PCR产物；4-6：ΔcusA-ΔcueO突变菌CueO-No/Co、CopA-No/Co、CusA-No/Co三对引物PCR产物；7-9：ΔcusA-ΔcopA突变菌CueO-No/Co、CusA-No/Co、CopA-No/Co三对引物PCR产物

[0039] 图8三突变菌的PCR鉴定电泳图；

[0040] M：1kb DNA ladder

[0041] 1-3：ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO突变菌CueO-No/Co、CopA-No/Co、CusA-No/Co三对引物PCR产物

[0042] 图9 E.coli MC4100基因组DNA提取电泳鉴定图；

[0043] M：1kb DNA ladder；1-2：基因组DNA

[0044] 图10 PCR扩增PcopA基因电泳图；

[0045] M：1kb DNA ladder；1-2：PcopA目的基因条带

[0046] 图11 PCR扩增gfpmut2-soxSCo基因电泳图；

[0047] M：1kb DNA ladder；1-3：gfpmut2-soxSCo目的基因

[0048] 图12交叉PCR扩增PcopA::gfpmut2电泳图；

[0049] M：1kb DNA ladder；1：PcopA基因；2：gfpmut2-soxSCo基因3：gfpmut2-soxSCo与PcopA交叉PCR产物

[0050] 图13生物传感器PcopA::gfpmut2-pET28a/ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO荧光蛋白的诱导及鉴定图；

[0051] A：PcopA::gfpmut2-pET28a/ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO 被 不 同 浓 度 (2-8，0，-8 -7 -6 -5 -4 -31.0×10 ，1.0×10 ，1.0×10 ，1.0×10 ，1.0×10 and 1.0×10 M)的铜离子所诱 导后，收获菌体重悬于pH 8.0的Tris缓冲液中，其中1为pET28a/ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO阴性对照；B：SDS-PAGE全细胞电泳图；C：A中7号标本的发射光谱扫描图；D：A中7号标本的荧光共聚焦成像图。

[0052] 图14报告菌株E.coli WMC-006与野生型及其他6种突变菌敏感性曲线图； [0053] 图15报告菌株E.coli WMC-006特异性实验柱状图；

[0054] 图16不同pH条件下荧光强度变化曲线图；

[0055] 图17不同培养基对生物传感器测定的影响柱状图；

[0056] 图18最佳初始菌液浓度的探索实验结果；

[0057] 图19最佳诱导时间的探索及最适检测范围的确定实验结果；

[0058] 图20报告菌株E.coli WMC-006线性范围曲线拟合结果。

具体实施方式

[0059] 本发明所述对铜离子高敏感的大肠杆菌的构建具体方法如下：

[0060] I、突变菌的制备

[0061] (一)引物信息及合成

[0062] 基因敲除引物：根据http://ecogene.org/提供基因敲除的引物序列，Primer5.0及DNAMAN软件，设计同源重组引物(见表1)，5′端为50bp的cat基因两侧的同源臂(表1有单下划线的部分)，3′端为20bp的用于扩增氯霉素抗性基因(表1有双下划线的部分)。上游同源臂引物H1-P1；下游同源臂引物H2-P2。

[0063] 基因敲除鉴定引物：利用Harvard Molecular Technology Group & Lipper Center for Computational Genetics网站http://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/EcoliKO-primers/EcoliKOprimers.htm提供的一对跨越待敲除基因的外侧设计敲除鉴定引物(见表2)。鉴定copA基因敲除引物设计：上游引物CopA-No位于copA基因上游499bp，下游引物CopA-Co位于copA基因下游501bP；鉴定cueO基因敲除引物设计：上游引物位于cueO基因上游500bp，下游引物位于cueO基因下游502bp；鉴定cusA基因敲除引物设计：上游引物位于cusA基因上游496bp，下游引物位于cusA基因下游498bp。 [0064] 引物由大连宝生物公司合成。用无菌去离子水将引物溶解，配成浓度为10μmol/L。

[0065] 表1基因敲除引物

[0066]

[0067] 表2基因敲除鉴定引物

[0068]

[0069] (二)单突变菌ΔcopA的制备

[0070] 1.pKD46/MC4100制备

[0071] 用接种针从E.coli MC4100的细菌平板中挑取1个单菌落接种于3mlLB液体培养基，37℃，250rpm振荡培养过夜并通过冷CaCl2法制备感受态细胞，将pKD46质粒转化入大+肠杆菌MC4100感受态细胞中，然后均匀涂板于LB-Amp 平板，待菌液充分吸收后倒置平板，
30℃培养过夜。平板上长出菌落说明pKD46已转入MC4100中。

[0072] 2.带FRT位点的cat基因PCR扩增

[0073] 以pKD3为模板，利用引物CopA-H1P1和CopA-H2P2，按表3配制PCR反应体系。 [0074] 表3

[0075]

[0076] PCR反应条件如下：94℃1min；88℃4min；94℃20sec，66℃2min，30个循环；25℃5min。取5μL PCR产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。PCR产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的ddH2O溶解洗脱备用。如图4显示，已扩增得到1kb左右的cat基因。

[0077] 3.pKD46/MC4100电转感受态细胞的制备

[0078] (1)种子液制备：从LB-Amp+平板上长出的pKD46/MC4100取一单菌落接种于3ml LB-Amp+液体培养基，30℃，250rpm振荡培养过夜。

[0079] (2)取pKD46/MC4100过夜菌50μl于10ml TB-Amp+试管中，扩大培养1.5h左右； [0080] (3)加入20％L-Arab 5μl(终浓度为0.02％)诱导1.5h；

[0081] (4)取出菌液置冰浴15min，将菌液转移至预冷的15ml离心管中，4℃，4000rpm离心15min，弃上清；

[0082] (5)加入预冷10％甘油10ml，4℃，4000rpm离心15min，弃上清，重复上述步骤2次；

[0083] (6)加40μl 10％甘油重悬，即制备得到pKD46/MC4100电转感受态细胞。 [0084] 4.电转化cat基因

[0085] 取5μl cat基因PCR纯化后产物与40μl感受态细胞混匀，转移至电击杯中(冰上操作)。打开电转仪，调至Manual，参数设置为：电压：2.5kV，电容：25μF，电阻：200Ω，电击杯：2mm。将电击杯推入电击转化仪，按一下pusle键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入1ml TB重悬，转移至EP管，37℃，150rpm振荡培养1h进行抗性恢复。然后将菌液于5000rpm，25℃离心5min，取200μl上清重悬沉淀，涂于TB-CM+平板，并标记为copA::cat/MC4100，37℃培养过夜。

[0086] 5.cat基因的PCR鉴定

[0087] 从copA::cat/MC4100转化平板上取一单菌落接种于3ml TB-Cm+试管中，37℃，250rpm振荡培养4h，待菌液出现明显浑浊后取300μl菌液作PCR鉴定。将菌液于12000rpm离心5min，弃上清，用300μl无菌水重悬离心，弃上清再用80μl无菌水重悬，煮沸，
12000rpm离心5min，取14μl上清作PCR模板，用鉴定引物CopA-No和CopA-Co按表4配制PCR反应体系。

[0088] 表4

[0089]

[0090] PCR反应条件如下：94℃1min；88℃4min；94℃20sec，65℃5min，30个循环；72℃10min，25℃5min。取5μL PCR产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。结果如图5所示，在2000bp左右出现亮带，证明copA基因已被cat基因替换。

[0091] 6.pCP20的转化

[0092] 将pCP20质粒转化入通过冷CaCl2法制备的copA::cat/MC4100感受态细胞，菌液均匀涂板于LB-Amp+-Cm+板上，待菌液充分吸收后倒置平板，30℃培养过夜。 [0093] 7.cat抗性基因的消除

[0094] 用接种针从pCP20-copA::cat/MC4100细菌转化平板上取一个单菌落接种于3ml LB液体培养基中，42℃，250rpm振荡培养4h左右；取一菌环四区划线接种于LB平板上，37℃培养过夜。用接种针分别从37℃培养过夜的细菌(此时cat基因已去除，pCP20质粒已丢失)平板上挑取3个单菌落分别点种于LB-Cm+与LB空白平板上，置于37℃培养6h左右；在LB-Cm+平板上不生长而LB平板上生长的细菌，cat基因已成功去除。进一步通过PCR鉴定，证明cat基因已完全清除。挑取菌落直接加入14μl水中煮沸10min后，离心作为模板，用鉴定引物按表4配制PCR体系进行PCR扩增。结果如图6所示，基因条带大小与理论值相符，说明已经成功完成 copA基因的敲除，得到ΔcopA单突变菌。

[0095] 8.ΔcopA单突变菌的纯化

[0096] 从ΔcopA四区划线平板上挑取单菌落，用接种环蘸取少许细菌四区划线于新的LB平板，37℃培养过夜。余下菌落挑至50μl无菌水中，煮沸10min后离心，去上清作为模板按5中步骤进行PCR鉴定，鉴定正确后得到纯化的单突变菌。

[0097] (三)双突变菌ΔcopA-ΔcueO制备

[0098] 在ΔcopA单突变菌基础上敲除cueO基因，制备得到双基因突变菌，方法同单突变菌的制备。PCR鉴定结果如图7，菌株用3种鉴定引物PCR扩增的条带中，两条为1000bp左右，另一条为4.0kb(cusA的野生型条带)，说明已经完成ΔcopA-ΔcueO双突变菌制备。 [0099] (四)三突变菌ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA制备

[0100] 在ΔcopA-ΔcueO双基因突变菌基础上敲除cusA基因制备三突变菌，方法同单突变菌制备。如图8显示，用3种鉴定引物PCR扩增的条带中均为1000bp左右，说明已经完成ΔcopA-ΔcueO-ΔcusA三突变菌制备。

[0101] II、融合报告基因PcopA::gfpmut2的构建

[0102] (一)引物信息及合成

[0103] 根据ecogene网站提供的目的基因PcopA和soxS序列及已知的gfpmut2基因序列，使用Primer5.0软件设计引物(见表5)，部分引物在基因的5′端或3′端引入酶切位点(表中下划线部分)，引物由大连宝生物公司合成。

[0104] 表5

[0105]

[0106] (二)E.coli MC4100细菌基因组DNA的提取

[0107] 1.种子液制备：从E.coli MC4100平板上用接种环挑取单菌落于3ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

[0108] 2.取1.5ml过夜菌，12000rpm离心1min弃上清；

[0109] 3.加入100μl GTE在漩涡混和器上振荡混合至沉淀彻底分散，再加入650μl GTE溶液，振荡混匀。

[0110] 4.向悬液中加入7.5μl的100mg/ml溶菌酶至终浓度为1mg/ml，37℃温浴30min； [0111] 5.加入等体积的饱和酚/氯仿，上下颠倒混匀后，12000rpm，离心3min(离心后的水层如果仍然浑浊，则说明仍含有蛋白质，则需将上清液转入新的管中，重复上述步骤，直到水层透明，水层和酚层之间不再有沉淀物)；

[0112] 6.将上清转入新的EP管中，加体积的氯仿，混匀12000rpm，3min，除去苯酚； [0113] 7.小心吸出上清液，转入新的EP管，用预冷的两倍体积的无水乙醇沉淀，放置-20℃30min，然后4℃，12000rpm，10min，可见白色丝状沉淀；

[0114] 8.小心吸出液体，弃上清，用预冷的400μl 70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm，5min，弃上清，重复一次，室温干燥乙醇；

[0115] 9.加入50μl TE(含20μg/ml Rnase)溶解DNA，37℃，20min，去除RNA； [0116] 10.取DNA提取物，以1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图9所示，在大于10kb的位置出现亮带，说明已提取出基因组DNA。

[0117] (三)PCR扩增PcopA

[0118] 利用引物PcopA-1和RPG-2，按表6配制PCR反应体系。

[0119] 表6

[0120]

[0121] PCR反应条件如下：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min；25℃5min。

[0122] 4.凝胶电泳

[0123] PCR产物以1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图10所示，泳道1在250bp左右出现亮带，与PcopA大小基本一致，说明已扩增出PcopA基因。

[0124] (四)PCR扩增gfpmut2-soxSCo基因

[0125] 利用引物RPG-3和soxSCo，以质粒NGC-pMD19-T作为模板，按表7配制PCR体系，扩增出具有相应融合位点的gfpmut2-soxSCo基因。

[0126] 表7

[0127]

[0128] PCR反应条件如下：94℃4min；94℃30s，57℃(grand+1℃)30s，72℃3min，35个循环；72℃10min；25℃5min。设置的退火温度梯度：56.8℃，57.1℃，57.4℃。 [0129] PCR产物以1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图11所示，泳道2在1200bp左右出现亮带，与gfpmut2-soxSCo基因预测大小基本吻合，说明已扩增出gfpmut2-soxSCo基因。

[0130] (五)交叉PCR获得融合报告基因PcopA::gfpmut2

[0131] 以含有互相重叠位点的PcopA基因和gfpmut-soxSCo基因作为模板(摩尔比为1∶1)，利用Pyrobest酶和ExTaq酶，按表8配制PCR反应体系，进行PCR扩增，得到融合报告基因PcopA::gfpmut2。

[0132] 表8

[0133]

[0134] PCR反应条件如下：94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃3min，35个循环；72℃10min；25℃5min。

[0135] 取PCR产物以1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图12所示，泳道 3和4在1400bp左右出现亮带，与融合基因大小基本吻合，说明已扩增出PcopA::gfpmut2基因。 [0136] (六)PCR产物胶回收

[0137] 交叉PCR获得的融合报告基因用胶回收试剂盒(宝生物工程大连有限公司)进行胶回收，最后加适量的ddH2O溶解洗脱备用。

[0138] III、PcopA::gfpmut2-T重组载体的构建

[0139] (一)PCR产物加碱基A反应

[0140] 按表9配制反应体系，75℃放置15分钟。

[0141] 表9

[0142]

[0143] (二)PCR片段纯化回收

[0144] 加碱基A反应产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的ddH2O溶解洗脱备用。

[0145] (三)融合报告基因与pMD19-T载体连接

[0146] 纯化产物与T载体按表10配制连接体系，16℃连接5h。

[0147] 表10

[0148]

[0149] (四)转化

[0150] 通过冷CaCl2法将连接产物转化入大肠杆菌DH-5α感受态细胞中。 [0151] (五)测序

[0152] 挑选一个经PCR鉴定，质粒酶切鉴定证实的单克隆送上海桑尼生物科技有限公司测序，测序结果与NCBI上提供的标准参考序列比对。

[0153] IV、PcopA::gfpmut2-T重组载体的双酶切和融合报告基因PcopA::gfpmut2 的胶回收。

[0154] 1.试剂盒提取质粒PcopA::gfpmut2-T

[0155] 2.PcopA::gfpmut2-T质粒的双酶切和目的片段PcopA::gfpmut2的回收 [0156] 提取的质粒DNA进行双酶切，其反应体系见表11，37C，酶切2h。 [0157] 表11

[0158]

[0159] V、融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a的构建

[0160] (一)试剂盒提取质粒pET28a

[0161] (二)pET28a质粒的双酶切及其回收

[0162] 体系及酶切条件同PcopA::gfpmut2-T质粒，回收纯化载体片段。 [0163] (三)目的片断与载体的连接反应

[0164] 反应体系见表12，连接反应于16℃过夜。

[0165] 表12

[0166]

[0167] (四)将连接好的产物转入DH5α感受态细胞中

[0168] (五)阳性克隆的鉴定

[0169] 1.PCR鉴定

[0170] 用接种针挑取LB CM+平板单个菌落少许，混于含14μl无菌水的PCR管中煮沸10min，12000rpm离心3～5min把盖子上的水蒸气离到管底。取表13中所配体系加入该管中，混匀。

[0171] 表13

[0172]

[0173] PCR反应条件如下：94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃3min，35 Cycles；72℃10min；25℃5min。

[0174] 2.质粒双酶切鉴定

[0175] 1)试剂盒提取质粒PcopA::gfpmut2-pET28a

[0176] 2)体系及酶切条件同PcopA::gfpmut2-T质粒。酶切反应后产物行1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。酶切片断在1.4kb左右证实重组载体构建成功，菌种置含甘油25％的LB CM+中，-70℃保存，备用。

[0177] VI、报告菌株E.coli WMC-006的构建

[0178] (一)质粒提取试剂盒提取融合报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a

[0179] (二)通过冷CaCl2法将融合报告载转化入三突变菌ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO感受态细胞中。

[0180] (三)阳性克隆的鉴定(操作同V阳性克隆的鉴定)

[0181] VII、生物传感器荧光蛋白的诱导表达及鉴定

[0182] (一)报告菌株E.coli WMC-006以不同浓度的Cu2+诱导荧光蛋白的表达1.种子+液制备：从pET28a/ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO冻存菌液中取3μl于新鲜3ml LB-Kan 中，并+
从报告菌株E.coli WMC-006冻存管中取3μl菌液，接种于3ml LB-Kan 中，37℃振荡培养过夜；

[0183] 2.取报告菌株E.coli WMC-006过夜菌0.8ml于40ml LB-Kan+液体培养基中，37℃，250rpm振荡培养至OD600为0.5左右；取pET28a/ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO过夜菌2μl+
于2ml LB-Kan 液体培养基中，相同条件振荡培养相同时间；

[0184] 3.将报告菌株E.coli WMC-006菌液分装至灭菌试管中，2ml/管，加入等体-8 -7积不同浓度的铜标准溶液至各管菌液，使Cu2+终浓度分别为1.0×10 、1.0×10 、-6 -5 -4 -3
1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 M，对照管中加入等体积无菌水。同时在pET28a/ΔcusA-ΔcopA-ΔcueO菌液中加入等体积无菌水作为阴 性对照。将菌液置于37℃，
250rpm振荡培养3h；

[0185] 4.各取80μl菌液，12000rpm离心5min，弃上清，用40μl PH8.0Tris-HCl缓冲液重悬菌体，加入4×载样缓冲液，100℃煮沸5min，12000rpm离心3min，取10μl上清进行蛋白质电泳，电泳凝胶配制见表14。

[0186] 表14

[0187]

[0188] 5.选取荧光强度最强的诱导样品，在激发波长为481nm下行490-600nm波长扫描，并用同样的激发波长在激光共聚焦显微镜下观察。2+

[0189] 6.结果：以不同浓度的Cu 诱导报告菌株E.coli WMC-006荧光蛋白的表达，肉2+
眼可见细菌重悬液呈现明亮的绿色(图13-A)，且随Cu 浓度升高而增深；SDS-PAGE电泳
2+
检测结果表明，在27KDa附近有很明显的目的条带(图13-B)，荧光蛋白的表达量随Cu 浓
2+ -4
度升高而增加，这与肉眼观察的结果一致，其中在Cu 浓度为1.0×10 M表达最高，而在-3
1.0×10 M时，其表达量有所降低。样品7的发射光谱结果显示在481nm激发光激发下在
507nm处具有最大吸收峰(图13-C)，这些特征符合GFPmut2蛋白的荧光特征，这也证实了目的蛋白的表达；该样品的激光共聚焦显微镜下观察到整个菌体呈现亮绿色(图13-D)，更进一步验证了荧光蛋白的表达。

[0190] VIII、报告菌株E.coli WMC-006的敏感性测定

[0191] 为了确定报告菌株E.coli WMC-006对铜离子检测的敏感性，我们将其与含报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a的野生型E.coli MC4100和其他6种突变菌(为制备报告菌株E.coli WMC-006时所一同制备，包括单突变菌ΔcopA、ΔcueO、ΔcusA和双突变菌ΔcopA-ΔcueO、ΔcueO-ΔcusA、ΔcusA-ΔcopA)的敏感性进行比较，具体实施如下： [0192] 1.种子液制备

[0193] 从报告菌株E.coli WMC-006、含报告载体PcopA::gfpmut2-pET28a的野 生型+E.coli MC4100和其他6种突变菌的冻存管中各取3μl菌液，分别接种于3ml LB-Kan 中，
250rpm，37℃振荡培养过夜；

[0194] 2.起始菌液制备

[0195] 吸取8种饱和菌液1.6ml分别加入到80mlLB-Kan+液体培养基中，37℃，250rpm振+荡培养，用空白LB-Kan 液体培养基调零，250rpm，37℃振荡培养测定至OD600约为0.5； [0196] 3.分装：

[0197] 将上述8种菌液，按照2ml/管加入到无菌试管中，每种细菌分装30管； [0198] 4.加入不同浓度Cu2+溶液

[0199] 向分装好的各试管菌液中加入等体积不同浓度的Cu2+溶液，使其终浓度分别为-8 -7 -6 -5 -4 -31.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 、1.0×10 M，另加等体积去离子水作为对照，每种浓度各做3份平行管；

[0200] 5.诱导培养

[0201] 将上述试菌液在37℃，250rpm下振荡培养2h取出；

[0202] 6.吸光度值和荧光值测定

[0203] 每管菌液各吸取100μl菌液10倍稀释于0.9ml pH8.0 Tris-HCl缓冲液中，加入34mg/ml氯霉素1μl(终浓度为34μg/ml)，分别测量各管细菌稀释液荧光强度及OD600值； [0204] 7.结果处理

[0205] 以荧光强度/OD600值为纵坐标，Cu2+终浓度为横坐标，绘制曲线。 [0206] 8.实验结果

[0207] 根据八种菌株对Cu2+的反映曲线(如图14)，可以明显看出，宿主菌为ΔcueO、2+
ΔcusA和ΔcueO-ΔcusA的菌株对Cu 的敏感性与野生型相似，而copA基因缺失的突变菌
2+
对Cu 的敏感程度大大增加，并且以copA、cueO和cusA基因同时缺失的突变菌即E.coli WMC-006菌株敏感性最高，为野生型的约35倍左右。

[0208] IX、报告菌株E.coli WMC-006的特异性测定

[0209] 为了检测报告菌株E.coli WMC-006对铜离子测定的特异性，我们选择其他二价金2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+
属离子Mn 、Co 、Ba 、Fe 、Ca 、Mg 、Zn 、Cu 、pb 做报告菌株的特异性实验，具体实施如下：

[0210] 1.1×M9 Animo-kan+液体培养基配制，配方如下：

[0211] (1)配制5×M9 Salts，先加800ml ddH2O和

[0212] a)86.42g Na2HPO4-12H2O

[0213] b)15g KH2PO4

[0214] c)2.5g NaCl

[0215] d)5.0g NH4Cl

[0216] e)振荡至完全融解

[0217] f)加ddH2O定容至1000ml

[0218] g)高压蒸汽灭菌

[0219] (2)量取500ml ddH2O(高压蒸汽灭菌)

[0220] (3)加200ml 5×M9 Salts

[0221] (4)加2ml 1M MgSO4(高压蒸汽灭菌)

[0222] (5)加20ml 20％葡萄糖(滤菌器滤菌)

[0223] (6)加100μl 1M CaCl2(高压蒸汽灭菌)

[0224] (7)加200ml氨基酸(终浓度40μg/ml)

[0225] 配制：先加100ml ddH2O，称取20种氨基酸各0.04g，再加ddH2O定容至200ml(滤菌器滤菌)

[0226] (8)加1ml 5mg/ml vitamin B1(终浓度5μg/ml)

[0227] (9)加无菌ddH2O定容至1000ml

[0228] (10)加入卡那霉素，使其终浓度为50μg/ml

[0229] 2.种子液制备

[0230] 取报告菌株E.coli WMC-006冻存菌液3μl，接种于3ml1×M9 Animo-kan+液体培养基，250rpm，37℃振荡培养过夜。

[0231] 3.扩大培养：取过夜菌1.2ml于120ml LB-kan+液体培养基中，250rpm，37℃振荡培养，使其吸光度在0.2左右。

[0232] 4.收获4中的菌液并分装，3ml/管。每管菌液加入对应金属离子标准溶液3μl，终浓度均为100μmol/l，对照管以3μl灭菌水代替。

[0233] 5.以上菌液置于37℃，250rpm振荡培养5h后，先取对照管2ml测量吸光度，根据吸光度将各管菌液稀释(此时吸光度控制在0.1-0.2左右)后，测荧光强度与OD600值。实验中设置三组平行管，实验重复三次以上。

[0234] 6.结果处理

[0235] 以铜离子诱导报告菌株表达的荧光蛋白荧光强度/OD600值为100％，其它金属所对应的荧光强度/OD600值与铜离子之比为纵坐标，各种金属离子为横坐标，绘制柱状图2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+
(如图15)。从图中可以看出Pb 、Zn 、Mg 、Ca 、Fe 、Mn 对荧光的表达到无干扰，而当浓
2+ 2+ 2+
度为100μmol/l时，Ba 、Co 和Cr 对荧光的表达存在轻微的干扰，说明报告菌株对铜离子具有较好的特异性。

[0236] X、报告菌株E.coli WMC-006铜离子测定条件的优化

[0237] (一)荧光测量最适pH的探索

[0238] 1.种子液制备：从报告菌株E.coli WMC-006冻存菌液中取3μl于新鲜3ml LB-Kan+中，250rpm，37℃振荡培养过夜；。

[0239] 2.取过夜菌100μl以1∶50加入到含5ml LB-Kan+的试管中，37℃，250rpm振荡培养1.5h；

[0240] 3.加入铜离子溶液使其终浓度为100mM，37℃，250rpm振荡培养3h； [0241] 4.取100μl菌液加入至900μl不同pH的缓冲液(含氯霉素，终浓度为34μg/ml)中，其pH分别为4.0，4.05，4.99，6.0，7.0，7.5，8.0，8.5；

[0242] 5.充分混匀后，测量各pH对应的荧光强度；

[0243] 6.以pH值为横坐标，荧光强度为纵坐标作图(图16)得，在PH6.0-8.5荧光强度高且稳定，选取PH8.0为荧光测量最适PH值。

[0244] (二)最适培养基的探索

[0245] 1.种子液制备：取报告菌株E.coli WMC-006冻存菌液3μl分别加入1×M9-Kan+液体培基、1×M9-氨基酸-Kan+与LB-Kan+液体培养基中，250rpm，37℃振荡培养过夜； [0246] 2.以上三种培养基中菌液分别取100μl于1.4ml PH8.0Tris-HCl缓冲液中，充分混匀后，测量OD600值及荧光强度；

[0247] 3.以荧光强度/OD600值为纵坐标作柱状图(图17)得，细菌在1×M9-Kan+中本底表达最低，但细菌在无氨基酸的M9培养基中，生长缓慢，不适合作为荧光表达的培养基；1×M9-氨基酸-Kan+培养基，细菌本底表达过高，会影响Cu2+测定的灵敏性。故采用LB培养基作为诱导荧光表达的培养基。

[0248] (三)最佳初始菌液浓度的探索

[0249] 1.种子液制备：从报告菌株E.coli WMC-006冻存菌液中取3μl菌液，接种于3ml +LB-Kan 中，250rpm，37℃振荡培养过夜；

[0250] 2.取过夜菌1ml于50ml LB-Kan+液体培养基中，37℃，250rpm振荡培养，检测其吸光度变化。

[0251] 3.分别在OD600为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6左右取2ml菌液于灭菌试管中，加入0.1mol/l CuSO4溶液2μl，250rpm，37℃振荡培养4h；

[0252] 4.各取200μl菌液8倍稀释于1.4ml PH8.0 Tris-HCl缓冲液中，并加入34mg/ml氯霉素1.6μl(终浓度为34μg/ml)，测量其荧光强度和吸光度；

[0253] 5.以初始OD600为横坐标作图。图18显示，当初始细菌浊度在0.4-0.6，荧光强度2+
与初始细菌浊度无相关，在此条件下探索细菌荧光强度与Cu 浓度之间的相关性，更有利
2+
于报告菌株对Cu 最适检测范围的确定。

[0254] (四)最佳诱导时间的探索及最适检测范围的确定

[0255] 1.种子液制备：从报告菌株E.coli WMC-006冻存菌液中取3μl，接种于3ml +LB-Kan 中，250rpm，37℃振荡培养过夜；

[0256] 2.取过夜菌1.6ml于80ml LB-Kan+锥形瓶中，250rpm，37℃振荡培养至 OD600为0.5左右；

[0257] 3.将菌液分装至灭菌试管中，2ml/管，加入等体积不同浓度的Cu2+溶液，使其终-8 -8 -7 -7 -6 -6 -5浓度分别为1.0×10 、5.0×10 、1.0×10 、5.0×10 、1.0×10 、5.0×10 、。1.0×10 、-5 -4
5.0×10 、1.0×10 M，另加等体积去离子水作为对照，每种浓度各做3份平行管。将菌液于
250rpm，37℃振荡培养。

[0258] 4.第2h取500μl菌液5倍稀释于2ml PH8.0 Tris-HCl缓冲液中，第3h取500μl菌液7倍稀释于3ml PH8.0 Tris-HCl缓冲液中，第4h取500μl菌液9倍稀释于4ml PH8.0 Tris-HCl缓冲液中，并且加入34mg/ml氯霉素，使其终浓度为34μg/ml，分别测量各管细菌稀释液荧光强度及OD600值；

[0259] 5.以铜离子浓度为横坐标，荧光强度/OD600值为纵坐标作图，并进行曲线拟合。2
结果显示，经过3h诱导后曲线拟合(图19)R 最接近于1，相应的检测灵敏度最高，故选择
2+ -7 -6
3h为最佳Cu 诱导时间，此时检测范围为1.0×10 ～5.0×10 M。

[0260] XI、报告菌株E.coli WMC-006最适检测范围的确定

[0261] 1.种子液制备：从报告菌株E.coli WMC-006冻存菌液中取3μl，接种于3ml +LB-Kan 中，250rpm，37℃振荡培养过夜；

[0262] 2.取过夜菌1.6ml于80ml LB-Kan+锥形瓶中，250rpm，37℃振荡培养至OD600为0.5左右；

[0263] 3.将菌液分装至灭菌试管中，2ml/管，加入等体积不同浓度的Cu2+溶液，使其终-8 -7 -7 -7 -7 -6 -6浓度分别为5.0×10 、1.0×10 、2.5×10 、5.0×10 、7.5×10 、1.0×10 、2.5×10 、-6 -5
5.0×10 、1.0×10 M，另加等体积去离子水作为对照，每种浓度各做3份平行管。将菌液于
250rpm，37℃振荡培养。

[0264] 4.将菌液于250rpm，37℃振荡培养3h，取100μl菌液15倍稀释于1.4mlPH8.0 Tris-HCl缓冲液中，加入34mg/ml氯霉素1.5μl(终浓度为34μg/ml)，分别测量各管细菌稀释液荧光强度及吸光度；

[0265] 5.以铜离子浓度为横坐标，荧光强度/OD600值为纵坐标进行曲线拟合。 [0266] 图20显示，该 报告菌 株E.coli WMC-006铜离子 检测的线 性范围为-5 -3 25.0×10 -2.5×10 mM，且回归方程为y＝1924.8Log(x)+14460，相关系数R ＝0.9948，线性好，相关性很强。