一种使用菊粉为原料发酵生产微生物油脂的方法

摘要

一种使用菊粉为原料发酵生产微生物油脂的方法，菊粉原料经菊粉酶水解后制得菊粉水解液，再加入酵母膏、蛋白胨、磷酸二氢钾和MgSO4·7H2O制得菊粉水解液发酵培养基，在其中接种皮状丝孢酵母菌种子液发酵培养，培养结束后离心获得微生物油脂菌体，将油脂微生物菌体干燥，再用有机溶剂氯仿-甲醇法，对干燥的油脂微生物菌体细胞内的油脂进行提取，得到微生物油脂。本发明提供了一种利用菊粉生产微生物油脂的方法，极大地扩展了生物柴油的油脂原料来源，并显著降低了生物柴油原料油脂的成本，同时也解决了现有技术中菊芋块茎价值利用不充分的问题。

权利要求

1.一种使用菊粉为原料发酵生产微生物油脂的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1）菊粉原料的水解

按重量比，取7份纯度为90%的菊粉溶解到93份的蒸馏水中，加入过滤除菌的菊粉酶，加酶量为每克菊粉加入60～100U菊粉酶，在60℃条件下恒温水解8～12 h，获得菊粉水解液，备用；

2）油脂微生物的发酵培养

①种子液的培养：在无菌条件下从活化后的新鲜的皮状丝孢酵母菌斜面上挑取两环菌种接种到已灭菌的豆芽汁种子液培养基中，在30℃恒温、摇瓶转速150r/min的条件下，摇瓶培养时间72h，得到发酵种子液，备用；

所述的豆芽汁种子液培养基，其制作方法为：称新鲜豆芽100g，放入烧杯中，加水

1000mL，煮沸30min，用纱布过滤除去豆芽，用蒸馏水将剩余液体补充至1000mL，再加入蔗糖50g，加热溶化即可制得，所述的豆芽汁种子液培养基在使用前在121℃条件下灭菌

20min；

②发酵培养：在步骤1）制得的菊粉水解液中，按每升菊粉水解液加入酵母膏5g、蛋白胨2g、磷酸二氢钾1.0g和MgSO4·7H2O 0.5g的比例将上述添加物作为氮源和无机盐加入到菊粉水解液中，搅拌溶解，再用浓度为0.2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.5，制得菊粉水解液发酵培养基，菊粉水解液发酵培养基在115℃条件下灭菌30min，备用；

在灭菌后的菊粉水解液发酵培养基中接入步骤①中得到的发酵种子液，接入的发酵种子液的体积为菊粉水解液加入上述氮源及无机盐后总体积的10%，在恒温摇床培养箱中进行培养，培养温度为30℃，摇床转速为180r/min，发酵72h，发酵结束后在4500r/min 的转速下离心10min获得油脂微生物菌体，备用；

3）微生物油脂的提取

将步骤②中得到的油脂微生物菌体干燥，再用有机溶剂氯仿-甲醇法，对干燥的油脂微生物菌体细胞内的油脂进行提取，具体操作为：按每克菌体加入浓度为4mol/L盐酸10mL的比例加入盐酸，振荡混匀，25℃恒温条件下放置30～60min，然后在100℃的沸水浴中加热3min，立即置于-20℃环境中冷冻30min；取出后，在其中加入2倍体积的氯仿-甲醇提取液，充分振荡2min，再按照每克菌体加入1mL氯仿的比例加入氯仿，振荡混匀，再按照每克菌体加入1.5mL蒸馏水的比例加入蒸馏水，振荡混匀后在4000r/min的离心速度下离心15～25min，分离出的氯仿层中加入等体积的质量浓度为0.1%的NaCl溶液，在4000～

5000r/min的离心速度下离心15～25min，收集氯仿层，于25℃静置36h，挥发法除去氯仿，得到微生物油脂；

所述的氯仿-甲醇提取液中氯仿和甲醇的体积比为1:2。

说明书

一种使用菊粉为原料发酵生产微生物油脂的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及到微生物发酵生产生物油脂的技术，具体的说是一种使用菊粉为原料发酵生产微生物油脂的方法。

背景技术

[0002] 化石燃料是当前人类使用的主要能源，但其日益消耗殆尽，同时造成了严重的温室效应和环境污染问题。开发可再生、环保的替代燃料已成为经济可持续发展最重要课题之一，利用生物质资源生产燃料技术应运而生。

[0003] 生物柴油，是指以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂，以及动物油脂、废餐饮油等为原料油通过酯交换工艺制成的甲酯或乙酯燃料。生物柴油具有良好的环境特性和可生物降解性，被公认为化石燃料的绿色替代品。

[0004] 微生物油脂发酵技术是生物柴油生产的一个重要发展方向。微生物油脂的脂肪酸组成与植物油相近，以C16和C18系脂肪酸为主。微生物发酵产油具有发酵周期短，可连续生产等优点；而且产油微生物菌种资源丰富，能利用和转化各种农林废弃木质纤维素原料，对中国这样一个农业占较大比重的国家具有特殊意义，因此，利用微生物转化法生产油脂具有非常大的发展潜力。

[0005] 目前我国生物柴油的生产主要以菜籽油、大豆和餐饮废油为主。以植物油为原料生产生物柴油，原料成本偏高，经济可行性差，且我国是油脂资源短缺国家，近年来植物油进口量逐年增加，同时，我国耕地资源匮乏，粮食供应形势不容乐观，扩大油料作物种植的潜力非常有限，而地沟油资源的总量有限，原料组成及性能变化大，这将影响生物柴油原料的供应，不能满足我国生产生活的大量需求。

[0006] 微生物油脂具有不受季节的影响、发酵周期较短，易分离提纯、可连续生产、不占用耕地，也不会对环境造成污染的优点，而菊芋作为生物柴油生产的原料也具有其独特的优势：一是菊芋产量高，其块茎干物质亩产可达1.2吨，茎叶干重1.3吨以上，超过玉米和小麦的生物量单产水平；二是菊芋块茎的菊粉含量很高，可占湿重的20%左右、干重的80%左右；三是菊粉是多聚果糖，易于转化为可发酵的果糖；四是菊芋适应性强，耐贫瘠，耐寒，耐旱；特别适合在沙漠、滩涂、盐碱荒地等非农业耕地种植。因此，发展菊芋生物柴油，即可以不与粮征地，又符合我国生物柴油发展的产业政策。

发明内容

[0007] 为解决菊芋块茎的价值开发不完全和能源紧缺问题，本发明提供了一种使用菊粉为原料发酵生产微生物油脂的方法。

[0008] 本发明为解决上述技术问题采用的技术方案为：一种使用菊粉为原料发酵生产微生物油脂的方法，包含以下步骤：

[0009] 1）菊粉原料的水解

[0010] 按重量比，取7份纯度为90%的菊粉溶解到93份的蒸馏水中，加入过滤除菌的菊粉酶，加酶量为每克菊粉加入60～100U菊粉酶，在60℃条件下恒温水解8～12 h，获得菊粉水解液，备用；

[0011] 2）油脂微生物的发酵培养

[0012] ①种子液的培养：在无菌条件下从活化后的新鲜的皮状丝孢酵母菌斜面上挑取两环菌种接种到已灭菌的豆芽汁种子液培养基中，在30℃恒温、摇瓶转速150r/min的条件下，摇瓶培养时间72h，得到发酵种子液，备用；

[0013] 所述的豆芽汁培养基，其制作方法为：称新鲜豆芽100g，放入烧杯中，加水1000mL，煮沸30min，用纱布过滤除去豆芽，用蒸馏水将剩余液体补充至1000mL，再加入蔗糖50g，加热溶化即可制得，所述的豆芽汁培养基在使用前需在121℃条件下灭菌20min；

[0014] ②发酵培养：在步骤1）制得的菊粉水解液中，按每升菊粉水解液加入酵母膏5g、蛋白胨2g、磷酸二氢钾1.0g和MgSO4·7H2O 0.5g的比例将上述添加物作为氮源和无机盐加入到菊粉水解液中，搅拌溶解，再用浓度为0.2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.5，制得菊粉水解液发酵培养基，菊粉水解液发酵培养基在115℃条件下灭菌30min，备用；

[0015] 在灭菌后的菊粉水解液发酵培养基中接入步骤①中得到的发酵种子液，接入的发酵种子液的体积为菊粉水解液加入上述氮源及无机盐后总体积的10%，在恒温摇床培养箱中进行培养，培养温度为30℃，摇床转速为180r/min，发酵72h，发酵结束后在4500r/min 的转速下离心10min获得微生物油脂菌体，备用；

[0016] 3）微生物油脂的提取

[0017] 将步骤②中得到的油脂微生物菌体干燥，再用有机溶剂氯仿-甲醇法，对干燥的油脂微生物菌体细胞内的油脂进行提取，具体操作为：按每克菌体加入浓度为4mol/L盐酸10mL的比例加入盐酸，振荡混匀，25℃恒温条件下放置30～60min，然后在100℃的沸水浴中加热3min，立即置于-20℃环境中冷冻30min；取出后，在其中加入2倍体积的氯仿-甲醇提取液，充分振荡2min，再按照每克菌体加入1mL氯仿的比例加入氯仿，振荡混匀，再按照每克菌体加入1.5mL蒸馏水的比例加入蒸馏水，振荡混匀后在4000r/min的离心速度下离心15～25min，分离出的氯仿层中加入等体积的质量浓度为0.1%的NaCl溶液，在4000～
5000r/min的离心速度下离心15～25min，收集氯仿层，于25℃静止36h，挥发法除去氯仿，得到微生物油脂。

[0018] 本发明中所述的氯仿-甲醇提取液中氯仿和甲醇的体积比为1:2，所述的pH自然是指配制完成后不需用酸或碱来调节其pH值。

[0019] 本发明中，所述的菊粉为市售的菊粉，购自于北京威德生物技术有限公司；菊粉酶为常规的水解酶，可由产菊粉酶的微生物发酵制得；皮状丝孢酵母菌购于广东省微生物菌种保藏中心。

[0020] 经检测，本发明所得微生物油脂的组成及相对含量如下表所示，从表中可以看出，微生物油脂的组成成分为16碳系和18碳系脂肪酸，其中棕榈酸、油酸、亚油酸、棕榈油酸的含量较多，其组成与含量与植物油类相似，可作为油脂资源用于生物柴油的制备。

[0021]脂肪酸种类 脂肪酸相对百分含量（%）
C16:0棕榈酸 15.8
C16:1棕榈油酸 8.79
C18:0硬脂酸 2.31
C18:1油酸 53.1
C18:2亚油酸 11.6
C18:3亚麻酸 4.48

[0022] 有益效果：经测定，使用本发明的方法制得的菌体生物量为11.69～13.28g/L，油脂产量为4.44～5.2g/L和油脂含量36～39%，与现有技术相比具有很大的提高；本发明提供的以油脂酵母菊粉生产的油脂作为生物柴油生产的原料，极大地扩展了生物柴油的油脂原料来源，并显著降低了生物柴油原料油脂的成本，同时也解决了现有技术中菊芋块茎价值利用不充分的问题。

具体实施方式

[0023] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。

[0024] 实施例1

[0025] 一种使用菊粉为原料发酵生产微生物油脂的方法，包含以下步骤：

[0026] 1）菊粉原料的水解

[0027] 将纯度为90%的菊粉以7%的比例溶解到蒸馏水中，加入过滤除菌的菊粉酶，加酶量为60U/g，在60℃条件下保温水解12 h，获得菊粉水解液，备用；

[0028] 2）油脂微生物的发酵培养

[0029] ①种子液的培养：在无菌条件下从活化后的新鲜的皮状丝孢酵母菌斜面上挑取两环菌种接种到已灭菌的豆芽汁种子液培养基中，在30℃恒温、摇瓶转速150r/min的条件下，摇瓶培养时间72h，得到发酵种子液，备用；

[0030] 所述的豆芽汁培养基组分为(g/L)：豆芽100，蔗糖50和水1000，pH自然，其制作方法为：称新鲜豆芽100g，放入烧杯中，加水1000mL，煮沸约半小时，用纱布过滤，用蒸馏水补足原量，再加入蔗糖50g，加热溶化即可制得，所述的豆芽汁培养基在使用前需在121℃条件下灭菌20min；

[0031] ②发酵培养：在步骤1）制得的菊粉水解液中分别加入酵母膏5g/L、蛋白胨2g/L、磷酸二氢钾1.0g/L和MgSO4·7H2O 0.5g/L，搅拌溶解，再用0.2mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值为5.5，制得菊粉水解液发酵培养基，菊粉水解液发酵培养基在115℃条件下灭菌30min，备用；

[0032] 在灭菌后的菊粉水解液发酵培养基中接入步骤①中得到的发酵种子液，接入的发酵种子液体积为菊粉水解液加入上述氮源及无机盐后总体积的10%，在恒温摇床培养箱中进行培养，培养温度为30℃，摇床转速为180r/min，发酵72h，发酵结束后在4500r/min 的转速下离心10min获得微生物油脂菌体，备用；

[0033] 3）微生物油脂的提取

[0034] 将步骤②中得到的油脂微生物菌体干燥，再用有机溶剂氯仿-甲醇法，对干燥的油脂微生物菌体细胞内的油脂进行提取，具体操作如下：每克菌体加入4mol/L盐酸10mL，振荡混匀，25℃放置30～60min，然后沸水浴加热3min，立即置于-20℃环境中速冷；将处理好的菌液加入2倍体积的氯仿-甲醇（体积比为1:2）提取液，充分振荡2min，再加入1mL氯仿，振荡混匀，加入1.5mL蒸馏水，振荡混匀后在4000r/min的离心速度下离心15～
25min，取氯仿层，加入等体积、质量浓度为0.1%的NaCl溶液，在4000～5000r/min的离心速度下离心15～25min，试管收集氯仿层，于25℃静止36h，挥发法除去氯仿层，得到微生物油脂。

[0035] 取本发明的样品进行检测后得出，当每克菊粉加酶量为60U时，发酵结束后菌体生物量达到11.69g/L，油脂产量为4.44g/L，油脂含量达38%。

[0036] 实施例2

[0037] 一种使用菊粉为原料发酵生产微生物油脂的方法，包含以下步骤：

[0038] 1）菊粉原料的水解

[0039] 将纯度为90%的菊粉以7%的比量溶解到蒸馏水中，加入过滤除菌的菊粉酶，加酶量为80U/g，在60℃条件下保温水解10 h，获得菊粉水解液，备用；

[0040] 2）油脂微生物的发酵培养

[0041] ①种子液的培养：在无菌条件下从活化后的新鲜的皮状丝孢酵母菌斜面上挑取两环菌种接种到已灭菌的豆芽汁种子液培养基中，在30℃恒温、摇瓶转速150r/min的条件下，摇瓶培养时间72h，得到发酵种子液，备用；

[0042] 所述的豆芽汁培养基组分为(g/L)：豆芽100，蔗糖50和水1000，pH自然，所述的豆芽汁培养基在使用前在121℃条件下灭菌20min；

[0043] ②发酵培养：在步骤1）制得的菊粉水解液中分别加入酵母膏5g/L、蛋白胨2g/L、磷酸二氢钾1.0g/L和MgSO4·7H2O 0.5g/L，搅拌溶解，再用0.2mol/L的盐酸或氢氧化钠溶液调节pH值为5.5，制得菊粉水解液发酵培养基，菊粉水解液发酵培养基在115℃条件下灭菌30min，备用；

[0044] 在灭菌后的菊粉水解液发酵培养基中接入步骤①中得到的发酵种子液，接入的发酵种子液体积为菊粉水解液加入上述氮源及无机盐后总体积的10%，在恒温摇床培养箱中进行培养，培养温度为30℃，摇床转速为180r/min，发酵72h，发酵结束后在4500r/min 的转速下离心10min离心获得微生物油脂菌体，备用；

[0045] 3）微生物油脂的提取

[0046] 将步骤②中得到的油脂微生物菌体干燥，再用有机溶剂氯仿-甲醇法，对干燥的油脂微生物菌体细胞内的油脂进行提取，具体操作为：每克菌体加入4mol/L盐酸10mL，振荡混匀，25℃放置30～60min，然后沸水浴加热3min，立即置于-20℃环境中速冷；将处理好的菌液加入2倍体积的氯仿-甲醇（体积比为1:2）提取液，充分振荡2min，再加入1mL氯仿，振荡混匀，加入1.5mL蒸馏水，振荡混匀后在4000r/min的离心速度下离心15～25min，取氯仿层，加入等体积、质量浓度为0.1%的NaCl溶液，在4000～5000r/min的离心速度下离心15～25min，试管收集氯仿层，于25℃静止36h，挥发法除去氯仿层，得到微生物油脂。

[0047] 取本发明的样品进行检测后得出，当每克菊粉加酶量为80U时，发酵结束后菌体生物量达到12.84g/L，油脂产量为4.62g/L，油脂含量达36%。

[0048] 实施例3

[0049] 一种使用菊粉为原料发酵生产微生物油脂的方法，包含以下步骤：

[0050] 1）菊粉原料的水解

[0051] 将纯度为90%的菊粉以7%的比量溶解到蒸馏水中，加入过滤除菌的菊粉酶，加酶量为100U/g，在60℃条件下保温水解8 h，获得菊粉水解液，备用；

[0052] 2）油脂微生物的发酵培养

[0053] ①种子液的培养：在无菌条件下从活化后的新鲜的皮状丝孢酵母菌斜面上挑取两