新城疫病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及探针转让专利
申请号 : CN201110335627.9
文献号 : CN102417935B
文献日 : 2014-01-01
发明人 : 胡萌 , 王业富 , 周康平 , 邱杨 , 赵丽
申请人 : 武汉大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种新城疫病毒核酸定量检测引物和探针,其序列如下:正向引物:5'-GRCTTAARGAGAGCATYG-3',反向引物:5'-CTGCCACTGMTAGTTGYG-3',荧光探针:5'-ACCAATGARGCTGTGCA-3',下标为LNA修饰,其中,所述序列中Y为C或T,R为A或G,M为A或C;其中荧光探针的5’端修饰的荧光染料选自:FAM,HEX,TET,JOE,VIC,ROX,Cy3或Cy5;3’端修饰的荧光染料选自:TAMRA、Eclipse,BHQ1,BHQ2,BHQ3或DABCYL。
2.含有权利要求1所述引物和探针的新城疫病毒核酸定量检测试剂盒。
3.根据权利要求2所述的新城疫病毒核酸定量检测试剂盒,其特征在于,该试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种:(1)PCR反应液;
(2)RNA提取液;
(3)阴性质控品,为不含新城疫病毒Fusion基因的pUC57载体质粒DNA片段;
6
(4)阳性质控品,为含1.0×10copy/ml新城疫病毒基因组DNA片段;
4
(5)临界阳性质控品,为含1.0×10copy/ml新城疫病毒基因组DNA片段;
(6)工作标准品。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,其中,PCR反应液包括DEPC处理水、具有5’→3’外切活性的热启动Taq DNA聚合酶、M-MLV反转录酶、RNase抑制剂、dNTP Mix、
10×一步法PCR Buffer、MgCl2溶液,所述引物及探针溶于PCR反应液中。
5.根据权利要求3所述的新城疫病毒核酸定量检测试剂盒,其特征在于,所述RNA提取液分为溶液1,溶液2,溶液3,溶液4及溶液5,其中溶液1为Trizol试剂,溶液2为氯仿,溶液3为异丙醇,溶液4为75%乙醇,溶液5为DEPC处理水。
6.根据权利要求3所述的新城疫病毒核酸定量检测试剂盒,其特征在于,所述工作标准品包括:7
a、工作标准品1,含有1.0×10copy/ml的新城疫病毒Fusion基因的非传染性DNA片段;
6
b、工作标准品2,含有1.0×10copy/ml的新城疫病毒Fusion基因的非传染性DNA片段;
5
c、工作标准品3,含有1.0×10copy/ml的新城疫病毒Fusion基因的非传染性DNA片段;
4
d、工作标准品4,含有1.0×10copy/ml的新城疫病毒Fusion基因的非传染性DNA片段。
7.根据权利要求4所述的新城疫病毒核酸定量检测试剂盒,其特征在于,所述PCR反应液各组分含量的配比为:DEPC处理水23.1μl;5U/μl的热启动Taq酶0.4μl;200U/μl M-MLV反转录酶1μl;RNase抑制剂0.5μl;10mmol/l的dNTP Mix2μl;10×一步法RT-PCR Buffer5μl;25mmol/l的MgCl2溶液用量9μl;10μmol/l的新城疫病毒正向引物用量1.5μl;浓度为10μmol/l的新城疫病毒反向引物用量1.5μl;浓度为10μmol/l的新城疫病毒探针用量1μl。
说明书 :
新城疫病毒核酸定量检测试剂盒、检测方法、引物及探针
技术领域
背景技术
分离确定,世界范围分布并曾形成四次大流行。上世纪90年代以来,虽然没有出现世界性
ND大流行,但局部地区的流行和暴发时常发生(如台湾、西欧、南非等地)。近年来.我国呈
地方性流行和散发的ND时有发生。新城疫病毒可以感染绝大部分鸟类,对于一些易感染的
家禽其是极易传播并且致死的。新城疫在世界各地频发,每年都造成巨大损失,因而其是最
重要的禽类传染病之一。由于新城疫病毒种类的不同,新城疫在禽类身上的临床表现存在
巨大差异。致命的毒株其临床表现主要可以分为3类:(1)嗜内脏型强毒,急性致死感染,
死亡的鸟类伴有肠损伤性出血;(2)嗜神经性强毒,高致死率并伴有呼吸和神经性疾病,但
通常没有肠道疾病;(3)中等毒力,引起呼吸和神经性感染症状,但致死率低。致命性毒株
在家禽的出现需要处理和控制,即使是地方性传播也是必须的,否则其会对禽类的经济生
产和国际贸易带来巨大冲击。
NDV提供重要的依据。新城疫病毒为副黏病毒科,禽腮腺病毒属,单分子负链病毒目,只有一
个血清型。病毒粒子有囊膜,直径100-300nm,基因组为单股负链不分节段的RNA组成,编
码6种结构蛋白:核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶(HN)和大蛋白(L)。P蛋白经过RNA修饰可以额外产生非结构蛋白V和W。目前,针
对NDV的核酸检测目标基因主要为融合基因(Fusion Gene, F)及血凝素-神经氨酸酶基
因(hemagglutinin-neuraminidase Gene, HN)。本研究确定检测的目标基因为F基因,该
基因编码的蛋白为病毒表面的纤突结构之一,是病毒重要的宿主保护性抗原,在新城疫的
发病过程中起着很重要的作用,参与病毒的穿透,细胞融合以及溶血等过程,为NDV致病性
的主要影响因子。同时,研究该基因对将要提到的病毒流行病学的研究也至关重要。
作、接种后观察或其他方法。分离出的病毒可用于长期保存,抗原性、基因特性或药物敏感
性等分析,但也存在一定的使用限制。目前最常用的分离病毒的组织系一般为MDCK,而鸡胚
则是最常用的活体。大多数毒株均可适应于该细胞,将病料或其它处理,接种到细胞系上,
3~4 天可见CPE,表明病毒分离。总体而言,病毒分离认为检测病毒的一种经典、准确、敏感
的病原学诊断金标准,特异性和敏感性均较高,但较为费时。
显微镜技术分常规电镜和免疫电镜。可用电子显微镜直接观察到新城疫病毒颗粒或感染部
位组织。常规电镜法样品用量小、制样速度快、观察比较直观,但观察灵敏度较低,要求样品
的病毒量大。而免疫电镜法较常规电镜法的敏感性高,但样品制备过程较复杂,对操作者的
技能要求较高。在此基础上还研究开发出了一些新方法及技术,如免疫电子显微镜或固相
免疫电子显微镜,这些方法是利用抗原抗体反应并通过负染色在电子显微镜下进行观察,
灵敏度相对提升了许多,但相应的样品制备过程较复杂,对操作者的技能要求较高。
等。血清学测定的灵敏度高于电子显微镜,但其特异性低,实验室诊断方面局限性较大。此
外,由于该技术建立于病毒抗原识别的基础之上,病毒的抗原多样性会对该技术的应用产
生影响。操作上较为简单快速,但现有的方法缺乏足够的敏感性和特异性,如不能准确区分
甲型H1N1流感病毒与季节性流感,且不能检测新变异的毒株。
光抗体试验(indirect fluorescent anti-body test, IFA),为标记荧光素在抗原抗体
上进行抗原抗体反应。新报道的微球免疫法即将利用结合于聚苯乙烯微球的抗体鉴定病
毒,敏感性和特异性均相当高,并且,由于该微球系统可发出不同颜色的荧光,因此,理论上
可同时检测100种不同的抗体,且试剂用量极少。该法是国际上检测疫病病毒阳性抗体
通用而且比较敏感的血清检测方法。IFA特异性可达99%。IFA可以确定抗体的滴度,抗
体滴度达到16或20的可以判为阳性。关于EIA,其应用最广的技术为酶联免疫吸附试验
(ELISA),其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板) 表
面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除,再加底
物显色,最后根据色泽深浅推算待测抗原或抗体的含量。检测方法分为有多种形式,如间接
ELISA、捕捉ELISA、阻断ELISA、夹心ELISA 等。抗原检测ELISA特异性较强,操作快速简
便,可应用于大批量样本检测,并且抗体侦测的反应谱比抗原更广。而血清中和试验(serum
neutralization test, SNT), 分常量和微量两种,基本原理为利用完整的病毒来检测中
和抗体,WHO推荐使用微量中和法,其敏感性大大高于血凝抑制(HI)试验,但中和抗体在血
清中出现比较迟,不适用于早期诊断。该法特异性很强,可区别不同毒力的病毒株型。此
法是评价猪群免疫保护水平的唯一客观可信的方法,为经典方法,但操作繁琐、费时费料,
对安全及检验技术要求高,现在已较少使用。另外还有SPRIA法、MEIA法、琼脂凝胶扩散
试验(agar gel immunodiffusion, ACID)、血凝抑制(HI)试验、免疫胶体金技术(Immune
colloidal gold technique)等。
片。
性和重复性较低,若结合斑点杂交、微孔板杂交、滤膜核酸探针杂交等核酸杂交方法和酶联
免疫等方法对PCR产物进行分析,灵敏度和特异性均可大大提高。
方法。这些以PCR为基础的检测方法,都需要花费时间对PCR扩增产物进行后处理,PCR扩
增产物中高浓度的目标DNA分子会以气溶胶的形式污染整个实验空间,由于PCR的高度灵
敏性,甚至可以检测出反应体系中10个拷贝的模板浓度,从而可能给今后的PCR实验带来
严重的假阳性;常规PCR方法是终点检测法,由于PCR反应具有平台期,无法依据终产物对
起始模板进行精确定量检测。在此基础上研发出竞争PCR(competitive PCR),巢式PCR
(nested PCR),半巢式PCR(semi-nested PCR),多重巢式PCR(multiplex nested PCR),
限制片段长度多态性PCR(RELP-PCR),多重PCR等。
立病毒RT-PCR 检测方法的原则是扩增病毒特异而保守的基因片段,具有很高的特异性和
敏感性。的灵敏度可能因样本中存在其抑制物而低于预期,目前已逐步发展为病毒检测的
“金标准”。在所有常规方法中,该反应最为灵敏。
步法和两步法两种,具高通量,可定量,单位检测成本较低,稳定性、精确性、重复性好,以及
自动化程度高等特点。并且单管封闭检测且不需后续处理而大大减小交叉污染的可能。检
测周期短。敏感性为传统RT-PCR的10~100倍。而使用特异性的探针可进一步极高检测的效
率及限制,据研究报道使用TaqMan探针的RRT-PCR方法的检测限可达0.006 TCID50/ml~0.2
TCID50/ml (50% tissue culture infectious dose,半数组织培养感染剂量)。而应用MGB
探针可减少背景荧光,进一步提高敏感性,检测限可达0.08 EID50或0.006 TCID50(约5个
8
RNA拷贝),线性范围为5~5×10 copy/ml。探针的应用使假阳性最小化。
H (RNase H)共同协作而完成,不需特殊仪器,不需温度循环,是以转录为基础,单链核苷酸
的连续扩增,其反应产物是单链RNA。扩增产物与磁珠上的捕捉探针及钌标记的电化学发
光寡棱苷酸探针(ECL探针)杂交后,形成复合物,经NucliSens阅读器直接检测电化学发
光强度。该法周期较短,灵敏度与鸡胚培养相当。NASBA扩增不要需要复杂的温度变化,其
扩增效率高于传统的PCR,其敏感性要高于传统PCR,但现有的敏感性评估均为体外实验结
果,需要进行直接检测临床样品的彻底评估。在NASBA技术上进一步发展出来的实时NASBA
技术,使检测的敏感性和特异性大大提高,达到~0.1 TCID,相当于RRT-PCR。检测临床样品
的阳性率高于细胞培养法及直接免疫荧光法多达64%。NASBA技术拥有RRT-PCR相似的优
点,且因为不需要变性DNA,即便有基因组DNA污染也可以特异性扩增出目的RNA;而且还是
一种高通量的方法,可以同时检测50个样本。非常适用于大规模样品的筛查。NASBA技术
的扩增产物为RNA分子,使用者可以根据需要选择不同的检测方法,如电化学发光法和酶
联法等。而且,与PCR的产物DNA分子不同,RNA分子不易对实验仪器和环境造成污染,避
免了产物交叉污染实验仪器、操作环境导致的假阳性结果。但缺点是单位均检测成本要高
于RRT-PCR,所以有条件的实验室,最适合的技术还是RRT-PCR。
固定在一块很小的支持物如硅片、玻片等,然后与待检的荧光标记样品核酸按碱基配对原
则杂交,经洗涤后通过激光共聚焦荧光系统检测杂交信号强度,再经计算机分析处理数据
从而获取样品的生物信息。将特异探针固定在载玻片上,在PCR扩增NDV PCR产物带有荧
光,通过将PCR产物与NDV芯片杂交后某型处的杂交点出现荧光而确定。将RT-PCR获得的
病毒各种基因的cDNA或合成的特异性寡核苷酸探针固化于芯片,利用核酸杂交技术可构
建检测病毒血清型或亚型的芯片平台,CY3、CY5标记待检的cDNA或扩增的DNA,与芯片杂
交,检测病毒核酸或进一步鉴别混合体系中扩增产物。理论上单次杂交可以检测多种病毒,
并有潜力进行成千上万种核酸序列的筛选。可用于NDV病毒的基因变异、基因分型的检测。
该技术具有自动化程度高、灵敏度高、检测目的分子量少、效率高等优点,但也存在成本高、
假阳性率偏高、重复性差等缺陷。目前基因芯片技术在流感的检测中还远远低于其它检测
方法,且检测成本及硬件要求均较高.离实际应用还有很长的路要走。
发明内容
TET,JOE,VIC,ROX,Cy3或Cy5;3’端修饰的荧光染料选自:TAMRA、Eclipse,BHQ1,BHQ2,
BHQ3或DABCYL。
液,所述引物及探针溶于PCR反应液中。
2 µl;10×一步法RT-PCR Buffer 5 µl;25 mmol/l的 MgCl2溶液用量9 µl;10 μmol/l
的新城疫病毒正向引物用量1.5 µl;浓度为10 μmol/l的新城疫病毒反向引物用量1.5
µl;浓度为10 μmol/l的新城疫病毒探针用量1 µl。
DEPC处理水为0.1%DEPC水,经高压灭菌,同时也灭活了有毒性的DEPC。
具体包括:
血清管中(100μl/管),于48 h内冷藏(4~8℃)运输到实验室。
物,拭抹双侧鼻孔;咽拭子采集是用棉签适度用力擦拭双侧咽后壁部位,应避免触及舌部。
采完咽拭子和鼻咽拭子后,迅速将拭子放入含有3 ml标本运输液的10 ml带垫圈的螺口塑
料离心管中,在靠近顶端处折断棉签杆,旋紧管盖。在48 h内冷藏(4~8℃)运输到实验
室。如无病毒保存液,也可用生理盐水替代。
液中。采集的样品于24 h内送达实验室。
取上清置等体积预冷的溶液3中,温和颠倒混匀,静置10 min,12,000 rpm离心10 min,弃
上清,加入1,000 μl 75%溶液4洗涤沉淀2次,8,000 rpm离心5 min。去上清,干燥 2~
5 min,加15~30 μl溶液5溶解,-80℃保存;
s;
伤害。
准确性(如图5、图6所示),且技术操作简便、自动化程度高,由于采用闭管操作,不需要PCR
产物后处理,有效解决PCR污染问题等特点,结果可靠。同时,采用将逆转录及荧光定量PCR
法结合起来,大大简化了实验步骤,在实际操作及推广上具有重大意义。
附图说明
具体实施方式
液、新城疫病毒正向引物、新城疫病毒反向引物、新城疫病毒LNA探针;RNA提取液分为溶液
1,溶液2,溶液3,溶液4及溶液5。溶液1为Trizol试剂,溶液2为氯仿,溶液3为异丙醇,
溶液4为75%乙醇,溶液5为DEPC处理水;阴性质控品,为不含新城疫病毒Fusion基因的
质粒DNA片段;阳性质控品,为高浓度新城疫病毒基因组DNA片段;临界阳性质控品,为低
浓度新城疫病毒基因DNA片段;工作标准品,为含有新城疫病毒Fusion基因的78个碱基对
的核苷酸片段的pUC57(Amp+)重组质粒,该质粒在大肠杆菌DH5α中增殖;
的新城疫病毒Fusion基因的39条序列,使用MAGA 4.0软件进行比对分析,在基因区选择
一段相对保守序列,序列如序列表中SEQ ID NO.4所示:
物、探针序列,引物、探针序列不仅要满足软件中各项指标,而且要确保新城疫病毒引物、探
针序列在NCBI上BLAST比对匹配结果前100条序列为100%,前500条序列尽可能趋于100%
(可使用简并碱基)。在本发明中,新城疫病毒探针的5’端修饰的荧光染料可选自:FAM,HEX,
TET,JOE,VIC,ROX,Cy3或Cy5;3’端修饰的荧光染料可选自:TAMRA、Eclipse,BHQ1,BHQ2,
BHQ3或DABCYL。本实施例中荧光报告基团设计为FAM,FAM的激发波长为495 nm,接收波
长为521 nm,淬灭集团设计为BHQ1。
新城疫病毒-F 21bp PAGE GRCTTAARGAGAGCATYG
新城疫病毒-R 21bp PAGE CTGCCACTGMTAGTTGYG
新城疫病毒-P 17bp PAGE accAatGarGctGtgca
步法RT-PCR Buffer 5 µl;25 mmol/l的 MgCl2溶液用量9 µl;10 μmol/l的新城疫病毒
正向引物用量1.5 µl;浓度为10 μmol/l的新城疫病毒反向引物用量1.5 µl;浓度为10
μmol/l的新城疫病毒探针用量1 µl,配制成PCR反应液。
板。
模板。
限公司合成,质粒图谱如图7所示),该质粒在大肠杆菌DH5α中增殖碱裂解法提取,经DNA
9
纯化试剂盒纯化,分光光度计定量,然后根据公式换算并稀释至1.0×10 copy/ml,-20℃
9
保存。贮存浓度为1.0×10 copy/ml,使用前用无菌生理盐水或0.01 mol/l PBS 10倍倍
7 6 5
比稀释。工作浓度分别为1.0×10 copy/ml,1.0×10 copy/ml,1.0×10 copy/ml以及
4
1.0×10 copy/ml,反应前,12,000 rmp离心30 s,取上清液作模板。
量
PCR反应液 45µl/管24 新城疫病毒引物、探针以及Taq酶、M-MLV反转录酶、RNase抑制剂、10×一步法PCRBuffer、MgCl2溶液及dNTPMix系列
溶液1 1.5ml/2 主要成分为苯酚,另外还加入了8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等;
管
溶液2 700µl/1 氯仿;
管
溶液3 500µl/1 异丙醇;
管
溶液4 500µl/1 75%乙醇(使用DEPC处理水配制);
管
溶液5 150µl/1 DEPC处理水;
管
阴性质控品 100µl/1 不含新城疫病毒Fusion基因的pUC57(Amp+)载体质粒DNA片段;
管
阳性质控品 50µl/管1 高浓度新城疫病毒基因组DNA片段;
临界阳性质50µl/管1 低浓度新城疫病毒基因组DNA片段;
控品
工作标准品20µl/管1 含有约1.0×107copy/ml的新城疫病毒基因的非传染性DNA片段;
1
工作标准品20µl/管1 含有约1.0×106copy/ml的新城疫病毒基因的非传染性DNA片段;
2
工作标准品20µl/管1 含有约1.0×105copy/ml的新城疫病毒基因的非传染性DNA片段;
3
工作标准品20µl/管1 含有约1.0×104copy/ml的新城疫病毒基因的非传染性DNA片段;
4
说明书 — 1 白卡纸
份
血清管中(100μl/管),于48 h内冷藏(4~8℃)运输到实验室。
物,拭抹双侧鼻孔;咽拭子采集是用棉签适度用力擦拭双侧咽后壁部位,应避免触及舌部。
采完咽拭子和鼻咽拭子后,迅速将拭子放入含有3 ml标本运输液的10 ml带垫圈的螺口塑
料离心管中,在靠近顶端处折断棉签杆,旋紧管盖。在48 h内冷藏(4~8℃)运输到实验
室。如无病毒保存液,也可用生理盐水替代。
液中。采集的样品于24 h内送达实验室。
取上清置等体积预冷的溶液3中,温和颠倒混匀,静置10 min,12,000 rpm离心10 min,弃
上清,加入1,000 μl 75%溶液4洗涤沉淀2次,8,000 rpm离心5 min。去上清,干燥2~
5 min,加15~30 μl溶液5溶解,-80℃保存;
5 µl;25 mmol/l的 MgCl2溶液用量9 µl;10 μmol/l的新城疫病毒正向引物用量1.5 µl;
浓度为10 μmol/l的新城疫病毒反向引物用量1.5 µl;浓度为10 μmol/l的新城疫病毒
探针用量1 µl;
10×一步法PCRbuffer 5.0 1×PCRbuffer
MgCl2(25mmol/l) 9.0 4.50mmol/l
dNTPMix(10mmol/l) 2.0 0.20mmol/l
新城疫病毒FP(10μmol/l) 1.5 0.30μmol/l
新城疫病毒RP(10μmol/l) 1.5 0.30μmol/l
新城疫病毒Probe(10μmol/l) 1.0 0.20μmol/L
Taq酶(5U/µl) 0.4 0.04U/µl
M-MLV(200U/µl) 1.0 4U/µl
Rnase抑制剂(2,000U/µl) 0.5 20U/µl
模板 5.0 —
加水 23.1 —
总体积 50.0 —
团为BHQ),定义样品孔:阴性质控品选NTC;待检样品、阳性质控品及临界阳性质控品选
Unknown。
1 Undet.
2 5.07488
3 Undet
4 9.22692
5 Undet.
6 8.85773
7 24.3669
8 30.2781
9 7.39095
10 21.0064
表:
1 22.9361
2 17.4666
3 34.06
4 Undet
5 21.0174
6 Undet
7 21.0506
8 Undet
9 22.1374
10 Undet
应管中对应加入试剂盒中不同浓度梯度的工作标准品5 µl,5,000 rpm离心10 s,以工作
标准品为模板,按照实施例1的方法配制反应体系,然后放入仪器样品槽进行PCR扩增。工
7
作标准品选Standard。对于Standard,需要在Quantity栏中分别输入1.0×10 copy/ml、
6 5 4
1.0×10 copy/ml、1.0×10 copy/ml、1.0×10 copy/ml。
1.0e+007 12.0407 1.0e+007
1.0e+006 15.0577 1.0e+006
1.0e+005 19.1431 1.0e+005
1.0e+004 22.3168 1.0e+004
slope -3.491370 —
intercept 36.342117 —
R2 0.996693 — 。
浓度如下表。
阳性质控品 15.0577
临界阳性质控品 22.3168
阴性质控品 Undet
1 20.9854
2 23.5205
3 21.959
4 Undet.
5 29.7367
6 23.9831
7 27.9599
8 25.1915
ml、1.0×10 copy/ml、1.0×10 copy/ml、1.0×10 copy/ml、1.0×10 copy/ml。
1.0e+009 3.6076 1.0e+009
1.0e+008 6.1082 1.0e+008
1.0e+007 9.9921 1.0e+007
1.0e+006 13.8503 1.0e+006
1.0e+005 18.0794 1.0e+005
1.0e+004 21.6511 1.0e+004
1.0e+003 25.363 1.0e+003
slope -3.622833 —
intercept 35.687248 —
R2 0.996135 —