凡纳滨对虾磺乙基酵母多糖免疫增强剂

摘要

本发明涉及一种凡纳滨对虾的免疫增强剂，为磺乙基酵母多糖，其磺乙基取代度为0.550～0.728。该免疫增强剂是在碱性的反应体系下，添加2-氯乙基磺酸钠与酵母多糖反应制备的。本发明的免疫增强剂在对虾饲料中使用，添加量仅为0.1％～0.2％，就能明显促进凡纳滨对虾的生长，显著提高凡纳滨对虾的免疫力和抗病力。其应用效果显著好于酵母多糖。同时，本发明的免疫增强剂配合申请人制备的凡纳滨对虾饲料来使用时，能够获得更好的效果。

权利要求

1.一种凡纳滨对虾的免疫增强剂，其特征在于，所述的免疫增强剂为磺乙基取代度为

0.550～0.728的磺乙基酵母多糖；上述的磺乙基酵母多糖是在碱性的反应体系下，添加

2-氯乙基磺酸钠与酵母多糖反应制备的；且2-氯乙基磺酸钠与酵母多糖的质量比为7～

9:5。

2.权利要求1所述的免疫增强剂的应用，是将磺乙基酵母多糖添加在凡纳滨对虾饲料中,与饲料的质量比为1：500～1000。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的饲料配方为:鱼粉20～30%，虾壳粉

4～6%，面粉25～30%，鱿鱼内脏粉4～6%,豆粕15～20%，花生粕12～17%，鱼油0.5～

1.5%，大豆卵磷脂1～3%，对虾用维生素矿物质预混料1.5～4%。

说明书

凡纳滨对虾磺乙基酵母多糖免疫增强剂

技术领域

[0001] 本发明属于水产饲料免疫增强剂技术领域，具体涉及一种凡纳滨对虾的免疫增强剂，即可以提高凡纳滨对虾免疫力和抗病力的磺乙基酵母多糖。

背景技术

[0002] 由于种质的退化和片面追求产量造成的养殖环境恶化，养殖对虾疾病在世界范围内频繁爆发，并造成巨大的经济损失。抗生素曾经被用于治疗对虾疾病，但是抗生素具有一系列副作用，主要表现在对虾体内药物残留以及致病菌耐药性的升高。免疫增强剂是指具有促进或诱发宿主防御反应，增强生物机体抗病能力的一类物质，具有安全、无残留、作用范围广和使用方便等优点。但是，在实际生产中发现，免疫增强剂在凡纳滨对虾养殖生产中效果不佳，主要表现在当疾病爆发时，使用免疫增强剂往往没有预期效果。酵母多糖是水产养殖中常用的免疫增强剂，但也存在对养殖对虾免疫力和抗病力提高不显著等缺点。因此，急需一种对凡纳滨对虾具有显著免疫效果的免疫增强剂。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种提高凡纳滨对虾免疫力和抗病力的磺乙基酵母多糖，从而弥补现有技术的不足。

[0004] 本发明的凡纳滨对虾的免疫增强剂，为磺乙基酵母多糖。

[0005] 上述的磺乙基酵母多糖的磺乙基取代度为0.550～0.728。

[0006] 本发明免疫增强剂的制备方法，是在碱性的反应体系下，添加2-氯乙基磺酸钠与酵母多糖反应制备磺乙基酵母多糖。

[0007] 上述制备方法中添加的2-氯乙基磺酸钠与酵母多糖的质量比为7～9∶5。

[0008] 本发明的免疫增强剂，添加在凡纳滨对虾饲料中，与饲料的质量比为1∶500～1000。

[0009] 上述的饲料配方优选为：鱼粉20～30％，虾壳粉4～6％，面粉25～30％，鱿鱼内脏粉4～6％，豆粕15～20％，花生粕12～17％，鱼油0.5～1.5％，大豆软磷脂1～3％，对虾用维生素矿物质预混料1.5～4％。

[0010] 本发明的免疫增强剂在对虾饲料中使用，添加量仅为0.1％～0.2％，就能明显促进凡纳滨对虾的生长，显著提高凡纳滨对虾的免疫力和抗病力。其应用效果显著好于酵母多糖。同时，本发明的免疫增强剂配合申请人制备的凡纳滨对虾饲料来使用时，能够获得更好的效果。

[0011] 说明书附图

[0012] 图1：本发明的磺乙基酵母多糖的结构式。

具体实施方式

[0013] 下面对本发明的免疫增强剂磺乙基酵母多糖进行详细描述。

[0014] 实施例1：不同取代度的磺乙基酵母多糖的制作：

[0015] 取62.5ml异丙醇，加入5g酵母葡聚糖，在10℃不断搅拌，在搅拌过程中，逐滴加入7.25ml30％氢氧化钠溶液。继续在10℃搅拌，反应1小时。1小时后，加入2-氯乙基磺酸钠，其中添加的2-氯乙基磺酸钠与酵母多糖的质量比为7～9∶5；然后将整个反应体系置于70℃下，反应3小时。在反应过程中，不断搅拌，使反应充分进行。反应结束后，用10％的乙酸(溶解于80％的乙醇中)将pH调至7.0。后将反应体系用去离子水透析72小时，得到无氯离子的含有磺乙基酵母葡聚糖的溶液。将此溶液真空干燥，即得到磺乙基酵母葡聚糖。

[0016] 实施例2：磺乙基酵母多糖取代度的测定

[0017] 1.试剂的配置

[0018] 0.6mg/ml硫酸基标准贮备液的配制：取烘干的硫酸钾108.75mg，以1mol/L的盐酸溶解，定容至100ml。

[0019] 明胶溶液：取5g明胶，溶解于70℃去离子水中，搅拌，使其充分溶解。

[0020] 明胶氯化钡溶液：取0.5g氯化钡，溶解于明胶溶液中，定容至100ml。

[0021] 2.样品的水解

[0022] 取一只10ml带盖玻璃试管，加入100mg磺乙基葡聚糖和10ml 6mol/L的盐酸溶液。将试管封闭，置于沸水浴中4小时。待冷却后，将试管内液体过滤，以6mol/L的盐酸清洗滤渣，将滤液收集定容至50ml。

[0023] 3.样品的测定

[0024] 取上述定容液0.2ml，加入3.8ml 3％三氯乙酸溶液，1.0ml明胶氯化钡溶液，反应15分钟后，于360nm波长下测吸光值A1。另取上述定容液0.2ml，加入3.8ml3％三氯乙酸溶液，1.0ml明胶溶液，反应15分钟后，于360nm波长下测吸光值A2。

[0025] 取硫酸基标准贮备液0.2ml，加入3.8ml3％三氯乙酸溶液，1.0ml明胶氯化钡溶液，反应15分钟后，于360nm波长下测吸光值A1’。另取硫酸基标准贮备液0.2ml，加入3.8ml 3％三氯乙酸溶液，1.0ml明胶溶液，反应15分钟后，于360nm波长下测吸光值A2’。

[0026] 4.取代度的计算

[0027] 100mg样品中硫酸基的含量S＝0.12×(A1-A2)/(A1’-A2’)×250/100[0028] 取代度＝2×S/(1-S)

[0029] 经过测量和计算，磺乙基酵母多糖的取代度为0.550～0.728。

[0030] 实施例3：酵母多糖和磺乙基酵母多糖溶解率的测定。

[0031] 取2g酵母多糖或磺乙基酵母多糖，加入到10ml去离子水中，振荡20分钟。20分钟后，将上述混合液于离心20分钟，取上清液，于100℃下烘干。称量干燥出的粉末，计M。

[0032] 溶解率＝M/2×100％

[0033] 经过测量和计算，磺乙基酵母多糖的溶解率为62.76％。酵母多糖的溶解率仅为4.07％。

[0034] 实施例4：筛选适用于凡纳滨对虾的不同取代度的磺乙基酵母多糖[0035] 以不添加免疫增强剂的凡纳滨对虾饲料作为对照组饲料。在对照组饲料中，分别加入0.1％酵母多糖和0.1％的磺乙基酵母多糖，制成酵母多糖饲料和磺乙基酵母多糖饲料。以这三种饲料作为实验饲料，进行养殖实验。

[0036] 选用当年人工孵化的同一批凡纳滨对虾，体重约0.65g左右，作为实验用虾。经1周的驯养后，挑选出体格健壮、规格一致的凡纳滨对虾进行分组实验。共分为3组，分别投喂一种实验饲料。每组设3个平行，每个平行为1个250L的玻璃钢桶，放养30尾实验用凡纳滨对虾。实验过程中，每天换水一次，换水量为总体积的3/4，充气。在为期4周的养殖实验中，海水的溶氧在7.8-8.2mg/L，pH 7.5-8.0，盐度30-32，温度27-31℃。每天投喂四次，分别在06:00、12:00、18:00、24:00，饱食投喂，每日清除残饵及排泄物。

[0037] 实验开始和结束时对每个平行的凡纳滨对虾进行计数、称重，计算凡纳滨对虾的特定生长率。计算方法如下：

[0038] 特定生长率＝(LnWt-LnW0)×100/t

[0039] 其中，W0和Wt分别为每个平行凡纳滨对虾初始体重和终末体重，t为实验天数。

[0040] 实验结束后，每个平行随机选取5尾虾，用于免疫力的测定。首先抽取凡纳滨对虾血液，与抗凝剂(27mmol/L柠檬酸钠、385mmol/L氯化钠、115mmol/L葡萄糖，pH调至7.5)按照体积比1∶9混匀。将5尾虾的抗凝血混合均匀，进行酚氧化酶和溶菌酶的测定。

[0041] (1)酚氧化酶活力的测定

[0042] 在96孔板中先加入50μl抗凝血上清液，加入200μl左旋多巴(L-DOPA)溶液。后于室温下用酶标仪在490nm波长下测定20min内吸光值的变化。

[0043] (2)溶菌酶活力的测定

[0044] 使用南京建成生物科技公司的溶菌酶试剂盒进行溶菌酶活力的测定。

[0045] 采用患对虾白斑综合症而致死的凡纳滨对虾来检测本实验用的凡纳滨对虾的抗病力。取患对虾白斑综合症致死的凡纳滨对虾，去除虾头和外壳，将虾肉打碎、混匀。每个平行随机选取14尾凡纳滨对虾，用于抗病力的测定。按每尾凡纳滨对虾投喂0.1g病虾肉的剂量投喂，连续观察7天，计算凡纳滨对虾的累积死亡率。

[0046] 采用SPSS 13.0for Windows软件对上述测定数据进行单因素方差分析。实验结果用平均值±标准差(mean±S.D.)表示。具体实验结果见表2。

[0047] 表2：投喂酵母多糖和不同取代度的磺乙基酵母多糖对凡纳滨对虾生长、免疫力和抗病力的影响。结果以平均数±标准差表示，同一行数据标有不同字母，表示差异显著(P＜0.05)。

[0048]

[0049] 实验结果表明：磺乙基酵母葡聚糖的效果显著好于酵母多糖。相比酵母多糖，一定取代度的磺乙基酵母多糖可以显著提高凡纳滨对虾的生长、免疫力和抗病力。

[0050] 另外，根据凡纳滨对虾的生活习性专门配制了如下配方的饲料，其配方为上述的饲料配方优选为：鱼粉20～30％，虾壳粉4～6％，面粉25～30％，鱿鱼内脏粉4～6％，豆粕15～20％，花生粕12～17％，鱼油0.5～1.5％，大豆软磷脂1～3％，对虾用维生素矿物质预混料1.5～4％。上述的各个组分可以选用市场上出售的商品，也可以按照水产饲料的教科书进行自己配制。例如对虾用维生素矿物质预混料可以选用中国公开专利CN1875747中描述的预混料，本发明实施例中选用来自山东省青岛金海力水产科技有限公司生产的海维特对虾专用维生素矿物质预混料。将本发明的免疫增强剂磺乙基酵母多糖按质量百分比0.1％加入到配制的饲料中，与目前使用的、同样添加了质量百分比0.1％的磺乙基酵母多糖凡纳滨对虾饲料相比，本发明配制的饲料不但免疫力和抗病力有提高，而且凡纳滨对虾的生长率也有3～5％的提高。即本发明制备的免疫增强剂与配制的饵料表现出明显的配合作用。