一种Taqman水解探针以及定量检测MGMT甲基化程度的方法

摘要

本发明提供了一种Taqman荧光水解探针以及利用该Taqman水解探针定量检测MGMT甲基化程度的方法。该Taqman荧光水解探针的基本序列为GATTTGGTGAGTGTUTGGG，所述基本序列与基因组DNA序列互补区向上游延伸不超过5nt，下游延伸不超过5nt。本发明双重保证了PCR的特异性；可定量计算出混合样本中甲基化DNA模板的百分含量；具备实时定量PCR的所有优势，如快速，灵敏，无污染等。应用本发明的检测结果可对脑胶质瘤等恶性肿瘤的化疗用药提供临床指导，具有高特异性，高灵敏度和准确定量等优势。

权利要求

1.一种针对人MGMT基因启动子区域所设计的Taqman荧光水解探针，其特征在于：该探针序列为GATTTGGTGAGTGTUTGGG，探针长度为19nt，与基因组DNA序列互补；

相应的PCR引物包括针对甲基化位点设计的上游引物P1、下游引物P2，以及针对非甲基化位点设计的上游引物P3、下游引物P4；引物序列具体为：P1：5'-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3'P2：5'-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3'P3：5'-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3'P4：5'-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA-3。

2.一种利用如权利要求1所述的Taqman荧光水解探针定量检测MGMT甲基化程度的方法，该检测方法应用于非疾病诊断目的；包括以下步骤：（1）制备PCR反应模板用亚硫酸氢盐对样品基因组DNA进行甲基化转化处理；

（2）配置反应体系

向一支PCR反应管中依次加入下列组份：

10×PCR缓冲液 2ul；

四种dNTP（三磷酸脱氧核苷酸）混合物 各200umol/L；

甲基化上游引物 10～100pmol；

甲基化下游引物 10～100pmol；

Taqman荧光探针；

亚硫酸盐处理后模板DNA 25～50ng；

热启动DNA聚合酶 2.5u；

加双蒸水至20ul；

向另一支反应管中依次加入下列组份：

10×PCR缓冲液 2ul;四种dNTP（三磷酸脱氧核苷酸）混合物 各200umol/L；

非甲基化上游引物 10～100pmol；

非甲基化下游引物 10～100pmol；

Taqman荧光探针；

亚硫酸盐处理后模板DNA 25～50ng；

热启动DNA聚合酶 2.5u；

加双蒸水至20ul；

（3）将反应体系置于荧光PCR反应仪中，按照以下程序进行反应；

PCR 反应程序：

95℃ 10min；

72℃ 2min；

（4）通过荧光PCR仪配套软件获取分别对应于两支PCR反应管的甲基化反应的Ct值和非甲基化反应的Ct值；

（5）按照以下计算式

CG TG

甲基化百分含量=100/[1+2(Ct -CT )]%计算得到MGMT甲基化程度。

说明书

一种Taqman水解探针以及定量检测MGMT甲基化程度的方

法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种Taqman水解探针和一种检测MGMT甲基化程度的方法。

背景技术

[0002] 人类MGMT基因定位于染色体10q26，全长大约170kb，由5个外显子以及4个内含子构成。MGMT蛋白在不需要任何辅助因子或其它蛋白质的条件下，可以催化DNA分子中的6
鸟嘌呤O 位上的烷基转移到MGMT本身第145位的半胱氨酸残基上，鸟嘌呤得以复原，DNA的结构和功能得以恢复，从而保护细胞免受烷化剂的损伤。含甲基和氯乙基抗癌药物的细胞毒作用主要是有赖于它与DNA之间形成烷基，引起链内交联的能力。而MGMT可将烷基从烷基化的DNA链中移除，致烷化剂治疗无效。所以MGMT在正常组织中可消除烷化剂对细胞的致癌作用；在肿瘤细胞中却能消除烷化类药物的细胞毒作用。肿瘤细胞对含甲基和氯乙
6
基的抗癌药物耐药常与高水平的DNA修复蛋白MGMT有关，O 烷基鸟嘌呤修复程度依赖于细胞内MGMT的原始水平和新MGMT蛋白合成的程度，因此检测MGMT启动子区域的甲基化程度就有着重要的意义。

[0003] 目前检测MGMT启动子区域甲基化的方法主要有：1、甲基化敏感性内切酶；2、亚硫酸氢盐的修饰；3、特异性识别甲基化修饰DNA的抗体或蛋白；4、质谱或色谱等精密检测手段。由于受到仪器等条件的制约，应用比较广泛的是前三种方法。甲基化敏感的限制性内切酶方法是经典的甲基化分析方法，主要根据一些限制性内切酶不能切开甲基化的DNA序列。这是一种经典的甲基化研究方法，其优点是：相对简单，成本低廉，甲基化位点明确，实验结果易解释；缺点是：a、由于CG不仅仅限于CCGG序列中，因此非该序列中的CG将被忽略；b、只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意义；c、相对而言，Southern方法较复杂，且需要样本的量大；d、存在着酶不完全消化引起的假阳性的问题；d、不适用于混合样本。亚硫酸氢盐的修饰法是目前应用最广泛的CpG岛甲基化检测方法。NaHSO3可将非甲基化的C转化为U，后者经PCR扩增变成T而产生T：A配对，但甲基化的C则能抵抗NaHSO3的修饰，这样DNA包含的甲基化信息就可转化为DNA序列的差异。由此发展了多种CpG岛甲基化检测方法，如BSP测序、PCR(COBRA、MSP、Methelight等)、芯片杂交技术(microarray)，此类方法适应于检测已知基因中一个或多个CpG岛的几个CpG位点的甲基化，属位点特异性DNA甲基化检测技术。其中MSP方法是目前应用最广泛的CpG岛甲基化检测方法，可检出比例为千分之一的甲基化片段。可靠的MSP，关键在于引物，其引物设计需两个已知的、包含多个完全甲基化或非甲基化CpG位点的区域，但具有上述区域的CpG岛并不多，限制了MSP的使用。

发明内容

[0004] 为了克服上述背景技术存在的缺陷，本发明针对人类MGMT基因启动子区154～172DNA序列，提供了一种Taqman荧光水解探针，还提供了一种利用该Taqman水解探针定量检测MGMT甲基化程度的方法。

[0005] 本发明的技术方案如下：

[0006] 该Taqman荧光水解探针的基本序列为GATTTGGTGAGTGTUTGGG，所述基本序列与基因组DNA序列互补区向上游延伸不超过5nt，下游延伸不超过5nt。

[0007] 一种利用上述Taqman荧光水解探针定量检测MGMT甲基化程度的方法，包括以下步骤：

[0008] (1)制备PCR反应模板

[0009] 用亚硫酸氢盐对样品基因组DNA进行甲基化转化处理；

[0010] (2)配置反应体系

[0011] 向一支PCR反应管中依次加入下列组份：

[0012] 10×PCR缓冲液 2ul；

[0013] 四种dNTP(三磷酸脱氧核苷酸)混合物 各200umol/L；

[0014] 甲基化上游引物 10～100pmol；

[0015] 甲基化下游引物 10～100pmol；

[0016] 亚硫酸盐处理后模板DNA 25～50ng；

[0017] 热启动DNA聚合酶 2.5u；

[0018] 加双蒸水至20ul；

[0019] 向另一支反应管中依次加入下列组份：

[0020] 10×PCR缓冲液 2ul；

[0021] 四种dNTP(三磷酸脱氧核苷酸)混合物 各200umol/L；

[0022] 非甲基化上游引物 10～100pmol；

[0023] 非甲基化下游引物 10～100pmol；

[0024] 亚硫酸盐处理后模板DNA 25～50ng；

[0025] 热启动DNA聚合酶 2.5u；

[0026] 加双蒸水至20ul；

[0027] (3)将反应体系置于荧光PCR反应仪中，按照以下程序进行反应；PCR反应程序：

[0028] 95℃ 10min；

[0029]

[0030] 72℃ 2min；

[0031] (4)通过荧光PCR仪配套软件获取分别对应于两支PCR反应管的甲基化反应的Ct值和非甲基化反应的Ct值；

[0032] (5)按照以下计算式CG TG

[0033] 甲基化百分含量＝100/[1+2(Ct -CT )]％

[0034] 计算得到MGMT甲基化程度。

[0035] 本发明与现有技术相比具有以下明显的优点和有益效果：

[0036] 1、特异性强：引物对P1，P2或者P3，P4是针对MGMT基因启动子区特定区域序列设计，具有不与基因组中其它序列互补的特点，保证了PCR反应的特异性。本发明所设计的Taqman水解探针位于P1(P3)，P2(P4)之间，其序列也仅与该区域的序列互补，双重保证了PCR的特异性。

[0037] 2、可准确定量：本设计包含两对PCR引物，P1/P2引物结合Taqman水解探针可定量检测甲基化DNA模板，P3/P4结合Taqman水解探针可定量检测非甲基化DNA模板。由于甲基化DNA模板与非甲基化DNA模板总和为100％，据此可计算出混合样本中甲基化DNA模板的百分含量。

[0038] 3、具备所有实时定量PCR优势：甲基化DNA含量的检测与其它实时定量PCR反应区别在于样本的前期处理，即亚硫酸盐的处理，使得DNA包含的甲基化信息就转化为DNA序列的差异。经过处理后的DNA与其它实时定量PCR原理和操作相同，所以具备实时定量PCR的所有优势，如快速，灵敏，无污染等。

[0039] 4、应用本发明的检测结果可对脑胶质瘤等恶性肿瘤的化疗用药提供临床指导，具有高特异性，高灵敏度和准确定量等优势。

附图说明

[0040] 图1为本发明的PCR反应示意图。

[0041] 图2为Taqman荧光水解探针检测甲基化和非甲基化示意图。

具体实施方式

[0042] 本发明针对人类MGMT基因启动子区154～172DNA序列，设计一条Taqman荧光水解探针，与该区段DNA序列互补。其碱基组成为：GATTTGGTGAGTGTUTGGG，探针可向上游延伸5个碱基(即与149～172区段DNA序列互补)或者向下游延伸5个碱基(即与154～177区段DNA序列互补)。结合MSP方法检测MGMT甲基化的引物，采用荧光定量技术对MGMT基因甲基化进行荧光定量检测。

[0043] 本发明的检测过程原理如下：先用重亚硫酸盐处理待测DNA片段。设计一个能与待测位点区互补的探针，探针的5′端连接报告荧光，3′端连接淬灭荧光，随后行实时定量PCR，引物一般是MSP引物。当模板为甲基化时P1/P2引物得到扩增，扩增产物特异性地与探针杂交，则在PCR用引物延伸时，TaqDNA聚合酶5′到3′端的外切酶活性会将探针序列上5′端的报告荧光切下，淬灭荧光不再能对报告荧光进行抑制，这样报告荧光发光，测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及水平；同理，若标记的探针未能与DNA杂交，则引物延伸不能跳过未甲基化位点，报告荧光不被切下，不发光。同样方法，也可对引物进行荧光标记，并通过不同标记的组合，检测多个位点的甲基化水平。

[0044] 针对人类MGMT基因启动子区118～137区域5个CpG岛以及174～195区域4个CpG，设计两对引物，分别检测甲基化DNA(P1/P2)引物和非甲基化DNA(P3/P4引物)。P1和P3所覆盖的CpG岛区域相同，而P2和P4覆盖的CpG岛区域相同，区别是P1/P2与MGMT基因中甲基化DNA序列互补，而P3/P4与非甲基化DNA序列互补。在P2上游设计一条Taqman水解探针，并在探针上加上3个LNA(Locked Nucleic Acid)锁结构。探针长度为19nt，序列为GATTTGGTGAGTGTUTGGG，探针与P2引物非常靠近(只间隔1个碱基)；探针序列高度特异，不形成二级结构；GC含量为47％，Tm值为68℃；探针序列中无4个或4个以上的G重复出现。以上这些特点，保证了PCR的特异性和重复性。本发明探针不与任何引物形成二级结构，PCR产物长度为81bp和93bp，保证了实时定量PCR的高效性。基因组DNA经过亚硫酸盐处理后，非甲基化DNA序列中的C转化为U，后者经PCR扩增变成T而产生T：A配对，但甲基化的C则能抵抗亚硫酸盐的修饰，这样DNA包含的甲基化信息就可转化为DNA序列的差异。以亚硫酸盐处理后的DNA链为模板，经P1/P2引物和本发明所设计的Taqman水解探针，定量检测甲基化DNA模板的含量，P3/P4结合Taqman水解探针检测非甲基化DNA模板，经过公式计算甲基化模板在基因组中的百分比。

[0045] 下面结合附图，举例说明。

[0046] 本发明的操作步骤如下：

[0047] Taqman荧光水解探针定量检测MGMT甲基化程度的方法，包括以下步骤：

[0048] (1)制备PCR反应模板

[0049] 用亚硫酸氢盐对样品基因组DNA进行甲基化转化处理；

[0050] (2)配置反应体系

[0051] 向一支PCR反应管中依次加入下列组份：

[0052] 10×PCR缓冲液 2ul；

[0053] 四种dNTP(三磷酸脱氧核苷酸)混合物 各200umol/L；

[0054] 甲基化上游引物 10～100pmol；

[0055] 甲基化下游引物 10～100pmol；

[0056] 亚硫酸盐处理后模板DNA 25～50ng；

[0057] 热启动DNA聚合酶 2.5u；

[0058] 加双蒸水至20ul；

[0059] 向另一支反应管中依次加入下列组份：

[0060] 10×PCR缓冲液 2ul；

[0061] 四种dNTP(三磷酸脱氧核苷酸)混合物 各200umol/L；

[0062] 非甲基化上游引物 10～100pmol；

[0063] 非甲基化下游引物 10～100pmol；

[0064] 亚硫酸盐处理后模板DNA 25～50ng；

[0065] 热启动DNA聚合酶 2.5u；

[0066] 加双蒸水至20ul；

[0067] (3)将反应体系置于荧光PCR反应仪中，按照以下程序进行反应；PCR反应程序(按照公知的描述方式设定如下)：

[0068] 95℃ 10min；

[0069]

[0070] 72℃ 2min；

[0071] (4)通过荧光PCR仪配套软件获取分别对应于两支PCR反应管的甲基化反应的Ct值和非甲基化反应的Ct值；

[0072] (5)按照以下计算式

[0073] 甲基化百分含量＝100/[1+2(CtCG-CTTG)]％，计算得到MGMT甲基化程度。

[0074] 如图1所示，MGMT基因启动子区DNA序列，引物序列和探针序列及模板DNA经亚硫酸盐处理后DNA序列的转变，其中CpG岛中的非甲基化的胞嘧啶(C)在亚硫酸盐处理后转化为U，但甲基化的C则不变，这样DNA包含的甲基化信息就可转化为DNA序列的差异。探针序列为序列⑥，与基因组DNA序列中154～172碱基配对。甲基化引物序列为序列④，⑤，分别与基因组中115～137和174～195碱基配对；非甲基化引物序列为⑦，⑧，分别与基因组中109～137和174～201碱基配对。

[0075] 如图2所示Taqman荧光水解探针检测甲基化和非甲基化示意图：甲基化DNA定量检测是通过甲基化特异性引物结合本发明的Taqman探针来实现的，当模板为甲基化时甲基化引物得到扩增，扩增产物特异性地与探针杂交，则在PCR用引物延伸时，TaqDNA聚合酶5′到3′端的外切酶活性会将探针序列上5′端的报告荧光切下，淬灭荧光不再能对报告荧光进行抑制，这样报告荧光发光，测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及水平。同理，非甲基化DNA定量检测是通过非甲基化引物结合本发明的Taqman探针来实现的。

[0076] 表1列出了荧光定量PCR检测结果分析及甲基化含量计算及与定义值的比较。在亚硫酸盐处理后的非甲基化DNA模板中加入不同量甲基化DNA，配制成甲基化百分含量(质量比)分别为0，10％，50％，90％和100％的混合DNA模板，以上述混合DNA为PCR反应的模板，按标准的PCR反应体系进行甲基化荧光定量PCR反应和非甲基化荧光定量PCR反应。PCR反应完成后，收集每个反应的Ct值，求每一个模板浓度的甲基化和非甲基化反应的差CG TG CG
值，根据公式Cmeth＝100/[1+2(Ct -CT )]％，求出甲基化水平。其中Ct 为甲基化反应TG
的Ct值，CT 为非甲基化反应的Ct值。将实际所得的百分含量与预先加入的甲基化百分含量比较，判断荧光定量PCR检测结果的准确性。

[0077] 表1

[0078]