改良的内切葡聚糖酶转让专利

申请号 : CN201080021302.7

文献号 : CN102428170B

文献日 : 2015-03-18

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公开的是变体内切葡聚糖酶，且特别是具有超越野生型内切葡聚糖酶的改良的性质的内切葡聚糖酶。

1.一种工艺，所述工艺包括

I)在第一糖化条件下维持浆料足以降低所述浆料的屈服应力的时间；所述浆料包括：

i)预处理的纤维素原料和

ii)内切葡聚糖酶

且然后，

II)将所述浆料与β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶混合，并在第二糖化条件下维持所述浆料足以提高所述浆料中可溶性糖类的量的时间，其中所述内切葡聚糖酶为变体内切葡聚糖酶多肽，包括：

催化结构域，所述催化结构域的氨基酸序列是对除虫链霉菌内切葡聚糖酶催化结构域SEQ ID NO:1的突变，并且在SEQ ID NO:1的S10、T12、A29、Q43、V48、A53、N68、S74、Q78、L79、T81、V82、Y91、M98、A141、S152、S185、N191、和/或Q206中的一个或多个的位置处具有选自由下列组成的组的一种氨基酸置换组合：S10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-V82I-M98V-S152M-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-T81K-V82I-M98V-S152M-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-A53P-N68I-S74P-V82I-Y91C-M98V-S185Q-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-A53P-S74P-Q78K-L79I-V82I-M98V-S152M-S185K-N191P-Q206ES10W-A29P-Q43R-V48K-A53P-S74P-V82I-M98V-N191PS10W-T12I-A29P-Q43R-A53P-N68I-S74P-V82I-M98V-S152M-S185V-N191PS10W-A29P-Q43R-A53P-S74P-V82I-M98V-S152M-N191P-Q206ES10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-S74P-V82I-M98V-S185V-N191PS10W-T12I-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68K-S74P-Q78K-V82I-M98V-S152M-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-A53P-S74P-Q78K-T81K-V82I-M98V-S152M-S185Q-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-L79I-V82I-M98V-N191PS10W-T12I-A29P-Q43R-A53P-N68I-S74P-Q78K-V82I-M98V-S152M-N191P-Q206ES10W-T12V-A29P-Q43R-A53P-N68I-S74P-L79I-V82I-M98V-S152M-N191P-Q206ES10W-T12I-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-L79I-V82I-M98V-S152M-N191P-Q

206E

S10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-T81K-V82I-M98V-S152M-N191P-Q

206E

S10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-L79I-T81K-V82I-M98V-S152M-S185Q-N

191P-Q206E

S10W-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-V82I-M98V-S152M-N191P-Q206ES10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-V82I-M98V-A141T-S152M-S185Q-N191P-Q206ES10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-L79I-V82I-M98V-S152M-N191PS10W-T12I-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-V82I-M98V-S152M-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-L79I-T81K-V82I-M98V-S152M-S1

85V-N191P-Q206E

S10W-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-L79I-T81K-V82I-M98V-S152M-S185V-N191P-Q206ES10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-L79I-T81K-V82I-M98V-S152M-S1

85G-N191P-Q206E

S10W-T12I-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-T81K-V82I-M98V-S152M-N191PS10W-A29P-Q43R-A53P-N68I-S74P-Q78K-L79I-V82I-M98V-S152M-S185V-N191P-Q206ES10W-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-L79I-V82I-M98V-S152M-S185Q-N191P-Q206ES10W-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-L79I-T81K-V82I-M98V-S152M-S185Q-N191PS10W-T12I-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-V82I-M98V-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-V82I-M98V-S152M-S185V-N191P-Q206E。

2.如权利要求1所述的工艺，其中步骤(I)中的所述浆料无纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶活性。

3.如权利要求1所述的工艺，其中所述内切葡聚糖酶是除虫链霉菌的内切葡聚糖酶或其变体。

4.如权利要求1所述的工艺，其中所述第一糖化条件包括60℃-80℃范围中的温度和酸性pH，且足以降低屈服应力的时间在5分钟到24小时的范围中。

5.如权利要求1所述的工艺，其中所述β-葡糖苷酶和/或所述纤维二糖水解酶在所述第一糖化条件下是无活性的或被快速灭活的。

6.如权利要求1所述的工艺，其中所述屈服应力相对于所述浆料的初始屈服应力减小了至少80％。

7.如权利要求6所述的工艺，其中所述屈服应力相对于所述浆料的初始屈服应力减小了至少95％，其中所述浆料的所述屈服应力被降低至小于10Pa。

8.如权利要求1所述的工艺，其中第二糖化条件包括低于所述第一糖化条件的温度的范围中的温度。

9.如权利要求1所述的工艺，其中产生的可溶性糖类的量高于参考糖化工艺中产生的可溶性糖类的量，在所述参考糖化工艺中，预处理的原料与所述内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶在第二糖化条件下维持与在根据权利要求1所述的工艺的第一糖化条件和第二糖化条件下相加的时间相等的时间。

10.一种变体内切葡聚糖酶多肽，包括：

206E

S10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-T81K-V82I-M98V-S152M-N191P-Q

206E

S10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-L79I-T81K-V82I-M98V-S152M-S185Q-N

191P-Q206E

85V-N191P-Q206E

S10W-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-L79I-T81K-V82I-M98V-S152M-S185V-N191P-Q206ES10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-L79I-T81K-V82I-M98V-S152M-S1

85G-N191P-Q206E

11.如权利要求10所述的变体内切葡聚糖酶多肽，所述变体内切葡聚糖酶多肽包括纤维素结合结构域。

12.如权利要求11所述的变体内切葡聚糖酶多肽，其中所述内切葡聚糖酶催化结构域和所述纤维素结合结构域来自同一母体内切葡聚糖酶。

13.如权利要求10所述的变体内切葡聚糖酶多肽，所述变体内切葡聚糖酶在pH4.0和

70℃下与具有如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所列的序列的酶相比具有提高的催化活性。

14.如权利要求10所述的变体内切葡聚糖酶多肽，其中所述变体内切葡聚糖酶多肽的催化结构域如SEQ ID NO:8所列。

15.如权利要求14所述的变体内切葡聚糖酶多肽，所述变体内切葡聚糖酶多肽包括纤维素结合结构域。

16.一种酶组合物，所述酶组合物包括权利要求10-14中任一项的变体内切葡聚糖酶。

17.如权利要求16所述的组合物，所述组合物还包括一种或多种另外的纤维素酶。

18.如权利要求16所述的组合物，所述组合物无β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶。

19.一种重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码权利要求10-14中任一项的变体内切葡聚糖酶多肽。

20.一种表达载体，所述表达载体包括权利要求19所述的多核苷酸。

21.根据权利要求20所述的表达载体，其中所述多核苷酸编码具有与所述催化结构域序列异源的信号序列的内切葡聚糖酶。

22.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括权利要求19所述的多核苷酸。

23.如权利要求22所述的宿主细胞，其中所述多核苷酸被整合到所述细胞的基因组DNA中。

24.如权利要求22或23所述的宿主细胞，其中所述宿主是细菌或丝状真菌。

25.如权利要求24所述的宿主细胞，其中所述宿主是曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、金孢属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)或梭孢壳属(Thielavia)物种。

26.如权利要求24所述的宿主细胞，其中所述宿主是芽孢杆菌属(Bacillus)物种。

27.如权利要求26所述的宿主细胞，其中所述芽孢杆菌属物种为解淀粉芽

孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。

28.如权利要求27所述的宿主细胞，其中所述多核苷酸编码具有氨基末端信号序列的内切葡聚糖酶多肽，所述氨基末端信号序列是序列MKRIVMVGFILLFPLNMLAGPISSIAEAQ。

29.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞分泌权利要求10-14中任一项所述的内切葡聚糖酶多肽。

30.如权利要求29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是芽孢杆菌属物种且所分泌的内切葡聚糖酶多肽被表达为包括氨基末端信号序列的前体，所述氨基末端信号序列是序列MKRIVMVGFILLFPLNMLAGPISSIAEAQ。

31.一种产生变体内切葡聚糖酶多肽的方法，所述方法包括在足以使细胞分泌所述内切葡聚糖酶多肽的条件下培养根据权利要求22或权利要求23所述的宿主细胞。

32.一种将生物质底物转化为可发酵糖类的方法，所述方法包括在适宜于产生可发酵糖类的条件下将权利要求10-14中任一项所述的变体内切葡聚糖酶与所述生物质相接触。

33.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括编码信号肽的第一氨基酸序列和编码异源多肽的第二氨基酸序列，其中所述第一序列在所述融合蛋白的氨基末端且为MKRIVMVGFILLFPLNMLAGPISSIAEAQ，并且所述第二序列不编码巨大芽孢杆菌多肽，其中所述异源多肽是变体内切葡聚糖酶多肽，包括：催化结构域，所述催化结构域的氨基酸序列是对除虫链霉菌内切葡聚糖酶催化结构域SEQIDNO:1的突变，并且在SEQIDNO:1的S10、T12、A29、Q43、V48、A53、N68、S74、Q78、L79、T81、V82、Y91、M98、A141、S152、S185、N191、和/或Q206中的一个或多个的位置处具有选自由下列组成的组的一种氨基酸置换组合：S10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-V82I-M98V-S152M-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-T81K-V82I-M98V-S152M-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-A53P-N68I-S74P-V82I-Y91C-M98V-S185Q-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-A53P-S74P-Q78K-L79I-V82I-M98V-S152M-S185K-N191P-Q206ES10W-A29P-Q43R-V48K-A53P-S74P-V82I-M98V-N191PS10W-T12I-A29P-Q43R-A53P-N68I-S74P-V82I-M98V-S152M-S185V-N191PS10W-A29P-Q43R-A53P-S74P-V82I-M98V-S152M-N191P-Q206ES10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-S74P-V82I-M98V-S185V-N191PS10W-T12I-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68K-S74P-Q78K-V82I-M98V-S152M-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-A53P-S74P-Q78K-T81K-V82I-M98V-S152M-S185Q-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-L79I-V82I-M98V-N191PS10W-T12I-A29P-Q43R-A53P-N68I-S74P-Q78K-V82I-M98V-S152M-N191P-Q206ES10W-T12V-A29P-Q43R-A53P-N68I-S74P-L79I-V82I-M98V-S152M-N191P-Q206ES10W-T12I-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-L79I-V82I-M98V-S152M-N191P-Q

206E

S10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-T81K-V82I-M98V-S152M-N191P-Q

206E

S10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-L79I-T81K-V82I-M98V-S152M-S185Q-N

191P-Q206E

85V-N191P-Q206E

S10W-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-L79I-T81K-V82I-M98V-S152M-S185V-N191P-Q206ES10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-L79I-T81K-V82I-M98V-S152M-S1

85G-N191P-Q206E

34.如权利要求33所述的融合蛋白，其中所述异源多肽的催化结构域如SEQ ID NO:8所列。

35.如权利要求33所述的融合蛋白，其中所述内切葡聚糖酶包括纤维素结合结构域。

36.如权利要求33所述的融合蛋白，所述融合蛋白包括在所述信号肽和所述异源多肽之间的间隔肽。

37.一种重组核酸，所述重组核酸包括编码权利要求33-36中任一项所述的融合蛋白的蛋白编码序列。

38.如权利要求37所述的核酸，其中所述核酸还包括与所述蛋白编码序列可操作地连接的启动子。

39.一种重组表达载体，所述重组表达载体包括权利要求38所述的核酸。

40.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括权利要求37所述的核酸。

41.如权利要求40所述的宿主细胞，所述宿主细胞是细菌细胞。

42.如权利要求41所述的宿主细胞，所述宿主细胞是芽孢杆菌属物种。

43.如权利要求42所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是巨大芽孢杆菌。

44.一种用于在巨大芽孢杆菌宿主细胞中产生异源多肽的方法，所述方法包括在分泌所述异源蛋白的条件下培养权利要求43的宿主细胞。

45.一种从预处理的纤维素原料产生可溶性糖类的方法，所述方法包括

I)在使异源多肽被分泌到培养基中的条件下培养权利要求42的细胞，其中所述异源多肽是变体内切葡聚糖酶多肽，包括：催化结构域，所述催化结构域的氨基酸序列是对除虫链霉菌内切葡聚糖酶催化结构域SEQ ID NO:1的突变，并且在SEQ ID NO:1的S10、T12、A29、Q43、V48、A53、N68、S74、Q78、L79、T81、V82、Y91、M98、A141、S152、S185、N191、和/或Q206中的一个或多个的位置处具有选自由下列组成的组的一种氨基酸置换组合：S10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-V82I-M98V-S152M-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-T81K-V82I-M98V-S152M-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-A53P-N68I-S74P-V82I-Y91C-M98V-S185Q-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-A53P-S74P-Q78K-L79I-V82I-M98V-S152M-S185K-N191P-Q206ES10W-A29P-Q43R-V48K-A53P-S74P-V82I-M98V-N191PS10W-T12I-A29P-Q43R-A53P-N68I-S74P-V82I-M98V-S152M-S185V-N191PS10W-A29P-Q43R-A53P-S74P-V82I-M98V-S152M-N191P-Q206ES10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-S74P-V82I-M98V-S185V-N191PS10W-T12I-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68K-S74P-Q78K-V82I-M98V-S152M-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-A53P-S74P-Q78K-T81K-V82I-M98V-S152M-S185Q-N191PS10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-L79I-V82I-M98V-N191PS10W-T12I-A29P-Q43R-A53P-N68I-S74P-Q78K-V82I-M98V-S152M-N191P-Q206ES10W-T12V-A29P-Q43R-A53P-N68I-S74P-L79I-V82I-M98V-S152M-N191P-Q206ES10W-T12I-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-L79I-V82I-M98V-S152M-N191P-Q

206E

S10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-T81K-V82I-M98V-S152M-N191P-Q

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S10W-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-L79I-T81K-V82I-M98V-S152M-S185V-N191P-Q206ES10W-T12V-A29P-Q43R-V48K-A53P-N68I-S74P-Q78K-L79I-T81K-V82I-M98V-S152M-S1

85G-N191P-Q206E

II)将所述预处理的纤维素原料与所分泌的异源多肽相接触。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述宿主细胞是巨大芽孢杆菌。

改良的内切葡聚糖酶

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求于2009年3月31日提交的临时申请第61/165312号的利益，其全部内容在此通过引用并入。发明领域

[0003] 本发明涉及变体内切葡聚糖酶多肽和用于糖化的新方法。

[0004] 发明背景

[0005] 纤维素生物质是用于生成糖类的重要的可再生资源。这些糖类的发酵可产生大量的终产物，比如燃料和化学药品。虽然糖类发酵为诸如乙醇的燃料相对直接，但一般称作“糖化”的纤维素生物质到诸如葡萄糖的可发酵糖类的水解转化却由于纤维素的晶体结构和其与木质素的紧密结合而是困难的(Ladisch等人.，1983，Enzyme Microb.Technol.5：82)。通过包括但不限于机械处理和化学处理的方法进行预处理提高了纤维素对水解的敏感性，可能通过打破木质素密封和破坏结晶纤维素结构而实现。该步骤之后可以是使用打破纤维素的β-1-4糖苷键的酶进行的纤维素到葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖和类似物的酶促转化。这些酶总称为“纤维素酶”。

[0006] 纤维素酶被分为三个亚类的酶：1，4-β-D-葡聚糖葡聚糖水解酶(“内切葡聚糖酶”或“EG”)；1，4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(“外切葡聚糖酶”、“纤维二糖水解酶”或“CBH”)；和β-葡糖苷酶(“β-D-葡糖苷-葡糖苷水解酶”、“纤维二糖酶”或“BG”)。参见Methods in Enzymology，1988，第160卷，第200-391页(编辑Wood，W.A和Kellogg.，S.T.)。这些酶共同作用以催化含纤维素的底物的水解。内切葡聚糖酶随机地攻击内部部分并主要攻击纤维素的无定形区域，主要产生较短的纤维素链。外切葡聚糖酶通过结合葡聚糖末端并从纤维素聚合物的末端主要释放纤维二糖(水溶性β-1，4-连接的葡萄糖二聚体)而逐渐缩短葡聚糖分子。β-葡糖苷酶将纤维二糖分裂为两个单位的葡萄糖。

[0007] 大多数纤维素酶具有多结构域结构，该多结构域结构由通过连接体肽与纤维素结合结构域(CBD)分隔的核心结构域组成(Suumakki等人.，2000，Cellulose 7：189-209)。核心或催化结构域含有活性部位(van Tilbeurgh等人.，1986，FEBS Lett.16：215；Tomme等人.，1988，Eur.J.Biochem.170：575-81)。

[0008] 存在产生纤维素酶的微生物的若干类型。这些包括真菌、放线菌和细菌。来自丝状真菌木霉Trichoderma sp.、青霉Penicillium sp.、毁丝霉Myceliophthora sp.和金孢Chrysosporium sp.的菌株的纤维素酶在水解纤维素中是尤其多产的，并且来源于这些菌株的纤维素酶先前已用来水解纤维素。然而，生产这些酶的成本和在某些工业条件下这些酶的水解效率低下已成为一个缺点。

[0009] 为了使纤维素底物的水解最大化并使到终产物(例如，生物燃料)产生的商业路线成为可能，将非常需要开发新型的纤维素酶且特别是在生物质的糖化中有用的新型内切葡聚糖酶。如根据以下公开内容的综述将变得明显地，本文所描述的发明满足了这些需要和其它需要。

[0010] 除了在生物质原料的水解中有用之外，纤维素酶具有其它的工业应用。纤维素酶在纸浆造纸工业、纺织工业中用作清洁剂成分并在动物饲料中用作添加剂。本发明的纤维素酶在这些应用中也是有用的。

[0011] 发明概述

[0012] 在一方面，本发明提供了具有改良的性质的变体内切葡聚糖酶。在一些方面，在纤维素原料的糖化所需的条件下，变体内切葡聚糖酶优于天然存在的内切葡聚糖酶。

[0013] 在第二方面，本发明提供了用于纤维素原料的糖化的改良的方法。在这些方法中，通过用内切葡聚糖酶处理，随后用其它纤维素酶处理降低了含纤维素的混合物的屈服应力(yield stress)。

[0014] 在另一方面，本发明提供了用于诸如芽孢杆菌属物种的宿主细胞中诸如内切葡聚糖酶的异源蛋白的表达和分泌的信号肽。

[0015] 在一方面，本发明涉及分离的变体内切葡聚糖酶，该变体内切葡聚糖酶包括与SEQ ID NO：1具有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约88％同一性，或至少约89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且在SEQ ID NO：1中的以下位置中的一个或多个处具有氨基酸置换或缺失的催化结构域：D1、S10、T12、Q14、G15、A29、T33、D36、S37、I41、Q43、V48、T50、N51、A53、V60、N68、S74、A77、Q78、L79、S80、T81、V82、S83、Y91、S95、M98、A102、T110、R118、I121、V131、S136、A141、T142、Q147、S152、A165、S167、S171、Q182、V184、S185、G187、L188、Q190、N191、V198、P204、Q206、N207、T219和/或T222。在一个实施方案中，在预期pH和温度条件下，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的内切葡聚糖酶的酶促性能相比，变体内切葡聚糖酶将具有改良的酶促性能。在一些实施方案中，pH条件将在pH3至pH10的范围中。在一个实施方案中，pH条件将在pH4.0至pH5.5的范围中。在其它实施方案中，温度条件将在60℃至75℃、60℃至80℃、70℃至85℃、75℃至
90℃、或75℃至95℃的范围中。在一些实施方案中，催化结构域与SEQ ID NO：1具有至少
88％的同一性。

[0016] 在另一方面，本发明涉及分离的变体内切葡聚糖酶，该变体内切葡聚糖酶包括与SEQ ID NO：1中的以下残基中的一个或多个对应的位置处的置换：D1(E/G/V)、S10(F/H/L/T/W/Y)、T12(I/V)、Q14(E/K/L/P)、G15N、A29(H/K/L/P/R/T)、T33(A/E/H/I/L/Q/R/V)、D36Y、S37E、I41V、Q43(E/K/L/M/R/V)、V48K、T50(L/P)、N51(H/K/S)、A53(G/P)、V60I、N68(H/I/K/L/V)、S74(A/E/H/K/L/N/P/Q/R/T/V)、A77V、Q78K、L79I、S80K、T81(K/N/Q/R/S)、V82I、S83(E/I/R/V)、Y91(C/F)、S95(D/H/K/N/T)、M98(I/K/Q/T/V)、A102S、T110(E/K)、R118(K/Q)、I121L、V131(E/I/M)、S136(D/E/H/K/R/T/V)、A141(D/S/T)、T142(C/F/H/M/N/S/V/W)、Q147(R/S)、S152(I/L/M/V)、A165S、S167(D/I)、S171T、Q182(I/V)、V184F、G187E、L188F、Q190(D/H)、S185(D/E/G/H/I/K/L/N/Q/R/T/V/Y)、N191(P/Q/Y)、V198I、P204L、Q206(E/R/S/V)、N207(D/G)、T219(A/C/D/E/Q)和/或T222K。在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶包括与SEQ ID NO：1具有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约88％同一性，或至少约89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且具有以上置换中的一个或多个的催化结构域。在一些实施方案中，所述催化结构域与SEQ ID NO：1具有至少88％同一性。

[0017] 在其它方面，本发明涉及具有催化结构域的分离的内切葡聚糖酶，该催化结构域包括与除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)内切葡聚糖酶催化结构域(SEQ ID NO：1)的至少80％序列同一性；和与SEQ ID NO：1中的以下位置中的一个或多个对应的位置处的氨基酸置换：D1、S10、T12、Q14、G15、A29、T33、D36、S37、I41、Q43、V48、T50、N51、A53、V60、N68、S74、A77、Q78、L79、S80、T81、V82、S83、Y91、S95、M98、A102、T110、R118、I121、V131、S136、A141、T142、Q147、S152、A165、S167、S171、Q182、V184、S185、G187、L188、Q190、N191、V198、P204、Q206、N207、T219和/或T222。在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶多肽来源于SEQ ID NO：1的催化结构域同源物，并具有相对于SEQ ID NO：1的催化结构域同源物的改良的催化活性。在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶多肽包括纤维素结合结构域。在一些实施方案中，内切葡聚糖酶催化结构域和纤维素结合结构域来自同一母体内切葡聚糖酶。在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶包括与SEQ ID NO：1具有至少约88％同一性、或至少约88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的催化结构域。

[0018] 在其它方面，本发明涉及分离的内切葡聚糖酶，其包括SEQ ID NO：7的序列或与SEQ ID NO：7具有至少95％序列同一性的SEQ ID NO：7的变体和与SEQ ID NO：7中的位置T12、V48、N68、Q78、L79、T81、S152、S185和/或Q206对应的位置中的一个或多个氨基酸置换。

[0019] 在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶包括催化结构域，该催化结构域与SEQ ID NO：8具有至少约88％同一性、或至少约89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。

[0020] 在另一方面，本发明涉及编码本发明的分离的变体内切葡聚糖酶多肽的多核苷酸序列，本发明的分离的变体内切葡聚糖酶多肽例如包括与SEQ ID NO：1具有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约88％同一性，或至少约89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且在SEQ ID NO：1中的以下位置中的一个或多个处具有氨基酸置换或缺失的催化结构域：D1、S10、T12、Q14、G15、A29、T33、D36、S37、I41、Q43、V48、T50、N51、A53、V60、N68、S74、A77、Q78、L79、S80、T81、V82、S83、Y91、S95、M98、A102、T110、R118、I121、V131、S136、A141、T142、Q147、S152、A165、S167、S171、Q182、V184、S185、G187、L188、Q190、N191、V198、P204、Q206、N207、T219和/或T222。在一些实施方案中，催化结构域与SEQ ID NO：1具有至少88％同一性。

[0021] 在另一个实施方案中，本发明涉及编码变体内切葡聚糖酶的多核苷酸序列，该变体内切葡聚糖酶在与SEQ ID NO：1中的以下残基中的一个或多个对应的位置处具有氨基酸置换：D1(E/G/V)、S10(F/H/L/T/W/Y)、T12(I/V)、Q14(E/K/L/P)、G15N、A29(H/K/L/P/R/T)、T33(A/E/H/I/L/Q/R/V)、D36Y、S37E、I41V、Q43(E/K/L/M/R/V)、V48K、T50(L/P)、N51(H/K/S)、A53(G/P)、V60I、N68(H/I/K/L/V)、S74(A/E/H/K/L/N/P/Q/R/T/V)、A77V、Q78K、L79I、S80K、T81(K/N/Q/R/S)、V82I、S83(E/I/R/V)、Y91(C/F)、S95(D/H/K/N/T)、M98(I/K/Q/T/V)、A102S、T110(E/K)、R118(K/Q)、I121L、V131(E/I/M)、S136(D/E/H/K/R/T/V)、A141(D/S/T)、T142(C/F/H/M/N/S/V/W)、Q147(R/S)、S152(I/L/M/V)、A165S、S167(D/I)、S171T、Q182(I/V)、V184F、G187E、L188F、Q190(D/H)、N191(P/Q/Y)、S185(D/E/G/H/I/K/L/N/Q/R/T/V/Y)、V198I、P204L、Q206(E/R/S/V)、N207(D/G)、T219(A/C/D/E/Q)和/或T222K。在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶包括与SEQ ID NO：1具有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约88％同一性或至少约89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且具有以上置换中的一个或多个的催化结构域。

[0022] 在一些实施方案中，本发明涉及分离的变体内切葡聚糖酶，其包括与SEQ ID NO：3具有至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约88％同一性，例如，或至少约89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的催化结构域。

[0023] 在又一方面，本发明涉及包括与启动子可操作地连接的本文所描述的多核苷酸的载体。

[0024] 在另一方面，本发明涉及用编码如本文所描述的变体内切葡聚糖酶的多核苷酸或载体转化的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是丝状真菌细胞，在其它实施方案中，宿主细胞是细菌细胞，比如芽孢杆菌细胞。在又一方面，本发明涉及产生如本文所描述的变体内切葡聚糖酶的方法，该方法包括在足以产生内切葡聚糖酶的条件下培养用编码变体内切葡聚糖酶的载体转化的宿主细胞，并获得所产生的内切葡聚糖酶。

[0025] 在其它方面，本发明涉及将生物质转化为可发酵糖类的方法，该方法包括在适合产生可发酵糖类的条件下将如本文所描述的变体内切葡聚糖酶与生物质底物相接触。在一个实施方案中，在发酵中将可发酵糖类分别地或同时地与微生物相接触以产生终产物。在另一个实施方案中，微生物是酵母且终产物是醇(例如，乙醇)。在又一个实施方案中，发酵是同步糖化发酵(SSF)，和在其它实施方案中，糖化步骤和发酵步骤是连续的。

[0026] 在另外的方面，本发明涉及包括本发明的变体内切葡聚糖酶的酶组合物。在一些实施方案中，酶组合物在用于糖化应用的组合物中使用。在一些实施方案中，酶组合物在用于处理纺织品的应用中使用。在另外的实施方案中，酶组合物在用于处理纸浆或纸的应用中使用。在又一些其它的实施方案中，酶组合物用于清洁应用(例如，清洁剂组合物)中。在其它实施方案中，酶组合物可用作饲料添加剂。在另外的实施方案中，包括本发明的变体内切葡聚糖酶的酶组合物将包括其它酶(例如，一种或多种其它纤维素酶)。

[0027] 附图简述

[0028] 图1描绘了(A)包括野生型除虫链霉菌内切葡聚糖酶(EG)的催化结构域(CatD)的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)；(B)“CDX-SavOcat”的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，其为通过添加N-末端间隔子DTSM(SEQ ID NO：16)而修饰的野生型除虫链霉菌EG CatD；和(C)野生型除虫链霉菌EG的氨基酸序列，其包括信号肽和纤维素结合结构域，具有GenBank登录号NP_821730(SEQ ID NO：3)。

[0029] 图2描绘了(A)SEQ ID NO：4，其为编码天然除虫链霉菌EG catD和纤维素结合结构域的密码子优化的多核苷酸序列，和(B)SEQ ID NO：5，其为编码具有提供的N-末端间隔子的野生型除虫链霉菌EG catD和纤维素结合结构域的密码子优化的多核苷酸序列。

[0030] 图3示出了在高流通量条件下使用Avicel(200g/L)作为底物在50℃、60℃和70℃下和在pH(4.4-6.8)时CDX-SavOcat(SEQ ID NO：2)的活性曲线。通过HPLC来测量纤维二糖和葡萄糖的产生。CDX-SavOcat(SEQ ID NO：2)在pH 5和50℃时表现出最佳活性，且在pH 4.4和70℃时观察到可检测的内切葡聚糖酶活性。

[0031] 图4示出了通过多种SavO EG变体经48小时的纤维二糖和葡萄糖产生。条件：200g/l Avicel，pH 4，70℃。N＝3，误差线代表±1标准偏差。

[0032] 图5显示了通过CDX-SavOcat(SEQ ID NO：2)和SavO变体5(SEQ ID NO：8)经48小时的葡萄糖产生。条件：200g/l Avicel，pH 5，65℃。N＝3，误差线代表±1标准偏差。

[0033] 图6显示了与巨大芽孢杆菌(B.megaterium)信号肽(SEQ ID NO：9)相连接的SavO内切葡聚糖酶变体的高水平产生。阳性对照：巨大芽孢杆菌优化的信号肽。测定条件：5mM pNPC，pH 5，45℃持续1小时。

[0034] 发明详述

[0035] I.综述

[0036] 用于从纤维素原料产生乙醇和其它有价值的化合物的目前的方法一般需要三个过程：

[0037] a)原料的预处理；

[0038] b)原料中纤维素的水解以产生可溶性糖类(糖化)；

[0039] c)糖类的发酵以产生所需要的产物，和产物的回收。

[0040] 本发明部分地涉及第二过程，预处理的原料中纤维素的酶促水解产生可发酵可溶性糖类。以下的章节II提供了用于本公开内容的选定的术语的定义。在以下的章节III中，描述了新颖的糖化过程，其中特别是将内切葡聚糖酶与纤维素生物质合并，并随后用其它纤维素酶处理。在章节IV中，描述了具有所需要的性质的变体内切葡聚糖酶蛋白。这些内切葡聚糖酶可用于章节III中所描述的糖化中，以及用于许多其它目的。章节IV还描述了与异源多肽序列融合的信号肽序列，其导致了从诸如芽孢杆菌属物种且特别是巨大芽孢杆菌的细菌宿主的高水平的分泌。信号肽可用于如章节III中所描述的内切葡聚糖酶的产生，以及用于其它纤维素酶蛋白和非纤维素酶蛋白的表达。章节V提供了实验实施例，包括可用于进行本发明的方法。

[0041] 将理解地是，为清楚起见将说明书组织成独立章节，且任何章节中的公开内容可与任何其它章节中的公开内容相组合。例如，章节II中所列的原料可用于章节III中所描述的过程中，章节III中所描述的过程可利用章节IV中所描述的EG变体来进行，等等。

[0042] II.定义

[0043] 除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语一般具有与本发明所属领域中的普通技术人员所通常理解的相同的含义。一般，本文使用的命名和以下所描述的分析化学、细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学和杂交中的实验室方法是本领域中熟知的且常用的那些。对核酸和肽合成使用了标准技术。一般，酶促反应步骤和纯化步骤根据生产商的说明书来进行。

[0044] 本发明利用了分子生物学、细胞培养、流变学和酶学中的多种常规方法。对于基因工程中所用的技术，参见，例如，Sambrook等人.，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel，编辑，Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验方法汇编)，1990-2008，John WIley Interscience。对于化学合成和化学分析应用了标准技术或其修改形式。

[0045] “生物质”、“纤维素底物”、“纤维素原料”和“原料”在本文中可互换使用来指含有纤维素的材料。生物质可来源于植物、动物或微生物，且可包括农业和林业残余物、工业废弃物和用于能源目的而种植的陆地和水生作物。生物质的例子包括但不限于，玉米粒、玉米芯、作物残余物诸如玉米壳、玉米秸秆、草、小麦、麦秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻秆、柳枝稷、废纸、甘蔗渣、高粱、大豆、获自碾磨谷物的成分、树、树枝、根、叶、木屑、锯木、灌木和灌木丛、蔬菜、水果和花。

[0046] “预处理的纤维素原料”是利用本领域中已知的方法处理的含纤维素的材料，诸如化学、物理和生物预处理(例如，机械破碎、蒸汽喷发、制浆、碾磨、酸水解、溶剂接触和类似方法)以提高纤维素对水解的敏感性。

[0047] “SavO EG”指除虫链霉菌内切葡聚糖酶。

[0048] “催化结构域”或“CatD”指多肽的结构区，其包括底物水解的活性位点。除虫链霉菌内切葡聚糖酶“SavO-EG”SEQ ID NO：1的氨基酸序列包括CatD。

[0049] 术语“纤维素酶”指能够水解纤维素(β-1，4-葡聚糖或β-D-葡糖苷键)至较短的纤维素链、寡糖、纤维二糖和/或葡萄糖的一类酶。

[0050] “内切葡聚糖酶”或“EG”指水解纤维素的内部β-1，4葡糖苷键的一类纤维素酶(E.C.3.2.1.4)。

[0051] “外切葡聚糖酶”、“外-纤维二糖水解酶”或“CBH”指从纤维素的还原端或非还原端水解纤维二糖的一类纤维素酶(E.C.3.2.1.91)。

[0052] “β-葡糖苷酶”或“纤维二糖酶”或“BGL”指催化纤维二糖水解为葡萄糖的β-葡糖苷酶葡糖苷水解酶(E.C.3.2.1.21)。

[0053] “完全纤维素酶”或“纤维素酶混合物”指包括CBH、EG和BGL纤维素酶的组合物。纤维素酶混合物是已知的(参见，例如Viikari等人.，2007，“Thermostable enzymes in lignocellulose hydrolysis(木质纤维素水解中的热稳定酶)”AdvBiochem Eng Biotechnol 108：121-45，和授权于Iogen EnergyCorp.，的美国专利公布第US 2009/0061484号、第US 2008/0057541号、和第US 2009/0209009号，其每一项在此为所有目的通过引用并入。其它的例子包括来自诸如以下的纤维素酶：里氏木霉、嗜酸纤维素分解菌(Acidothermus cellulolyticus)、嗜热放线菌(Thermobiﬁda fusca)、灰腐质霉(Humicola grisea)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophilia)和金孢Chrysosporium sp.，基因工程化的纤维素酶的组合和商业上可获得的纤维素酶TM TM
混合物( 例如，ACCELLERASE 1000(Danisco)ACCELLERASE 1500(Danisco)、CELLIC CTEC2(Novozymes))。

[0054] “编码序列”指核酸的编码蛋白的氨基酸序列的部分。

[0055] 术语“接触”指将相应的酶或相应的微生物放置在与相应的底物足够靠近的位置以使酶或微生物将底物转化成产物成为可能。本领域中的技术人员将认识到将酶的溶液或微生物的培养物与相应的底物相混合将实现接触。

[0056] 术语“培养(culturing)”和“培养(cultivation)”指在液体或固体培养基中在适宜的条件下使微生物细胞的群体生长。在一些实施方案中，培养指纤维素底物发酵性的生物转化为终产物。

[0057] “缺失”指与参考多肽相比通过移除一个或多个氨基酸而对多肽的修饰。

[0058] “清洁剂”指预期在用于洗涤染污织物的洗涤介质中使用的混合物。这种组合物除纤维素酶和表面活性剂之外可包括其它水解酶、助洗剂、漂白剂、漂白活性剂、上蓝剂和荧光染料、抗结块剂、掩蔽剂、纤维素酶激活剂、抗氧化剂和增溶剂。

[0059] 如本文所用的，术语“表达”包括多肽产生中涉及的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

[0060] “饲料添加剂”指为了本领域已知的目的使用纤维素酶用于动物饲料处理，所述目的例如，为在谷物湿磨过程中或干磨过程中增加食物产物(food products)并减少谷物中的纤维。

[0061] “糖化”指其中通过纤维素酶的作用分解底物(例如，纤维素生物质)以产生可发酵的糖类(例如，单糖，例如但不限于葡萄糖)的过程。“糖化”还指其中水解纤维素底物以产生可溶性糖类(葡萄糖和纤维二糖)的过程。

[0062] “可发酵糖类”意为单糖(simple sugars)(单糖、二糖和短寡糖)，例如但不限于葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和蔗糖。

[0063] 本文所用的术语“可溶性糖类”指纤维二糖和葡萄糖。

[0064] 如本文所用的，术语“发酵”宽泛地用来指利用诸如可发酵或可溶性糖类的单糖(simple sugars)作为能源以获得所需产物来培养微生物。

[0065] “宿主细胞”指包括编码异源蛋白质的DNA的表达载体的适宜宿主及其子代，所述异源蛋白质比如本发明所包含的变体EG。本发明中有用的宿主细胞一般是原核宿主或真核宿主，包括任何其中可实现表达的可转化微生物。

[0066] “改良的酶性能”和“提高的催化活性”指变体内切葡聚糖酶多肽的改良的性质，其可通过比活(例如，所产生的产物/时间/蛋白重量)的统计学显著的增加或在由所需pH和温度指定的条件下与参考内切葡聚糖酶相比底物到产物的转化百分比的统计学显著的增加来表示。实施例中提供了测定酶活性的示例性方法，其可包括但不限于，通过HTP筛查或HPLC测量从结晶纤维素产生纤维二糖。任何有关酶活性的性质可被影响，包括经典酶性质Km、Vmax或kact，其改变可导致提高的酶活性。

[0067] 本发明的内切葡聚糖酶的“改良的性质”可包括增加的蛋白表达、热活性、热稳定性、pH活性、pH稳定性、产物特异性、提高的比活、底物特异性、对底物或终产物抑制的提高的抗性、改变的pH/温度曲线和化学稳定性。

[0068] 如本文所用的术语“改良的热稳定性”意为变体酶相对于野生型酶表现出“剩余活度”的增加。剩余活度的测定是通过将变体酶和参考(例如，野生型)酶暴露于增高的温度的压力条件持续一段时间，且然后在野生型酶通常具有活性的条件下测定内切葡聚糖酶活性来进行的。例如，将暴露于压力条件的酶的内切葡聚糖酶活性(“a”)与未暴露于压力条件的酶的对照(“b”)相比，且剩余活度等于比率a/b。具有增高的热稳定性的变体将比野生型酶具有更高的剩余活度。在一个实施方案中，酶暴露于65℃下pH5的压力条件持续6小时，但可使用本文所描述的任何培养条件。

[0069] 将核酸序列插入到细胞的上下文中的术语“导入”意思是被转染、转导或转化(总称“转化”)，并包括指将核酸序列加入真核细胞或原核细胞中，其中核酸加入细胞的基因组中。

[0070] 提及细胞时使用的术语“转化(transformed)”或“转化(transformation)”指细胞具有整合入其基因组或作为游离型质粒在多代中维持的非天然核酸序列。

[0071] “分离的”指利用标准微生物和重组技术有意地从其宿主细胞分离的生物活性的内切葡聚糖酶。该术语还包括从其宿主细胞组分中纯化的内切葡聚糖酶。例如，“分离的多肽”指与天然伴随它的其它污染物基本上分离的多肽，例如，蛋白、脂质和多核苷酸。该术语包括已从其天然存在的环境或表达系统(例如，宿主细胞或体外合成中)移去或纯化的多肽。

[0072] “多核苷酸”具有其在本领域中的通常含义。

[0073] “信号序列”或“信号肽”指蛋白的N-末端部分的氨基酸序列，其协助成熟形式的蛋白分泌到细胞外面。成熟形式的细胞外蛋白缺乏信号序列，其在分泌过程中被切离。

[0074] 术语“前蛋白”指包括所结合的氨基末端信号肽(或前导肽)的蛋白。在分泌过程中信号肽通过信号肽酶从前蛋白中分裂而导致成熟的或分泌的蛋白。

[0075] “同步糖化发酵(SSF)”指其中在糖化反应中从纤维素中分解的可发酵糖类(例如，葡萄糖)同时通过发酵转化成终产物(例如，醇，例如但不限于乙醇)的过程。

[0076] “变体内切葡聚糖酶”或“基因工程化的内切葡聚糖酶”指通过操作从含有催化结构域的参考内切葡聚糖酶得到的本发明的内切葡聚糖酶。变体内切葡聚糖酶的构建可通过修饰DNA序列(编码诸如与所需信号肽融合的来自除虫链霉菌的天然成熟内切葡聚糖酶)、将该DNA序列转化到适宜的宿主中、并表达该修饰的DNA序列以产生酶来进行。参考内切葡聚糖酶可以是天然存在的内切葡聚糖酶或重组的变体内切葡聚糖酶。

[0077] 变体内切葡聚糖酶的氨基酸序列通过置换前体/母体氨基酸序列中的一个或多个氨基酸来源于“前体”或“母体”内切葡聚糖酶氨基酸序列。

[0078] “载体”是用于将DNA序列导入到细胞中的DNA构建体。载体可以是表达载体，其与能够实现DNA序列中所编码的多肽在适宜的宿主中表达的适宜的控制序列可操作地连接。“表达载体”具有与DNA序列(例如，转基因)可操作地连接的启动子序列以驱动宿主细胞中的表达。

[0079] 术语“野生型”或“天然的”在本文中可互换使用，而且当用于多肽或蛋白时，意为由自然界中天然存在的微生物表达的多肽或蛋白。因此，“野生型除虫链霉菌EG”和“天然除虫链霉菌EG”是相同的。

[0080] 除非上下文另外清楚地表示，如本文所用的，“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数的指代。

[0081] 术语“包括(comprising)”及其同源词以其包括性含义使用；即，等同于术语“包括(including)”和其对应的同源词。

[0082] 如本发明中所用的“对应的残基”指出现于变体内切葡聚糖酶中的残基，其存在于与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7中的位置等同的位置中，由一级序列同源物、三级结构同源物或功能等价物表示。因此，给定聚合物的残基数目或残基位置相对于参考序列(例如，SEQ ID NO：1)来标明，而并非通过给定氨基酸或多核苷酸序列中残基的实际数字位置来标明。例如，通过引入空位来优化两个序列之间的残基匹配可将给定氨基酸序列与参考序列进行比对。在这些情况中，虽然存在空位，变体内切葡聚糖酶序列中残基的编号相对于与其比对的SEQ ID NO：1来进行。关于本发明的变体内切葡聚糖酶，用于比对的序列对比算法和精确参数与用于序列同一性测定的相同，且随后在详细描述中被描述。

[0083] 两个或多个多肽序列上下文中“同一性”或“百分比同一性”指当跨比较窗口或跨如利用序列对比算法或通过人工比对和直观检查所测量的指定区域进行最大一致的对比和比对时，两个或多个序列或子序列是相同的或具有特定的相同氨基酸残基百分比(即，在特定区域中与参考序列共享至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约88％同一性，例如，或至少约89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)。关于本发明的变体内切葡聚糖酶，用于序列同一性测定的序列对比算法和精确参数随后在详细描述中被描述。

[0084] 如本文所用的，术语“浆料”指包括悬浮固体的水性混合物，所述悬浮固体包括来源于生物质的纤维素。

[0085] 以下的名称可用来描述相对于母体序列变体多肽(或核酸)序列中的置换：“R-#”或“R-#-V”，其中“#”指参考序列中的位置和指变体或同源序列中对应的残基，“R”指参考序列中的该位置处的氨基酸，和“V”指变体序列中该位置处的氨基酸，使用了IUPAC单字母定名。例如，对于关于SEQ ID NO：1所描述的变体内切葡聚糖酶，“S10”代表：在变体EG中，在与SEQ ID NO：1的第10位处的丝氨酸对应的位置处的残基被非丝氨酸的氨基酸所替代，和“S10W”意为：在与SEQ ID NO：1的第10位处的丝氨酸对应的位置处的残基被色氨酸所替代，且氨基酸位置通过变体序列与SEQ ID NO：1的最优比对来确定。因此，对于SavO变体5(以下所讨论的)“S10W”意为：与SEQ ID NO：1的残基10对应的位置处的残基是色氨酸(例如，SEQ ID NO：8的第10位)。对于同源EG结构域的变体，“S10W”意为：在变体中与SEQ ID NO：1的第10位对应的位置处的残基是色氨酸。例如，在浅青紫链霉菌(S.lividans)Cel12 EG变体中，“S10W”意为SEQ ID NO：14的第10位处的苏氨酸残基被色氨酸所替代。通过将变体和同源物的氨基酸序列与参考SavO序列(例如，SEQ ID NO：1)相比对，可能为变体或同源物中的任何氨基酸残基分配氨基酸位置编号。如将变得清楚地，“R-#-(V1/V2/…VN)”意为变体中位置#处的残基选自V1、V2、……VN。在包括多个置换的变体中，改变形式由分号(；)或加号(“+”)隔开，例如，“S10W；A29P；Q43R；”或“S10W+A29P+Q43R。”

[0086] III.改良的糖化工艺

[0087] 在一方面本发明提供了糖化工艺，其中诸如葡萄糖和纤维二糖的可溶性糖类以高固体含量(例如，大于预处理生物质干重的5％，大于预处理生物质干重的10％，大于预处理生物质干重的20％，大于预处理生物质干重的25％，大于预处理生物质干重的30％，或大于预处理生物质干重的35％)从起始物料中有效产生。

[0088] 在一个实施方案中，工艺包括在第一糖化条件下维持含有(i)预处理的纤维素原料和(ii)内切葡聚糖酶的浆料，持续足以降低该浆料的屈服应力的时间；然后将该浆料与β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶组合并在第二糖化条件下维持该浆料足以增加浆料中的可溶性糖类的量的时间。

[0089] 在工艺的起始步骤中，内切葡聚糖酶与原料在水溶液中相组合以形成浆料。通常将一种内切葡聚糖酶与原料组合，但考虑了多种内切葡聚糖酶的添加。以下在本章节III、章节IV中和贯穿本公开内容中讨论了多种适宜的内切葡聚糖酶的性质。

[0090] 可在添加内切葡聚糖酶之前、在添加内切葡聚糖酶之时、或在添加内切葡聚糖酶之后，调整浆料的pH和组成(例如，盐、金属、表面活性剂及其类似物的含量)，以提供有利于内切葡聚糖酶活性的条件。如所述的，浆料可能具有高固体含量。然而该方法可用来处理具有宽泛范围的固体含量的混合物。

[0091] 一般，浆料中的原料将至少被最低程度地预处理(例如，机械破碎生物质)，且预处理通常包括另外的操作，比如蒸汽喷发、酸水解和类似的操作。在一些实施方案中，可将内切葡聚糖酶添加到含有最低程度预处理的生物质的浆料中，且进一步的预处理可在第一糖化条件的至少一部分期间继续进行。

[0092] 优选地，包括预处理的纤维素原料和内切葡聚糖酶的浆料基本上无纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶活性。有多种方式制备含纤维素原料和内切葡聚糖酶的浆料，但其基本上无其它纤维素酶。在一种方法中，基本上无纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的内切葡聚糖酶组合物与浆料中预处理的原料相组合。等同地，含有内切葡聚糖酶但基本上无纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶蛋白的培养基或肉汤可与预处理的原料相组合。在另一种方法中，将表达和分泌内切葡聚糖酶但不表达和分泌纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶的细胞在含有纤维素原料的浆料中培养。在另一种方法中，在其中非内切葡聚糖酶纤维素酶具有降低的活性的第一糖化条件下，将含有内切葡聚糖酶和其它纤维素酶的纤维素酶组合物(例如，肉汤)与原料相组合。在这种情况中，在暴露于指定条件15分钟后，相对于最佳pH和温度下的纤维素酶活性，如果纤维素酶(例如，纤维二糖水解酶或β-葡糖苷酶)具有小于20％的酶活性，且优选地小于10％的酶活性，则在特定的温度和pH下纤维素酶具有降低的活性。在又一种方法中，在其中非内切葡聚糖酶纤维素酶失活或被快速灭活的第一糖化条件下，将含有内切葡聚糖酶和其它纤维素酶的纤维素酶组合物(例如，肉汤)与原料相组合。在这种情况中，在暴露于指定条件15分钟后，相对于最佳pH和温度下的纤维素酶活性，如果纤维素酶(例如，纤维二糖水解酶或β-葡糖苷酶)具有小于5％的酶活性，且优选地小于1％的酶活性，则在特定的温度和pH下纤维素酶是失活的。纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶活性可利用常规技术来测量，包括以下实施例13和14中所描述的方法。

[0093] 在一些实施方案中，如果很少或没有检测到纤维二糖水解酶或β-葡糖苷酶活性，则可认为浆料基本上无其它纤维素酶。在一些实施方案中，没有检测到纤维二糖水解酶或β-葡糖苷酶活性，除了归因于内切葡聚糖酶自身和/或由原料中的内源性纤维素酶引起的任何此类活性。

[0094] 在本发明的一些实施方案中，当浆料中或添加到浆料中的EG的比例显著超过存在的任何催化活性的BGL和CBH多肽时，可认为浆料基本上无其它纤维素酶。

[0095] 在本发明的一些实施方案中，如果内切葡聚糖酶与非内切葡聚糖酶纤维素酶(BGL+CHB)的重量比大于5∶1，优选地大于10∶1，优选地大于20∶1，优选地大于50∶1，优选地大于100∶1，则可认为浆料基本上无其它纤维素酶。

[0096] 在一些实施方案中，如果总细胞外蛋白的重量比的至少10％，优选地至少20％，甚至更优选地至少30％为EG，则可认为浆料基本上无其它(非EG)纤维素酶。细胞外蛋白意为非细胞内的蛋白，且通常主要是分泌性蛋白。

[0097] 在一些实施方案中，内切葡聚糖酶可由表达高水平的EG(例如，由于生物体的基因组的基因工程所导致)以提高重组EG活性和产量的生物体来产生，但该生物体还产生低水平(例如，内源性水平或野生型水平)的BGL和CBH。在这些实施方案中，EG比BGL+CBH的组合的摩尔过量可以至少约为5∶1，至少约为10∶1，至少约为20∶1，至少约为50∶1，至少约为100∶1或甚至至少约为500∶1。

[0098] 在第一糖化条件下维持浆料，持续足以降低浆料的屈服应力的时间。“屈服应力”指在浆料移动前需要施加的最小压力(力/面积)。屈服应力被定义为利用常规流变学方法在25℃时所测量的相角变为大于45°时的应力。用于测量屈服应力的示例性方法在本领域中是已知的，且在以下的实施例11中被描述。

[0099] 第一糖化条件是：在该条件下内切葡聚糖酶是活性的，而且在一些情况中，该条件可能接近于最适合所用的内切葡聚糖酶的pH和温度。优选地，内切葡聚糖酶是嗜热的，且第一糖化条件包括大于50℃的温度，比如在50℃和85℃之间、有时在60℃和80℃之间、有时在65℃和80℃之间、有时在70℃和80℃之间、和有时在75℃和80℃之间的范围内。可使用宽泛范围的pH，例如酸性pH(pH＜6)、碱性pH(pH＞8)或中性pH(pH 6-8)。在一些实施方案中，第一糖化条件包括酸性pH(例如，比如3-6范围中的pH，通常为3.5-5范围中的pH)。

[0100] 通常足以降低浆料的粘度或屈服应力的时间在1分钟和96小时之间，且优选地为1小时和48小时之间。通常时间至少约为1小时，至少约为2小时、至少约为5小时、至少约为10小时、或至少约为12小时，且小于约36小时或小于约24小时。在一些实施方案中，时间足以使浆料的粘度或屈服应力与起始物料(例如，紧接添加内切葡聚糖酶之前或之后的浆料)相比降低了至少50％，通常降低了至少80％、有时降低了至少90％、且在一些实施方案中，达到了至少95％、或甚至至少99％的降低。所需要的是，屈服应力小于300Pa、更优选地小于100Pa、甚至更优选地小于30Pa，和在一些情况中小于10Pa，以促进本文以下所描述的可溶性糖类(葡萄糖和纤维二糖)产生。此外，降低屈服应力提高了浆料的可泵性。
参见，例如，Roche等人.，2009，Biotech and Bioengg 104：290-300。

[0101] 将理解地是，随着浆料的屈服应力的降低，浆料的粘度减小了。在示例性的实施方3 4 5
案中，在内切葡聚糖酶处理之前，浆料的粘度大于10Pa-s、大于10Pa-s、大于10Pa-s、或
6
大于10Pa-s。在一些实施方案中，在第一糖化条件下维持浆料期间，浆料的粘度减小了至少10倍，优选地为至少100倍，且通常为至少500倍。在一些实施方案中，在第一糖化条件下维持浆料期间，浆料的粘度减小至小于约1000Pa s、常为小于约500Pa s、更常为小于约
100Pa s，且有时小于约50Pa s。

[0102] 应理解地是，温度和较小程度上的pH可在工艺工程中改变，例如，当预处理的原料随时间推移冷却时。通常，温度和pH保持在指定的范围内，至少持续足以降低屈服应力的时间。

[0103] 示例性的第一糖化条件是在50℃-75℃和pH 3.5-5下0.1小时至10小时。

[0104] 在第一糖化条件下用内切葡聚糖酶处理后，将浆料与纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶相组合，并在第二糖化条件下维持浆料，持续足以提高浆料中可溶性糖类(葡萄糖和纤维二糖)的量的时间。用内切葡聚糖酶维持纤维素原料的过程有时被称为“第一步骤”，且用其它纤维素酶处理第一步的产物的随后过程有时被称为“第二步骤”。

[0105] 在第二步骤中，将第一步骤中产生的部分水解的生物质与一种或多种纤维素水解酶和一种或多种β-葡糖苷酶和任选地其它酶相组合，所述其它酶比如，例如，内切葡聚糖酶、蛋白酶、半纤维素酶、木糖葡聚糖酶、β-木糖苷酶、木聚糖内切酶、α-L-阿拉伯呋喃糖酶、α-和葡糖醛酸糖苷酶。纤维素酶可以是“完全的”，比如，例如，来自里氏木霉或嗜松青霉(Penicillium pinophilum)的肉汤(Singh等人.，2009，Bioresour.TMTechnol.100：6679-81)或商业上可获得的产品，比如ACCELERASE 1000(Danisco)和TM
CELLUCLAST (Novozymes)。可选地，纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶其中之一或二者可作为浓缩的或纯化的组合物来添加。在另一个方法中，可添加表达纤维二糖水解酶和/或β-葡糖苷酶的细胞，或来自这些细胞的肉汤。

[0106] 在一些实施方案中(当使用完全纤维素酶时)，在第二步骤中将内切葡聚糖酶与纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶一起添加到浆料中。在该情况中，内切葡聚糖酶可与第一步骤中所用的内切葡聚糖酶相同或不同。

[0107] 通常第二糖化条件在温度和/或pH上与第一糖化条件不同，或通过添加或去除诸如金属、表面活性剂、催化剂、水和类似物的化合物而与第一糖化条件不同。例如，当第一糖化条件不适用于第二步骤中所用的纤维二糖水解酶和/或β-葡糖苷酶时，可在第一步骤之后(例如，在加入非内切葡聚糖酶纤维素酶之前或在加入非内切葡聚糖酶纤维素酶之时)对浆料(即，其中原料已在第一糖化条件下经受内切葡聚糖酶处理的浆料)进行改变。

[0108] 以下的实施例12示出了第一步骤和第二步骤可在不同温度下进行。在该实施例TM中，在75℃下进行第一(内切葡聚糖酶)步骤，并利用ACCELLERASE 1000(Danisco)在TM
50℃下进行第二(纤维素酶)步骤。ACCELLERASE 1000是含有外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶和β-葡糖苷酶活性的酶组合物，据生产商报道在70℃以上的温度时被灭活。在一些实施方案中，第一(内切葡聚糖酶)步骤在高于第二(纤维素酶)步骤的温度下进行。在一些实施方案中，维持第一(内切葡聚糖酶)糖化条件持续的时间短于维持第二(纤维素酶)糖化条件持续的时间。

[0109] 示例性的第二糖化条件是在40℃-80℃、pH 3-10下3小时到168小时。在特定的实施方案中，第二糖化条件维持3小时到24小时、72小时到168小时、或24小时到120小时。在特定的实施方案中，第二糖化条件包括25℃-80℃、40℃-75℃、40℃-70℃、或40℃-60℃范围中的温度。

[0110] 第一步骤和第二步骤可在同一反应器中进行。可选地，第一步骤可在第一反应器中进行，且第二步骤可在第二反应器中进行。利用该方法可将第一反应器中的内容物泵到第二反应器中，或可通过其它方法来转移。可选地，使用了连续处理方法，其中在流路的第一部分将EG添加到原料中，且在下游的、流路的第二部分将CBH/BGL蛋白添加到部分消化的纤维素底物中。应理解地是，以上文中所用的术语“反应器”并不意为特定的结构。已知大量反应器系统可用于，或适于本发明。参见，例如，Foody等人.，WO 2006/063467，在此通过引用并入。在一个实施方案中，预处理、第一糖化步骤、第二糖化步骤和发酵，每一个发生在不同的反应器中。

[0111] 在较不优选的实施方案中，将EG添加到第一步骤(例如，第一反应器)中，将CBH添加到第二步骤(例如，第二反应器)中，并将BGL添加到第三步骤(例如，第三反应器)中。

[0112] 本方法提供了比常规方法更高的原料到可溶性糖类(葡萄糖和纤维二糖)的转化。如实施例12中所示，当用内切葡聚糖酶(0.25％)在pH 5.0和75℃下维持预处理的甘TM蔗渣(200g/L)持续24小时，然后在pH 5.0和50℃下用ACCELLERAS 1000(1.75％)孵育TM
24小时，葡聚糖到可溶性糖类的％转化显著高于通过在50℃下用ACCELLERASE 1000(2％)孵育48小时所达到的％转化。这在实施例12的条件下是特别出乎意料的，因为通过质谱法所测定的，实验中所用的SavO内切葡聚糖酶的纤维素结合结构域在酶分泌之后与EG的催化结构域快速分裂。在一个实施方案中，根据本发明的方法产生的可溶性糖类的量高于在参考糖化工艺中产生的可溶性糖类的量，在所述参考糖化工艺中，在第一糖化条件下或可选地在第二糖化条件下用等量的内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和纤维二糖水解酶维持预处理的原料，持续时间与根据本方法的工艺在第一和第二糖化条件下相加的时间相等。

[0113] 本发明的糖化方法中使用的内切葡聚糖酶可以，例如，来自植物、细菌或真菌，和可以是天然存在的、重组产生的或天然存在的内切葡聚糖酶的重组变体。

[0114] 在一些实施方案中，内切葡聚糖酶来自真菌，比如丝状真菌。非意欲限制本发明地，示例性的内切葡聚糖酶包括表1中列出的那些、以及与所列的内切葡聚糖酶具有至少70％、至少80％、或至少90％序列同一性的酶活性变体。

[0115] 在一些实施方案中，内切葡聚糖酶来自细菌，比如链霉菌属物种，例如，产二素链霉菌(S.ambofaciens)、不产色链霉菌(S.achromogenes)、除虫链霉菌(S.avermitilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、金霉素链霉菌(S.aureofaciens)、金色链霉菌(S.aureus)、杀真菌素链霉菌(S.fungicidicus)、灰色链霉菌(S.griseus)、和浅青紫链霉菌。不意欲限制本发明地，示例性的内切葡聚糖酶包括表1中所列的那些，以及与所列的内切葡聚糖酶具有至少70％、至少80％、或至少90％序列同一性的酶活性变体。

[0116] 表1

[0117]

[0118] 在一些实施方案中，内切葡聚糖酶是天然存在的除虫链霉菌内切葡聚糖酶(“SavO”)或下文章节IV中描述的基因工程化的SavO变体，包括但不局限于，野生型SavO和表4A-C中列出的SavO变体。在一些实施方案中，内切葡聚糖酶是SavO的同源物且包括下文章节IV中所描述中的一个或多个置换。

[0119] 在一个实施方案中，内切葡聚糖酶包括具有如以下表4A-C所列出的SavO变体2、5、6或7的序列的催化结构域。

[0120] 在一些实施方案中，内切葡聚糖酶在高温(例如，高于50℃、有时高于60℃、有时高于65℃和有时高于70℃的温度)下是具有酶活性的，和在一些实施方案中，内切葡聚糖酶在高温下具有最佳活性。

[0121] 在一些实施方案中，EG缺失纤维素结合结构域(CBD)。例如，在一些实施方案中，内切葡聚糖酶的纤维素结合结构域在酶分泌之后与催化结构域分裂。可选地，可使用缺少CBD的基因工程化的内切葡聚糖酶。

[0122] IV.改良的内切葡聚糖酶

[0123] 在一方面，本发明提供了在增高的温度下表现出高酶活性的内切葡聚糖酶。本发明的内切葡聚糖酶来源于除虫链霉菌内切葡聚糖酶(SavO EG)(SEQ ID NO：3)或SavO EG的同源物，且包括相对于天然存在的序列(例如，天然的或野生型的SavO EG)的如下文所描述中的一个或多个置换。如上所述，内切葡聚糖酶和其它纤维素酶一般具有多结构域结构，该多结构域结构包括通过连接体肽连接的催化结构域(Cat)和纤维素结合结构域(CBD)。本发明人已发现包括催化结构域但不包括CBD的SavO EG的蛋白水解片段保持酶活性。因此，在一些实施方案中，本发明的内切葡聚糖酶包括催化结构域，该催化结构域来源于除虫链霉菌内切葡聚糖酶(SavO EG)的催化结构域(SEQ ID NO：1和2)或来源于结构上相关的内切葡聚糖酶的同源催化结构域。在不同的实施方案中，本发明的内切葡聚糖酶可包括(i)分离的EG催化结构域，任选地包括氨基末端和/或羧基末端的短间隔子；(ii)与天然CBD连接的EG催化结构域(例如，当使用SavO催化结构域时为SavO CBD；参见，例如，SEQ ID NO：3)；(iii)与非天然伴随EG催化结构域的异源性CBD连接的EG催化结构域(例如，与来自浅青紫链霉菌EG的CBD连接的EG催化结构域)。

[0124] 在一些实施方案中，内切葡聚糖酶包括与除虫链霉菌内切葡聚糖酶催化结构域(SEQ ID NO：1)具有至少70％序列同一性、有时至少75％、有时至少80％、有时至少85％、有时至少88％、有时至少90％、有时至少95％和有时至少98％序列同一性的催化结构域。在一些实施方案中，内切葡聚糖酶包括与除虫链霉菌内切葡聚糖酶(SavO EG)催化结构域(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)具有大于或等于88％序列同一性的催化结构域。在一些实施方案中，除特定的置换外，内切葡聚糖酶与除虫链霉菌内切葡聚糖酶催化结构域(SEQ ID NO：1)具有完全的序列同一性。

[0125] 如实施例中所描述的，大量的变体内切葡聚糖酶的分析已产生了与野生型SavO EG相比具有改良的特性的EG。这些改良的特性包括在有利于生物质底物的糖化的工艺条件下改良的酶性能。

[0126] 本发明的内切葡聚糖酶包括相对于天然存在的SavO EG序列或天然存在的SavO EG-同源物序列中的一个或多个置换。例如，本发明还包括如本文所公开的表4A-4C中所列的EG变体。

[0127] 在本发明的一些实施方案中，分离的变体EG多肽包括在SEQ ID NO：1中的以下位置中的一个或多个处的氨基酸置换或缺失：D1、S10、T12、Q14、G15、V18、A29、T33、D36、S37、I41、Q43、V48、T50、N51、A53、V60、N68、S74、A77、Q78、L79、S80、T81、V82、S83、Y91、S95、M98、A102、T110、R118、I121、V131、S136、A141、T142、Q147、S152、A165、S167、S171、Q182、V184、S185、G187、L188、Q190、N191、W193、V198、P204、Q206、N207、T219和/或T222，其中SEQ ID NO：1具有以下的氨基酸序列：

[0128] DTSICEPFGSTTIQGRYVVQNNRWGTSEAQCITATDSGFRITQADGSVPTNGAPKSYPSVYNGCHYTNCSPGTSLPAQLSTVSSAPTSISYSYVSNAMYDAAYDIWLDPTPRTDGVNRTEIMVWFNKVGSVQPVGSQVGTATVAGRQWQVWSGNNGSNDVLSFVAPSAITSWSFDVMDFVRQAVSRGLAQNSWYLTSVQAGFEPWQNGAGLAVTSFSSTVNT(SEQ ID NO：1)。

[0129] 在一些实施方案中，具有一个或多个置换的变体EG包括与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少88％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体EG多肽将与SEQ ID NO：1具有至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性。

[0130] 在一些实施方案中，分离的变体EG在与SEQ ID NO：1中的以下残基中的一个或多个对应的位置处包括置换：D1(E/G/V)、S10(F/H/L/T/W/Y)、T12(I/V)、Q14(E/K/L/P)、G15N、A29(H/K/L/P/R/T)、T33(A/E/H/I/L/Q/R/V)、D36Y、S37E、I41V、Q43(E/K/L/M/R/V)、V48K、T50(L/P)、N51(H/K/S)、A53(G/P)、V60I、N68(H/I/K/L/V)、S74(A/E/H/K/L/N/P/Q/R/T/V)、A77V、Q78K、L79I、S80K、T81(K/N/Q/R/S)、V82I、S83(E/I/R/V)、Y91(C/F)、S95(D/H/K/N/T)、M98(I/K/Q/T/V)、A102S、T110(E/K)、R118(K/Q)、I121L、V131(E/I/M)、S136(D/E/H/K/R/T/V)、A141(D/S/T)、T142(C/F/H/M/N/S/V/W)、Q147(R/S)、S152(I/L/M/V)、A165S、S167(D/I)、S171T、Q182(I/V)、V184F、S185(D/E/G/H/I/K/L/N/Q/R/T/V/Y)、G187E、L188F、Q190(D/H)、N191(P/Q/Y)、V198I、P204L、Q206(E/R/S/V)、N207(D/G)、T219(A/C/D/E/Q)和/或T222K。

[0131] 在一些实施方案中，变体EG与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比将包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个已被置换的氨基酸残基。

[0132] 在一些实施方案中，本发明的变体EG与SEQ ID NO：1相比将至少在位置S10、A29、A53、S74或N191中包括置换。在一些实施方案中，变体将包括这些位置中的2个的置换，这些位置中的3个的置换，这些位置中的4个的置换和有时这些位置中的全部5个的置换。在一些实施方案中，本发明的变体EG与SEQ ID NO：1相比将包括S10(F/H/L/T/W/Y)、A29(H/K/L/P/R/T)、A53(G/P)、S74(A/E/H/K/L/N/P/Q/R/T/V)和/或N191(P/Q/Y)处的置换。在一些实施方案中，本发明的变体EG与SEQ ID NO：1相比除在位置S10、A29、A53、S74和/或N191中的任何一个处具有置换之外，将进一步在选自T12、Q43、V48、N68、Q78、L79、T81、V82、M98、S152、S185和Q206中的一个或多个的位置处包括置换。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：1相比置换将选自T12(V/I)、Q43(R)、V48(K)、N68(I)、Q78(K)、L79(I)、T81(K/I)、V82(I)、M98(V)、S152(M)、S185(Q/V)和Q206(E)。

[0133] 在一些实施方案中，变体EG将包括与SEQ ID NO：6具有至少95％序列同一性的序列，其中SEQ ID NO：6具有如下的氨基酸序列：

[0134] DTSICEPFGSTTIQGRYVVQNNRWGTSEPQCITATDSGFRITQADGSVPTNGPPKSYPSVYNGCHYTNCSPGTPLPAQLSTVSSAPTSISYSYVSNAMYDAAYDIWLDPTPRTDGVNRTEIMVWFNKVGSVQPVGSQVGTATVAGRQWQVWSGNNGSNDVLSFVAPSAITSWSFDVMDFVRQAVSRGLAQPSWYLTSVQAGFEPWQNGAGLAVTSFSSTVNT(SEQ ID NO：6)。

[0135] 在一些实施方案中，变体EG将包括SEQ ID NO：6，和在其它实施方案中变体EG将在与SEQ ID NO：6中的位置S10、T12、Q43、V48、N68、Q78、L79、T81、V82、M98V、S152和/或S185对应的位置处包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个另外的置换。在一些实施方案中，置换将对应于SEQ ID NO：6中的S10(F/H/L/T/W/Y)、T12(I/V)、Q43(E/K/L/M/R/V)、V48K、N68(H/I/K/L/V)、Q78K、L79I、T81(K/N/Q/R/S)、V82I、M98(I/K/Q/T/V)、S152(I/L/M/V)和/或S185(D/E/G/H/I/K/L/N/Q/R/T/V/Y)。

[0136] 在一些实施方案中，本发明的变体EG将包括与SEQ ID NO：7的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％和至少99％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，本发明的变体EG是包括SEQ ID NO：7的EG，其中SEQ ID NO：7具有以下的氨基酸序列：

[0137] DTSICEPFGWTTIQGRYVVQNNRWGTSEPQCITATDSGFRITRADGSVPTNGPPKSYPSVYNGCHYTNCSPGTPLPAQLSTISSAPTSISYSYVSNAVYDAAYDIWLDPTPRTDGVNRTEIMVWFNKVGSVQPVGSQVGTATVAGRQWQVWSGNNGSNDVLSFVAPSAITSWSFDVMDFVRQAVSRGLAQPSWYLTSVQAGFEPWQNGAGLAVTSFSSTVNT(SEQ ID NO：7)

[0138] 在一些实施方案中，变体EG包括与SEQ ID NO：7相比具有选自位置T12、V48、N68、Q78、L79、T81、S152、S185和/或Q206的至少一个置换的氨基酸序列。在一些实施方案中，与SEQ ID NO：7相比，置换将选自T12(V/I)、Q43(R/E/K/L/M/V)、V48(K)、N68(H/I/K/L/V)、Q78(K)、L79(I)、T81(K/N/Q/R/S)、S152(I/L/M/V)、S185(D/E/G/H/I/K/L/N/Q/R/T/V/Y)和/或Q206(E/R/S/V)。在一些实施方案中，本发明的变体EG将与SEQ ID NO：7具有至少95％序列同一性。

[0139] 在一些实施方案中，本发明的变体EG是包括SEQ ID NO：8的EG，其中SEQ ID NO：8具有以下的氨基酸序列：

[0140] DTSICEPFGWTVIQGRYVVQNNRWGTSEPQCITATDSGFRITRADGSKPTNGPPKSYPSVYNGCHYTICSPGTPLPAQISKISSAPTSISYSYVSNAVYDAAYDIWLDPTPRTDGVNRTEIMVWFNKVGSVQPVGSQVGTATVAGRQWQVWMGNNGSNDVLSFVAPSAITSWSFDVMDFVRQAVQRGLAQPSWYLTSVQAGFEPWENGAGLAVTSFSSTVNT(SEQ ID NO：8)

[0141] 在一些实施方案中，变体EG将包括SEQ ID NO：8，和在其它实施方案中，变体EG将包括SEQ ID NO：8中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个另外的置换或缺失。

[0142] 本发明还考虑了可在与除虫链霉菌EG的被置换的位置对应的位置处将置换导入到其它细菌和真菌物种的内切葡聚糖酶中，以产生具有相似所需要性质的变体。

[0143] 例如，许多细菌(包括但不局限于链霉菌属、小单胞菌属(Micromonospora)、束丝放线菌属(Actinosynnema)、盐水孢菌属(Salinispora)、分枝杆菌属(Mycobacterium)物种)表达包括催化结构域的内切葡聚糖酶，该催化结构域与除虫链霉菌EG催化结构域具有显著的序列同一性。本发明考虑了这些细菌EG的EG变体，其中在与本文所公开的除虫链霉菌位置和置换对应的残基处作出置换。具有显著序列同一性的细菌EG的例子包括，例如：斯维链霉菌(Streptomyces sviceus)ATCC29083(登录号ZP_05016224.1)；疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei)87.22(登录号YP_003494465.1)；加纳链霉菌(Streptomyces ghanaensis)ATCC 14672(登录号ZP_04683886.1)；娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)(登录号CAA52139.1)；灰黄链霉菌(Streptomyces griseoflavus)Tu4000(登录号ZP_05536909.1)；蚀木链霉菌(Streptomyces xylophagus)(登录号ACN56471.1)；绿孢链霉菌(Streptomyces viridosporus)(登录号AAD25090.1)；疮痂病链霉菌87.22(登录号YP_003486364.1)；天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)(登录号
NP_625477.1)；黄灰链霉菌ATCC 33331(登录号ZP_05801764.1)；浅青紫链霉菌TK24(登录号ZP_06532489.1)；郝氏链霉菌(Streptomyces halstedii)(登录号AAC45429.1)；
产二素链霉菌ATCC 23877(登录号CAJ90159.1)；链霉菌Streptomyces sp.11AG8(登录号AAF91283.1)；桔橙小单孢菌(Micromonospora aurantiaca)ATCC 27029(登录号ZP_06215034.1)；堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)ATCC 12478(登录号ZP_04750212.1)；小单胞菌Micromonospora sp.ATCC 39149(登录号ZP_04607827.1)；
链霉菌Streptomyces sp.SPB78(登录号 ZP_05488520.1)；链霉菌 Streptomyces sp.SPB74(登录号ZP_04994021.1)；热带盐水孢菌(Salinispora tropica)CNB-440(登录号YP_001161230.1)；奇迹束丝放线菌(Actinosynnema mirum)DSM 43827(登录号YP_003101698.1)；栖沙盐水孢菌CNS-205(登录号YP_001539639.1)；堪萨斯分枝杆菌ATCC 12478(登录号ZP_04747778.1)。

[0144] 序列同一性的测定通过序列对比算法来测定。当使用序列对比算法时，将检验序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标和序列算法程序参数。然后序列对比算法基于程序参数计算检验序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

[0145] 用来测定变体内切葡聚糖酶是否与SEQ ID NO：1具有催化结构域序列同一性的算法是BLAST算法，其在Altschul等人.，1990，J.Mol.Biol.215：403-410中被描述。用于执行BLAST分析的软件是通过美国国立生物技术信息中心(网址为ncbi.nlm.nih.gov/)公开可得的。该算法包括首先通过鉴别查询序列中长度W的短字来鉴别高分序列对(HSP)，所述短字与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足一些正值阀值得分T。T称为邻近字得分阀值(Altschul等人，同上)。这些起始邻近字匹配作为启动搜索的种子以寻找含有它们的更长HSP。然后，将字匹配沿着每个序列的两个方向延伸，只要累积比对得分可以被增加。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配残基对的奖励得分；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，得分矩阵用于计算累积得分。当以下情况时，每个方向中的字匹配的延伸被终止：累积比对得分从其最大达到值下降了量X；由于累积一个或多个负得分残基比对，累积得分达到0或以下；或到达任一序列末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的敏感度和速度。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)3、期望值(E)10和BLOSUM62得分矩阵作为默认值(参见Henikoff和Henikoff，1989，Proc Natl Acad Sci USA 89：10915)。

[0146] 表2提供了SavO和5个同源EG的催化结构域的比对。使用来自Invitrogen的AlignX(VectorNTI的部分)进行了多序列比对。其基于ClustalW算法。

[0147]

[0148]

[0149] 当将来自除虫链霉菌EG的野生型催化结构域(SEQ ID NO：1)与来自浅青紫链霉菌的EG进行比对时，如由本文所描述的参数所定义的，它们共有87％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明的改良的内切葡聚糖酶变体具有与除虫链霉菌内切葡聚糖酶的野生型催化结构域(SEQ ID NO：1)具有至少88％同一性的催化结构域。

[0150] 纤维素结合结构域

[0151] 虽然本发明的变体EG由催化结构域所限定，许多纤维素酶包括纤维素结合结构域和连接体肽(参见，例如，野生型或天然的全长SavO EG(SEQ ID NO：3))。可预料地，在一些实施方案中，具有内切葡聚糖酶活性的、包括本发明的变体EG的纤维素酶也将包括连接体和纤维素酶结合结构域。在一些实施方案中，连接体和纤维素结合结构域(总称为“CDB”)将是具有如图1C中所描绘的多肽序列的CBD。在一些实施方案中，CBD将与图1C中所描绘的CBD具有至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性。在一些实施方案中，变体EG将在CBD中包括一个或多个置换，比如如图1C中所描绘的CBD中的1个、2个、3个、4个、5个或6个置换。

[0152] CBD可以与催化结构域同源或异源。在野生型EG中，同源CBD与母体催化结构域相结合。例如，除虫链霉菌EG CDB(参见图1C)与除虫链霉菌EG催化结构域同源。

[0153] 改良的变体内切葡聚糖酶的评价和其性质

[0154] 利用重组方法或合成方法可从参考内切葡聚糖酶序列中生成变体内切葡聚糖酶。可将本发明的变体内切葡聚糖酶的性质(例如，催化活性、pH和温度耐受性和最适宜条件，等等)与参考内切葡聚糖酶(其可以是野生型或其它的变体)相比较。比较可以是定量的或定性的。例如，从宿主细胞中表达后的变体内切葡聚糖酶可与野生型SavO EG催化结构域(SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)的序列对于改良的性质进行比较。例如，可将从宿主细胞中表达的变体内切葡聚糖酶(例如，具有与SEQ ID NO：1具有至少88％序列同一性的催化结构域的SavO EG变体)的性质与包括SEQ ID NO：1(野生型SavO EG的催化结构域)或SEQ ID NO：2(其含有野生型SavO EG催化结构域和4个N-末端氨基酸)的参考内切葡聚糖酶相比较。

[0155] 可对本发明的变体内切葡聚糖酶，诸如表4A-C中存在的那些，进行筛查以测定改良的性质，比如在预期条件下的最佳活性。多种筛查检验可被本领域中的技术人员使用。在一个实施方案中，变体内切葡聚糖酶候选物可通过基于pNPC(对硝基苯基-β-D-纤维二糖糖苷)的1级比色HTP测定(底物：pNPC；pH：4.0；温度：70℃；时间：24小时)来筛查。在405nm处测量对硝基苯酚的释放以计算内切葡聚糖酶变体的活性。从1级测定鉴定的活性变体可随后经受2级HPLC测定(底物：Avicel(结晶纤维素)pH：4.0-5.0；温度：60-70℃；
时间：24小时)以鉴定改良的变体内切葡聚糖酶。从含纤维素底物产生纤维二糖可通过HPLC来测量。在糖化工艺条件下可进一步证实和验证改良的内切葡聚糖酶变体。糖化工艺条件下的纤维二糖和葡萄糖产生可通过HPLC来测量。

[0156] 本发明的一些变体EG与参考序列相比将具有改良的活性。例如在3.0到7.5的pH范围中、还在3.5到6.5的pH范围中、还在3.5到6.0的pH范围中、还在3.5到5.5的pH范围中、还在4.0到6.0的pH范围中、还在4.0到5.5的pH范围中、还在4.0到5.0的pH范围中改良的酶活性。一些EG变体将在约55到85℃的温度下、还在60到80℃的温度下、还在约60到75℃的温度下、还在约60到70℃的温度下具有改良的热稳定性或改良的热活性。在一些实施方案中，变体EG将在4.0到5.0的pH和60-70℃的温度下具有改良的酶活性，且具有与除虫链霉菌内切葡聚糖酶的催化结构域(SEQ ID NO：1)具有至少88％序列同一性的催化结构域。

[0157] 在一些实施方案中，当在同样的条件下检验时，本发明的变体EG将表现出比SEQ ID NO：2的EG的内切葡聚糖酶活性高至少1.5倍、至少约2.0倍、至少约3.0倍、至少约4.0倍、至少约5.0倍、至少约6.0倍、至少约7.0倍、至少约8.0倍和至少10倍的内切葡聚糖酶活性。在其它实施方案中，在pH 5.0和65℃下变体EG的稳定性(半衰期)将比在同样条件下的参考EG序列(比如但不限于SEQ ID NO：2)的稳定性高至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍和甚至1000倍。

[0158] 本发明的变体内切葡聚糖酶可通过如上所述使参考内切葡聚糖酶突变、基因工程合成编码变体内切葡聚糖酶的基因、或通过合成产生具有如本文所描述的氨基酸残基置换的多肽。

[0159] 修饰的变体

[0160] 本发明包括本文所描述的(例如，表4A-C)、SavO EG多肽的保守性修饰的变体。在一些实施方案中，这些变体在其氨基酸序列中作出了保守性置换。保守性置换的例子在以下的组之中：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)。一般不改变比活的氨基酸置换是本领域中已知的，并诸如由H.Neurath和R.L.Hill，1979，″The Proteins，″Academic Press，New York描述。最常发生的互换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly以及它们的反向互换。

[0161] 本发明的SavO EG多肽的保守性置换的变异包括相对于本文所列的变体用同一保守性置换组的保守性选择的氨基酸置换多肽序列的小百分比的氨基酸，所述小百分比通常小于5％、更通常小于2％和经常小于1％。不改变SavO EG多核苷酸的编码活性的序列的添加，比如非功能或非编码序列的添加，被认为是SavO EG多核苷酸的保守性变异。

[0162] 如上所述被克隆入载体的编码天然存在的除虫链霉菌催化结构域的参考内切葡聚糖酶多核苷酸序列可经受基因定点诱变过程以生成本发明的变体内切葡聚糖酶。基因定点诱变技术在以下中被描述：Ling等人.，Anal Biochem.，254(2)：157-178(1997)；Dale等人 .，Ann.Rev.Genet.，19：423-462(1996)；Botstein & Shortle，Science，229：
1193-1201(1985)；Carter，Biochem.J.，237：1-7(1986) 和 Kunkel，“The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis(寡核苷酸定向诱变的效率)”Nucleic Acids & Molecular Biology(Eckstein、F. 和 Lilley，D.M.J. 编，Springer Verlag，Berlin(1987))；Kunkel、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82：488-492(1985)；Kunkel 等人 .，Methods in Enzymol.，154：367-382(1987)；Zoller & Smith，Nucleic Acids Res.，10：
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13：8765-8787(1985)；Nakamaye & Eckstein，Nucl.Acids Res.，14：9679-9698(1986)；
Sayers 等人 .，Nucl.Acids Res.，16：791-802(1988)；Kramer & Fritz，Methods in Enzymol.，154：350-367(1987)；Kramer等人.，Nucl.Acids Res.，16：7207(1988)和Fritz等人.，1988，Nucl.Acids Res.，16：6987-99。

[0163] 本发明的变体EG多肽可经受进一步的修饰以生成保留表征变体的特异性置换且可具有所需要的性质的新型多肽。例如，具有改良的性质的编码变体内切葡聚糖酶的多核苷酸可经受另外轮次的诱变处理以生成在所需的酶性质方面具有进一步地改良的多肽。

[0164] 对诸如SEQ ID NO：1的参考多肽产生改良的内切葡聚糖酶性质的修饰的数目可包括一个或多个氨基酸。组合突变的蛋白质进化可通过本领域中已知的任何方法来实现，包括但不局限于，经典的和/或合成的DNA改组技术。

[0165] 经典的DNA改组通过从母体DNA随机断裂进行体外同源重组，随后利用连接和/或PCR进行重新组装(其导致随机引入的点突变)来产生变体DNA分子。其由三个步骤的过程组成，以基因的酶消化起始，产生DNA的较小片段。然后使小片段随机杂交并将其插入以构建较长片段。最终，通过PCR进行扩增来重新构建任意全长的、重组的基因。如果将一系列等位基因或突变的基因用作DNA改组的起始点，结果是可被翻译为新蛋白的重组基因的文库。随后可在如上所述的所需条件下根据提高的活性对文库进行筛选。如本文所述通过随机诱变或基因定点诱变生成的具有单个氨基酸突变的内切葡聚糖酶提供了母体或参考核苷酸序列。可将具有有利突变的基因进行进一步改组以在单个核苷酸序列中将这些独立的、有利的突变汇集在单个核苷酸序列中并消除将阻止所需的内切葡聚糖酶表现出用于本发明的pH和温度所需的活性的任何突变。

[0166] 合成的DNA改组也可用来提高内切葡聚糖酶活性。在合成的重组方法中，合成了多个寡核苷酸，其共同编码待重组的多个突变。基于如上所述的有利氨基酸置换的测定设计寡核苷酸。生产寡核苷酸之后，如上所述的改组的方法可用来构建变体内切葡聚糖酶的文库。

[0167] 基于重组的定向进化可进一步通过蛋白序列活性关系(ProSAR)来补充，其将统计学分析整合到靶向氨基酸残基中以用于突变分析。参见，例如，Fox等人.，Nature Biotechnology 25：338-344(2007)。利用与统计学分析组合的定向进化，通过在甚至具有降低的功能的内切葡聚糖酶变体中鉴定有利的突变，促进了定向突变的酶优化。利用该方法，可基于浅青紫链霉菌CelB2内切葡聚糖酶的催化结构域的三维结构来预测除虫链霉菌内切葡聚糖酶的催化结构域中的可能有利的残基。(Sulzenbacher等人.，1999，Biochemistry 38：4826-33)。

[0168] 蛋白质进化的方法是本领域中熟知的。参见，例如，Wells等人.，Gene 34：315-323(1985)；Minshull等人.，Curr Opin Chem Biol 3：284-290(1999)；Christians等人，Nature Biotech 17：259-264(1999)；Crameri等人.，Nature 391：288-291(1998)；
Crameri等人.，Nature Biotech 15：436-438(1997)；Zhang等人.，Proc Natl Acad Sci USA 94：45-4-4509(1997)；Crameri等人.，Nature Biotech 14：315-319(1996)；Stemmer，Nature 370：389-391(1994)；Stemmer、Proc Natl Acad Sci USA 91：10747-10751(1994)；
WO 95/22625；WO 97/0078；WO 97/35966；WO 98/27230；WO 00/42651；WO 01/75767和美国专利第5,605,793号、第5,811,238号、第5,830,721号、第5,834,252号、第5,837,458号和第6,537,746号。

[0169] 还可用合成方法生成具有本文所描述的氨基酸置换的变体内切葡聚糖酶。化学合成的多肽可利用固相、液相或肽缩合技术的熟知的技术来生成，并可包括产生本文所描述的变体所需的氨基酸的任何组合。合成的氨基酸可获自Sigma、Cambridge Research Biochemical或本领域技术人员熟悉的任何其它化学公司。

[0170] 信号肽

[0171] 本发明的内切葡聚糖酶通常作为分泌蛋白来表达。因此，在一些实施方案中，内切葡聚糖酶多肽将作为在氨基末端包括信号肽的前蛋白来表达。一般，在信号肽中存在三个不同的物化区域：带正电的N-末端、中央疏水区和信号裂解位点末端的更具极性的柔性C-末端。

[0172] 信号肽序列对于分泌多肽可以是异源的(外源的)，或可以是天然伴随分泌多肽或天然伴随母体多肽序列(分泌多肽是它的变体)的。在一些情况中，将信号肽与编码天然存在的多肽的多肽序列相连接，该天然存在的多肽是正常不分泌的或天然地不含信号肽编码区。在一些情况中，外源信号肽可替换天然信号肽编码区以增强多肽的分泌。在一些情况中将信号肽与编码天然多肽的多肽序列相连接，该天然多肽是自然界中不存在的，比如天然存在的蛋白的截短形式。本发明可使用将被表达的多肽导向到所选择的宿主细胞的分泌通路中的任何信号肽编码区。一般将选择用于在特定宿主中进行最佳表达和分泌的信号肽。示例性的信号肽包括细菌信号肽序列、真菌信号肽序列、人工信号肽序列和来自植物和动物的信号肽序列。

[0173] 用于将编码所需信号肽的核酸区段与编码多肽的核酸序列相融合的方法是熟知的。商业上的表达载体是可获得的，其中编码多肽的核酸序列可与编码信号肽的核酸序列框内插入，并含有被编码的融合蛋白的最佳表达所需的调控元件。

[0174] 细菌信号肽

[0175] 在一个实施方案中，本发明的EG多肽将与来源于细菌物种的信号肽序列可操作地连接，该信号肽序列比如来源于芽孢杆菌(例如，嗜热脂肪芽孢杆
菌(B.stearothermophilus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或巨大芽孢杆菌(B.megaterium))的信号序列。用于细菌宿主细胞的另外有效的信号肽编码区是获自以下的信号肽编码区：芽孢杆菌NClB 11837生麦芽糖淀粉酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶基因、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶基因、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶基因(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌基因prsA。Simonen和Palva，1993，Microbiol Rev.57：109-37描述了另外的信号肽。

[0176] 在一个实施方案中，将巨大芽孢杆菌信号肽与异源蛋白可操作地连接以用于在细菌宿主中有效产生和分泌异源蛋白。在一个实施方案中信号肽包括MKRIVMVGFILLFPLNMLAGPISSIAEAQ(SEQ ID NO：9)或与SEQ ID NO：9(在不同的实施方案中)在1个、2个或3个位置(例如，SEQ ID NO：9的残基2-25中的1个、2个或3个位置)处不同的序列。部分地基于巨大芽孢杆菌基因组的分析，制备了来自巨大芽孢杆菌的编码一组约200个推测的信号肽的核酸的文库，并利用与Brockmeier等人.，2006，J Mol Bio 362：393-402相似的方法对该文库进行筛选。将这些推定的信号肽的编码区克隆到编码SavO变体5(SEQ ID NO：8)、细菌β-葡糖苷酶(CelA)和细菌外切葡聚糖酶(CBH2)基因的开放阅读框的上游。在巨大芽孢杆菌中异源表达构建体，并从细胞培养基和细胞裂解物中测量纤维素酶活性以测定蛋白分泌的效率。

[0177] 当利用信号肽序列SEQ ID NO：9表达SavO内切葡聚糖酶时，分泌了显著高比例(～97％)的所产生的EG蛋白。SEQ ID NO：9在巨大芽孢杆菌中驱动其它异源蛋白的分泌也是有效的(参见表3)，这表明其对于细菌中，尤其是芽孢杆菌属物种(例如但不限于巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌)中的多种蛋白的分泌是有用的。

[0178] 表3

[0179]蛋白％被分泌
SavO变体5 97
β-葡糖苷酶(来自纤维素细菌) 80
外切葡聚糖酶(来自纤维素细菌) 91

[0180] 因此，在一方面本发明提供了融合蛋白，该融合蛋白包括编码信号肽的第一氨基酸序列和编码异源多肽的第二氨基酸序列，其中所述第一序列在融合蛋白的氨基末端且与MKRIVMVGFILLFPLNMLAGPISSIAEAQ(SEQ ID NO：9)相同或基本上相同，且所述第二序列不编码巨大芽孢杆菌多肽。如以下实施例12中所示出的，有时方便地在信号肽和异源蛋白之间导入另外的多肽序列。通常另外的序列是短的(有时少于20个氨基酸，通常少于5个氨基酸)，且可被称作“间隔肽”。然而，较长的序列也在考虑中。

[0181] 在一些实施方案中，异源多肽是纤维素蛋白(即，内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或β-葡糖苷酶)。示例性的纤维素酶包括，但不限于，真菌纤维素酶和其变体，和细菌(例如，链霉菌)纤维素酶及其变体。在某些实施方案中，纤维素酶是内切葡聚糖酶，比如除虫链霉菌内切葡聚糖酶或其变体。示例性的异源多肽包括具有诸如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的序列的改良的内切葡聚糖酶。异源内切葡聚糖酶多肽可以包括或不包括纤维素结合结构域。

[0182] 在一些实施方案中，异源多肽不是纤维素酶蛋白。适宜的多肽包括需要分泌的任何非巨大芽孢杆菌的多肽，比如真菌蛋白、细菌蛋白、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、角质酶、木聚糖酶、肌醇六磷酸酶、氧化还原酶、酯酶、漆酶、异构酶、转移酶、转氨酶、酮还原酶、葡萄糖氧化酶、脱氢酶、人工序列、动物或植物蛋白，和其变体。

[0183] 在一个相关的方面，本发明提供了编码本发明的融合蛋白的重组的核酸。在一些实施方案中，重组的核酸在诸如含有该核酸且能够在适宜的宿主细胞中表达该融合蛋白的重组表达载体中包括与蛋白编码序列可操作地连接的启动子。

[0184] 还提供了含有核酸的宿主细胞。通常该宿主是细菌，例如芽孢杆菌属物种。在一些重要的实施方案中，宿主是巨大芽孢杆菌。

[0185] 应理解地是，宿主细胞可用来产生异源多肽。例如，本发明提供了在巨大芽孢杆菌宿主细胞中产生异源多肽的方法。有利地，在巨大芽孢杆菌中(例如)，信号肽与其它信号肽相比可使分泌的蛋白的产量提高50％。

[0186] 还应理解地是，融合蛋白和分泌纤维素酶的宿主细胞在来自纤维素原料的可溶性糖类的产生中是有用的。例如，可在一定条件下维持表达纤维素酶(例如，本文所描述的SavO内切葡聚糖酶)的细胞，在所述条件中纤维素酶多肽被分泌到培养基中，并可将预处理的纤维素原料与培养基(含有细胞或基本上不含细胞的肉汤)或获自培养基的分泌的纤维素酶相组合。在一些实施方案中，以这种方式应用表达除虫链霉菌内切葡聚糖酶的巨大芽孢杆菌宿主细胞或其变体以用于纤维素材料的转化。

[0187] 真菌信号肽

[0188] 用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码区可以是获自米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、黑霉(Aspergillus niger)中性淀粉酶、黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶和柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶的基因的信号肽编码区。

[0189] 用于酵母宿主细胞的有用的信号肽可来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)α-因子和酿酒酵母转化酶的基因。Romanos等人.，1992，Yeast 8：423-88描述了其它有用的信号肽编码区。

[0190] 前肽

[0191] 在一些实施方案中，克隆的内切葡聚糖酶序列可具有编码位于多肽的氨基末端的氨基酸序列的前肽编码区。所得的多肽被称为酶原或多肽原(或某些情况为酶原(zymogen))。多肽原一般是无活性的并可通过前肽的催化裂解或自动催化裂解从多肽原转化成成熟的活性多肽。前肽编码区可获自巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、酿酒酵母α-因子、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝酶乳糖酶的基因(WO 95/33836)。

[0192] 编码变体内切葡聚糖酶的多核苷酸

[0193] 在另一方面，本公开内容提供了编码本发明包含的变体内切葡聚糖酶的多核苷酸。多核苷酸可与控制基因表达的一个或多个异源调控或控制序列可操作地连接以构建能够表达多肽的重组的多核苷酸。可将含有编码基因工程化的内切葡聚糖酶的异源多核苷酸的表达构建体导入到适当的宿主细胞中以表达相应的内切葡聚糖酶。

[0194] 参考、前体和母体内切葡聚糖酶

[0195] 参考内切葡聚糖酶或变体内切葡聚糖酶可通过将编码内切葡聚糖酶的cDNA、基因组DNA、合成的DNA或RNA的任何核酸分子克隆到构建体中而生成。载体的选择取决于被选择用于表达内切葡聚糖酶的宿主细胞。

[0196] 参考内切葡聚糖酶核酸可通过扩增任何公开可得的除虫链霉菌模板来获得，并可通过本领域中的技术人员已知的包括PCR的多种方法来生成。然而本发明意在包括任何适宜的DNA扩增方法。多种DNA扩增技术适用于本发明。该扩增技术包括方法，比如聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增、T7聚合酶介导的扩增、T3聚合酶介导的扩增和SP6聚合酶介导的扩增。DNA扩增的精确方法并非限制性的，并且此处未列出的其它方法对于本领域中的技术人员将是明显的，且其用途在本发明的范围之中。示例性参考文献包括手册，比如PCR Technology：Principles and Applications for DNA Ampliﬁcation(PCR技术：DNA扩增的原理和应用)(编辑H.A.Erlich，Freeman Press，NY，N.Y.，1992)；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(PCR方案：方法和应用指南)(编辑Innis，等人.，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)；Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验方法汇编)，Ausubel、1990-2008，包括补充更新；美国专利第4,683,202号。

[0197] 由于对与多种氨基酸相应的密码子的了解，多肽序列的可获得性提供了能够编码主题多肽的所有多核苷酸的描述。其中同样的氨基酸由可替代的或同义的密码子编码的遗传密码的简并性允许作出大量的核酸，所有的核酸编码本文所公开的改良的内切葡聚糖酶。因此，鉴定了特定的氨基酸序列后，本领域中的技术人员能够以不改变蛋白的氨基酸序列的方式简单地修饰序列的一个或多个密码子而生成任何数目的不同的核酸。在这方面，本公开内容具体考虑了可通过筛选基于可能的密码子的选择的组合而生成的多核苷酸的每一个可能的变异，且认为所有这些变异是为本文所公开的任何多肽特别公开的。

[0198] 可以多种方式对编码改良的内切葡聚糖酶的分离的多核苷酸进行操作以提供多肽的表达。根据表达载体，分离的多核苷酸在其插入到载体(比如表达载体)中之前的操作可能是需要的或必需的。编码变体内切葡聚糖酶的多核苷酸可包含如下所描述的启动子、信号序列、终止子等等。重组DNA技术、载体、启动子、终止子及其类似物是本领域中熟知的，并在以下描述。

[0199] 载体

[0200] 将编码内切葡聚糖酶的核酸克隆到载体中，根据待导入的宿主类型的不同，该载体具有一个或多个表达调控区域，比如启动子和终止子、复制起点等等。包括内切葡聚糖酶序列的重组载体可以是可方便地经受重组DNA操作的任何载体，且载体的选择通常将取决于待导入的宿主细胞。载体优选地为表达载体，其中编码本发明的酶的DNA序列与DNA转录所需的另外的区段可操作地连接。一般，表达载体来源于质粒或病毒DNA，或可包含该两种元件。“可操作地连接”指将区段进行排列以使其为其预期目的共同行使作用，例如，与基因序列可操作地连接的启动子调控或增强编码蛋白的DNA序列的转录。本发明的表达载体可包含使载体整合到宿主细胞的基因组中或使细胞中的载体独立于基因组而自主复制的元件。

[0201] 表达载体可以是自主复制的载体，即，作为染色体外实体而存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于确保自我复制的任何元件(means)。载体可以是线性的或闭合环状的质粒。细菌复制起点的例子为P15A ori或允许在大肠杆菌(E.coli)中进行复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177或pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌中进行复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060或pAM.β.1的复制起点。用于酵母宿主细胞的复制起点为2μm复制起点，ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、ARS4和CEN6的组合。复制起点可以具有突变，该突变使其在宿主细胞中温度敏感性运作。参见，例如，Ehrlich，1978，Proc Natl Acad Sci.USA 75：1433。

[0202] 对于整合到宿主细胞基因组中，载体可依靠编码多肽的核酸序列或用于通过同源或非同源重组将载体整合入基因组的载体的任何其它元件。包含内切葡聚糖酶序列的表达载体可包含用于指导通过同源重组整合到宿主细胞的基因组的另外的核酸序列。所述另外的核酸序列使载体能够在染色体中的精确位置处整合到宿主细胞基因组中。为提高在精确位置整合的可能性，整合元件应优选地包含足够数目的核酸，比如100至10,000碱基对，优选地为400至10,000碱基对，且最优选地为800至10,000碱基对，该核酸与相应的靶序列高度同源，以增加同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。并且，整合元件可以是非编码核苷酸序列或编码核苷酸序列。另一方面，载体可通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

[0203] 可将本发明的核酸序列的一个以上的拷贝插入到宿主细胞中以提高基因产物的产量。核酸序列的拷贝数的增加可通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中来实现，或通过核酸序列包括可扩增的选择标记基因，其中细胞包含选择标记基因的扩增的拷贝，且因此可在适当的选择性试剂存在下通过培养细胞而筛选核酸序列的另外的拷贝。

[0204] 启动子

[0205] 可提供调控序列，其允许与宿主细胞的生长有关的多肽的表达的调控。调控系统的例子是响应于化学或物理刺激(包括调控化合物的存在)时导致基因的表达的开启或关闭的那些。在原核宿主细胞中，适宜的调控序列包括lac、tac和trp操纵基因系统。在酵母宿主细胞中，适宜的调控系统包括，举例而言，ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，适宜的调控序列包括TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。

[0206] 启动子序列是由用于多核苷酸的表达的宿主细胞所识别的核酸序列，比如包含编码区的多核苷酸。一般，启动子序列包含转录控制序列，其介导多核苷酸的表达。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示出转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂交的启动子，且可从编码与宿主细胞同源的或异源的胞外或胞内多肽的基因来获得。

[0207] 适当的启动子序列，其可获自编码与宿主细胞同源的或异源的胞外或胞内多肽的基因，可包括克隆的载体。对于细菌宿主细胞，用于指导本公开内容的核酸构建体的转录的适宜的启动子包括获自以下的启动子：大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、巨大芽孢杆菌启动子和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人.，Proc.Natl Acad.Sci.USA 75：3727-3731(1978))，以及tac启动子(DeBoer等人.，Proc.Natl Acad.Sci.USA 80：21-25(1993))。另外的启动子包括trp启动子、噬菌体λPL、T7启动子及其类似物。适用于本发明的启动子描述于“Useful proteins from recombinant bacteria(来自重组细菌的有用的蛋白)”Scientiﬁc American 242：74-94(1980)；和Sambrook等人.(2001)，同前。

[0208] 对于丝状真菌宿主细胞，用于指导本公开内容的核酸构建体的转录的适宜启动子包括获自以下的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶基因、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因、黑曲霉中性α-淀粉酶基因、黑曲霉酸稳定的α-淀粉酶基因、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶基因(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶基因、米曲霉碱性蛋白酶基因、米曲霉丙糖磷酸异构酶基因、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶基因、和尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶基因(WO 96/00787)、以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂交物)、和它们的突变的、截短的和杂交的启动子。

[0209] 在酵母宿主中，有用的启动子可来自以下：酿酒酵母烯醇化酶基因(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶基因(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸激酶基因(ADH2/GAP)。用于酵母宿主细胞的其它有用的启动子由Romanos等人.，1992，Yeast 8：423-88所描述。

[0210] 转录终止子

[0211] 克隆的内切葡聚糖酶也可具有适宜的转录终止子序列，该序列为由宿主细胞所识别以终止转录的序列。将终止子序列与编码多肽的核酸序列的3′末端可操作地连接。在所选宿主细胞中具备功能的任何终止子可用于本发明。

[0212] 例如，用于丝状宿主细胞的示例性的转录终止子可获自米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、构巢曲霉氨基苯甲酸合成酶基因、黑曲霉α-葡糖苷酶基因和尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶基因。

[0213] 用于酵母宿主细胞的示例性终止子可获自酿酒酵母烯醇化酶基因、酿酒酵母细胞色素C基因(CYC1)、和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因。用于酵母宿主细胞的其它有用的终止子由Romanos等人.，1992，Yeast 8：423-88所描述。

[0214] 前导序列

[0215] 适宜的前导序列可以是克隆的内切葡聚糖酶序列的部分，其为mRNA的非翻译区，其对于通过宿主细胞的翻译是重要的。前导序列与编码多肽的核酸序列的5′末端可操作地连接。可使用在所选择的宿主细胞中具有功能的任何前导序列。用于丝状真菌宿主细胞的示例性前导序列获自米曲霉TAKA淀粉酶基因和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶基因。用于酵母宿主细胞的适宜的前导序列获自酿酒酵母烯醇化酶基因(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因、酿酒酵母α-因子基因、和酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)。

[0216] 聚腺苷酸化序列

[0217] 序列还可包含聚腺苷酸化序列，其为与核酸序列的3′末端可操作地连接的序列，且当被转录时，其作为将聚腺苷残基添加至被转录的mRNA的信号而被宿主细胞所识别。在所选择的宿主细胞中具有功能的任何聚腺苷酸化序列可用于本发明。用于丝状真菌宿主细胞的示例性的聚腺苷酸化序列可来自米曲霉TAKA淀粉酶基因、黑曲霉葡糖淀粉酶基因、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶基因、尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶基因和黑曲霉α-葡糖苷酶基因。用于酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman，Mol Cell Bio 15：5983-5990(1995)所描述。

[0218] 选择标记

[0219] 本发明的表达载体优选地包含一个或多个选择标记，其允许被转化的细胞的方便筛选。选择标记是一种基因，其产物提供杀菌剂或病毒抗性、对重金属的抗性、营养缺陷体的原养型及类似的。细菌选择标记的例子是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或提供诸如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四环素抗性的抗生素抗性的标记物。用于酵母宿主细胞的适宜的标记物为ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。

[0220] 用于丝状真菌宿主细胞的选择标记包括，但不限于，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、和trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)，以及它们的等价物。用于黑曲霉细胞的实施方案包括构巢曲霉或米曲霉的amdS基因和pyrG基因，和吸水链霉菌的bar基因。

[0221] 示例性的表达载体

[0222] 用于本发明的表达载体是商业上可获得的。适宜的商业表达载体包括来自TMSigma-Aldrich Chemicals，St.Louis MO.的p3xFLAG 表达载体，其包括用于在哺乳动物宿主细胞中表达的CMV启动子和hGH聚腺苷酸化位点，和用于在大肠杆菌中扩增的pBR322复制起点和氨苄青霉素抗性标记。其它适宜的表达载体是pBluescriptll SK(-)和pBK-CMV、其是从Stratagene、La Jolla CA商业上可获得的，和来源于pBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pREP4、pCEP4(Invitrogen) 或 pPoly(Lathe 等人 .，Gene5.7：
193-201(1987))的质粒。如实施例中进一步描述的，优选的载体是来源于商业上可获得的巨大芽孢杆菌穿梭载体pMM1525(Boca Scientiﬁc Inc.Boca Raton，FL)的被修饰的载体。

[0223] 宿主细胞

[0224] 将编码内切葡聚糖酶的序列转化到宿主细胞中以允许内切葡聚糖酶载体的增殖和内切葡聚糖酶的表达。如上所述，内切葡聚糖酶经翻译后修饰以去除信号肽，而且在一些情况中可在分泌后被切割。

[0225] 在允许内切葡聚糖酶表达的条件下，在适宜的营养培养基中培养上述被转化或被转染的宿主细胞。用来培养细胞的培养基可以是适宜于培养宿主细胞的任何常规培养基，比如包含适当的补充物的基本培养基或复合培养基。任选地在HTP培养基中培养细胞。适宜的培养基是可从商业供应商获得的，或可根据公开的配方来制备(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中)。

[0226] 在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞。适宜的真核宿主细胞包括，但不限于，真菌细胞、藻细胞、昆虫细胞和植物细胞。适宜的真菌宿主细胞包括，但不限于，子囊菌(Ascomycota)、担子菌(Basidiomycota)、不完全菌(Deuteromycota)、接合菌(Zygomycota)、半知菌(Fungi imperfecti)。特别优选的真菌宿主细胞是酵母细胞和丝状真菌细胞。本发明的丝状真菌宿主细胞包括亚门真菌和亚门卵菌的所有丝状形式。(Hawksworth等人.，In Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK)。丝状真菌特征在于具有由几丁质、纤维素和其它复合多糖组成的细胞壁的营养菌丝体。本发明的丝状真菌宿主细胞在形态学上与酵母不同。

[0227] 在本发明中丝状真菌宿主细胞可以是以下属的物种的细胞，但不局限于这些属的物种的细胞：绵霉属(Achlya)、枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、头孢霉(Cephalosporium)、金孢属(Chrysosporium)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、色二孢属(Diplodia)、Endothis、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、胶枝霉属(Gliocladium)、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、毁丝霉属(Myceliophthora)、毛霉属(Mucor)、脉孢菌(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、柄孢壳菌属(Podospora)、白腐菌属(Phlebia)、厌气性瘤胃真菌(Piromyces)、梨形孢属(Pyricularia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱霉属(Scytalidium)、侧孢霉属(Sporotrichum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、栓菌属(Trametes)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、轮枝孢属(Verticillium)、草菇属(Volvariella)、或其有性型、或无性型、和异名或分类学等价物。

[0228] 在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为木霉属物种，例如长枝木霉(T.longibrachiatum)、绿色木霉(T.viride)(例如，ATCC 32098和32086)、红褐肉座菌或里氏木霉(NRRL 15709、ATTC 13631、56764、56765、56466、56767和RL-P37及其衍生物——参见Sheir-Neiss等人.，Appl.Microbiol.Biotechnology，20(1984)第46-53页)，康宁木霉(T.koningii)、和哈茨木霉(t.harzianum)。此外，术语“木霉”指先前被分类为木霉或现在被分类为木霉的任何真菌菌株。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞是曲霉属物种，例如，泡盛曲霉、烟曲霉(A.funigatus)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、臭曲霉(A.foetidus)、米曲霉、酱油曲霉(A.sojae)、和A.kawachi。(参考Kelly和Hynes(1985)EMBO J.4，475479；NRRL 3112、ATCC 11490、22342、44733、和14331；Yelton M.，等人.，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81、1470-1474；Tilburn等人.，(1982)Gene 26，205-221；和Johnston，I.L.等人.(1985)EMBO J.4，1307-1311)。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞是金孢属物种，例如，C.lucknowense、嗜角蛋白金孢(C.keratinophilum)、热带金孢(C.tropicum)、粪状金孢(C.merdarium)、贫乏金孢(C.inops)、C.pannicola、和C.zonatum。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞是毁丝霉属物种，例如，嗜热毁丝霉。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞是链孢霉属物种，例如，杆孢状镰孢(F.bactridioides)、谷类镰孢(F.cerealis)、克地镰孢(F.crookwellense)、黄色镰孢(F.culmorum)、禾谷镰孢(F.graminearum)、禾谷镰孢霉(F.graminum)、尖孢镰孢(F.oxysporum)、粉红镰孢(F.roseum)、和镶片镰孢(F.venenatum)。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞是脉孢属物种，例如，粗糙脉孢霉(N.crassa)。参考Case、M.E等人.，(1979)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76，5259-5263；美国专利第4,486,553号；和Kinsey，J.A.和J.A.Rambosek(1984)Molecular and Cellular Biology 4，117-122。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞是腐质霉属物种，例如，特异腐质霉、灰腐质霉和柔毛腐质霉。
在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞是毛霉属物种，例如，米赫毛霉(M.miehei)和卷枝毛霉(M.circinelloides)。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞是根霉属物种，例如，米根霉和雪白根霉(R.niveus)。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞是青霉属物种，例如，产紫青霉(P.purpurogenum)、产黄青霉(P.chrysogenum)和疣孢青霉(P.verruculosum)。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为梭孢壳属物种，例如，太瑞斯梭孢壳(T.terrestris)。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为弯颈霉属物种，例如，膨胀弯颈霉(T.inflatum)和T.geodes。在本发明的一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞为栓菌属物种，例如，长绒毛栓菌(T.villosa)和杂色栓菌(T.versicolor)。

[0229] 在本发明中，酵母宿主细胞可以是以下属的物种的细胞，但不限于这些属的物种的细胞：念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和耶罗威亚酵母属(Yarrowia)。在本发明的一些实施方案中，酵母细胞为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Saccaromycescarlsbergensis、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces norbensis、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、芬兰毕赤酵母(Pichia ﬁnlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia trehalophila)、Pichia kodamae、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、仙人掌毕赤酵母(Pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia salictaria)、Pichia quercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、Pichia angusta、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、白色念珠菌(Candida albicans)、和解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)。

[0230] 在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞是“Chrysosporium lucknowense C1”，比如例如在以下中被描述的菌株：美国专利第6,015,707号、第5,811,381号和第6,573,086号；美国专利公布第2007/0238155号、第US 2008/0194005号、第US 2009/0099079号；国际专利公布第WO 2008/073914号和第WO 98/15633号，以及其任何衍生物，并且包括，但不限于，Chrysosporium lucknowense Garg 27K、VKM-F 3500 D(登录号VKM F-3500-D)、C1菌株UV13-6(登录号VKM F-3632D)、C1菌株NG7C-19(登录号VKM F-3633D)、和C1菌株UV18-25(VKM F-3631D)，其全部已被保藏在俄罗斯科学院全俄微生物菌种保藏中心(All-Russian Collection of Microorganisms of Russian Academy of Sciences)(VKM)，Bakhurhina St.8，Moscow，Russia，113184。其它菌株包括在登录号ATCC 44006、CBS(皇家荷兰生物科技研究所培养物保藏中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures))122188、CBS 251.72、CBS 143.77、CBS 272.77、和VKM F-3500D下保藏的细胞。示例性的衍生物包括经修饰的微生物，其中删除了一个或多个内切葡聚糖酶基因或序列和/或被导入了一个或多个异源基因或序列。衍生物包括UV18#100f[Δalp1、UV18#100f[Δ]pyr5 [Δ]alp1、UV18#100.f Aalp1 Apep4 Aalp2、UV18#100.f[Δ]pyr5 Aalp1 Apep4 Aalp2 和 UV18#100.f [Δ]pyr4 [Δ]pyr5 Aalp 1 Apep4 Aalp2.，如WO2008073914中所描述，其在此通过引用并入。

[0231] 在本发明的一些实施方案中，宿主细胞是藻细胞，比如，衣藻(Chlamydomonas)(例如，莱茵衣藻(C.Reinhardtii))和席藻(Phormidium)(席藻P.sp.ATCC29409)。

[0232] 在其它的实施方案中，宿主细胞是原核细胞。适宜的原核细胞包括革兰氏阳性菌细胞、革兰氏阴性菌细胞和革兰氏染色不定细菌细胞。例如，但非限制性地，宿主细胞可以是以下属的物种：土壤杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、组囊蓝细菌属(Anacystis)、不动杆菌属(Acinetobacter)、热酸菌属(Acidothermus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、双歧杆菌属(Biﬁdobacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、巴克纳氏菌属(Buchnera)、Campestris属、Camplyobacter属、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、着色菌属(Chromatium)、粪球菌属(Coprococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、肠球菌属(Enterococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、梭杆菌属(Fusobacterium)、Faecalibacterium属、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、黄杆菌属(Flavobacterium)、Geobacillus属、嗜血菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、泥杆菌属(Ilyobacter)、微球菌属(Micrococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、Mesorhizobium属、甲基杆菌属(Methylobacterium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属 (Pseudomonas)、Prochlorococcus属、红细菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、Roseburia属、红螺菌属(Rhodospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)、Scenedesmus属、链霉菌属(Streptomyces)、链球菌属(Streptococcus)、Synecoccus属、糖单孢菌属(Saccharomonospora)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、沙雷氏菌属(Serratia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、热厌氧杆菌属 (Thermoanaerobacterium)、Tropheryma 属、Tularensis 属、Temecula 属、Thermosynechococcus属、热球菌属(Thermococcus)、尿枝原体属(Ureaplasma)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、木杆菌属(Xylella)、耶尔森菌属(Yersinia)和发酵单胞菌属(Zymomonas)。在一些实施方案中，宿主细胞为以下属的物种：土壤杆菌属、不动杆菌属、固氮菌属、芽孢杆菌属、双歧杆菌属(Biﬁdobacterium)、黑草属(Buchnera)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、肠球菌属(Enterococcus)、欧文氏菌属(Erwinia)、黄杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、泛菌属、假单胞菌属、葡萄球菌属、沙门氏菌属、链球菌属、链霉菌属和发酵单孢菌属。

[0233] 在其他实施方案中，细菌宿主菌株对人类是非致病的。在一些实施方案中，细菌宿主细胞是工业菌株。大量细菌工业菌株是已知的，并适宜于本发明。

[0234] 在本发明的一些实施方案中，细菌宿主细胞是土壤杆菌属物种，例如，放射形土壤杆菌(A.radiobacter)、发根土壤杆菌(A.rhizogenes)、和悬钩子土壤杆菌(A.rubi)。在本发明的一些实施方案中，细菌宿主细胞是节杆菌属物种，例如，金黄节杆菌(A.aurescens)、柠檬色节杆菌(A.cttreus)、球形节杆菌(A.globformis)、裂烃谷氨酸节杆菌(A.hydrocarboglutamicus)、迈索尔节杆菌(A.mysorens)、烟草节杆菌(A.nicotianae)、石蜡节杆菌(A.parafﬁneus)、A.protophonniae、A.roseoparqfﬁnus、硫磺色节杆菌(A.sulfureus)、和产尿节杆菌(A.ureafaciens)。在本发明的一些实施方案中，细菌宿主细胞是芽孢杆菌属物种，例如，苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、灿烂类芽孢杆菌(B.lautus)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、短芽孢杆菌(B.brevis)、坚强芽孢杆菌(B.ﬁrmus)、B.alkaophius、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。在具体的实施方案中，宿主细胞是工业芽孢杆菌菌株，包括但不限于，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。芽孢杆菌宿主细胞的一些优选的实施方案包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌。在一些实施方案中，细菌宿主细胞是梭状芽孢杆菌属物种，例如，丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)、破伤风梭菌(C.tetani)E88、C.lituseburense、糖丁酸梭菌(C.saccharobutylicum)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、和拜氏梭菌(C.beijerinckii)。在一些实施方案中细菌宿主细胞是棒状杆菌属物种，例如，谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)和嗜醋酸棒杆菌(C.acetoacidophilum)。在一些实施方案中，细菌宿主细胞是埃希氏菌属物种，例如，大肠杆菌。在一些实施方案中，细菌宿主细胞为欧文氏菌属物种，例如，噬夏孢欧文氏菌(E.uredovora)、胡萝卜软腐病欧文氏菌(E.carotovora)、菠萝欧文氏菌(E.ananas)、草生欧文氏菌(E.herbicola)、斑点欧文氏菌(E.punctata)、和E.terreus。在一些实施方案中，细菌宿主细胞是泛菌属物种，例如，柠檬泛菌(P.citrea)、和成团泛菌(P.agglomerans)。在一些实施方案中，细菌宿主细胞是假单胞菌属物种，例如，恶臭假单胞菌(P.putida)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、P.mevalonii、和假单胞菌P.sp.D-01 10。在一些实施方案中，细菌宿主细胞是链球菌属物种，例如，马链球菌(S.equisimiles)、化脓链球菌(S.pyogenes)、和乳房链球菌(S.uberis)。在一些实施方案中，细菌宿主细胞是链霉菌属物种，例如，产二素链霉菌(S.ambofaciens)、不产色链霉菌(S.achromogenes)、除虫链霉菌、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、金霉素链霉菌(S.aureofaciens)、金色链霉菌(S.aureus)、杀真菌链霉菌(S.fungicidicus)、灰色链霉菌(S.griseus)、和浅青紫链霉菌。在一些实施方案中，细菌宿主细胞是发酵单胞菌属物种，例如，运动发酵单胞菌(Z.mobilis)、和脂解发酵单胞菌(Z.lipolytica)。

[0235] 可用于本发明的实践中的、包括原核菌株和真核菌株的菌株，是易于从多个培养物保藏中心公开可得的，比如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物与细胞培养物保藏中心(DSM)、荷兰真菌保藏所(CBS)、和美国北方农业研究所培养物保藏中心(NRRL)。

[0236] 将载体或DNA构建体导入到宿主细胞中可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔或其它常用技术来实现(参见Davis，L.，Dibner，M.和Battey，I.(1986)Basic Methods in Molecular Biology(分子生物学基本方法)，其在此通过引用并入)。可在常规的营养培养基中培养基因工程化的宿主细胞，该细胞经修饰以适于激活启动子、筛选转化体或扩增内切葡聚糖酶多核苷酸。培养条件，比如温度、pH和类似的，是先前用于被筛选以用于表达的宿主细胞的那些，而且对本领域中的技术人员将是明显的，并在本文所引用的参考文献中，包括，例如，Sambrook，Ausubel和Berger，以及，例如，Freshney(1994)Culture of Animal Cells(动物细胞培养)，a Manual of Basic Technique(基本技术手册)，第三版，Wiley-Liss，New York；Payne等人.(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems(液体系统中植物细胞和组织培养)John Wiley & Sons，Inc.New York，NY；Gamborg和Phillips(编辑)(1995)Plant Cell、Tissue and Organ Culture(植物细胞、组织和器官培养)；Fundamental Methods Springer Lab Manual(基础方法斯普林格实验室手册)，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)和Atlas和Parks(编辑)。The Handbook of Microbiological Media(微生物培养基的手册)(1993)CRC Press，Boca Raton，FL，全部在此通过引用并入。

[0237] 被表达的内切葡聚糖酶的纯化

[0238] 本发明涉及一种方法，该方法生产具有内切葡聚糖酶活性的多肽，在引起编码内切葡聚糖酶的多核苷酸被表达的条件下在培养基中培养所述多核苷酸转化的宿主细胞，并任选地回收或分离被表达的EG多肽。通常，利用本领域熟知的蛋白回收技术，包括本文所描述的那些，从宿主细胞培养基、宿主细胞或肉汤中进行EG多肽的回收或分离。

[0239] 关于细胞的培养和产生的现有技术参考文献是可获得的，所述细胞包括细菌细胞、植物细胞、动物(尤其是哺乳动物)细胞和古细菌来源的细胞。参见，例如，Sambrook，Ausubel，和Berger(均同前)，以及Freshney(1994)Culture of Animal Cells(动物细胞的培养)，a Manual of Basic Technique(基本技术手册)，第三版，Wiley-Liss，New York及其中参考文献；Doyle和Grifﬁths(1997)Mammalian Cell Culture：Essential Techniques(哺乳动物细胞培养：基本技术)John Wiley和Sons，NY；Humason(1979)Animal Tissue Techniques(动物组织技术)，第四版W.H.Freeman and Company；和Ricciardelli，等人.，(1989)In vitro Cell Dev.Biol.25：1016-1024，其全部在此通过引用并入。关于植物细胞培养和再生，Payne等人.(1992)Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems(液体系统中的植物细胞和组织培养)John WIley & Sons、Inc.New York、NY；Gamborg和Phillips(编辑)(1995)Plant Cell、Tissue and Organ Culture(植物细胞、组织和器官培养)；Fundamental Methods Springer Lab Manual(基础方法斯普林格实验室手册)，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)；Jones，编辑.(1984)Plant Gene Transfer and Expression Protocols(植物基因转移和表达方案)，Humana Press，Totowa，New Jersey和Plant Molecular Biology(植物分子生物学)(1993)R.R.D.Croy，编辑.Bios Scientiﬁc Publishers，Oxford，U.K.ISBN 0 12 198370 6，其全部在此通过引用并入。常用的细胞培养基在Atlas和Parks(编辑)The Handbook of Microbiological Media(微生物培养基的手册)(1993)CRC Press，Boca Raton，FL中列出，其在此通过引用并入。用于细胞培养的另外的信息在可获得的商业文献中查找，比如来自Sigma-Aldrich，Inc(St Louis、MO)的Life Science Research Cell Culture Catalogue(生命科学研究细胞培养目录)(1998)(“Sigma-LSRCCC”)和，例如，还来自Sigma-Aldrich、Inc(St Louis、MO)的The Plant Culture Catalogue and supplement(植物培养目录和补充物)(1997)(“Sigma-PCCS”)，其全部在此通过引用并入。

[0240] 在一些实施方案中，在分批发酵或连续发酵条件下培养表达本发明的变体EG多肽的细胞。经典分批发酵是封闭系统，其中在发酵开始时设定了培养基的成分，且在发酵期间不经受人工改变。分批系统的变化形式是补料分批发酵，其在本发明中也是有用的。在该变化形式中，随发酵进展以增量添加底物。当分解代谢物阻遏可能抑制细胞的新陈代谢时，和在培养基中需要有限的量的底物时，补料分批系统是有用的。分批发酵和补料分批发酵是本领域中常用的和熟知的。连续发酵是开放系统，其中将确定的发酵培养基连续添加到生物反应器中并同时将等量的条件培养基移除以进行处理。连续发酵一般以恒定的高密度维持培养物，其中细胞主要处于对数期生长。连续发酵系统力求维持稳态生长条件。用于调节连续发酵过程的营养素和生长因子的方法和用于使产物形成的速率最大化的技术是工业微生物领域中熟知的。

[0241] 可回收/分离所得的多肽，并任选地通过本领域已知的多种方法中的任何方法来纯化。例如，可通过常规方法将多肽从营养培养基中分离，所述常规方法包括但不限于，离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱聚集法和尺寸排阻)，或沉淀。按照需要在完成成熟蛋白的构型中可使用蛋白再折叠步骤。最终，可在最终纯化步骤中使用高效液相色谱层析(HPLC)。除以上提到的参考文献之外，多种纯化方法是本领域中熟知的，包括，例如以下中所列出的那些：Sandana(1997)Bioseparation of Proteins，Academic Press，Inc.；Bollag等人.(1996)Protein Methods，第二版，Wiley-Liss，NY；Walker(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press，NJ；Harris和Angal(1990)Protein Puriﬁcation Applications：A Practical Approach(蛋白纯化应用：实践方法)，IRL Press at Oxford，Oxford，England；Harris和Angal Protein PuriﬁcationMethods：A Practical Approach(蛋白纯化方法：实践方法)，IRL Press at Oxford，Oxford，England；Scopes(1993)Protein Puriﬁcation：Principles and Practice(蛋白纯化：原理和实践)第三版，Springer Verlag，NY；Janson和Ryden(1998)Protein Puriﬁcation：Principles，High Resolution Methods and Applications( 蛋白纯化：原理、高分辨率方法和应用)，第二版，Wiley-VCH，NY；和Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROM(CD-ROM上的蛋白实验方案)，Humana Press，NJ，其全部在此通过引用并入。用于从细胞裂解物中回收EG多肽的方法在实施例2中示出。

[0242] 利用本发明的多核苷酸，还可使用无细胞转录/翻译系统来产生EG多肽。一些这样的系统是商业上可获得的。体外转录和翻译实验方案的一般指南可在Tymms(1995)In vitro Transcription and Translation Protocols：Methods in Molecular Biology(体外转录和翻译实验方案：分子生物学中的方法)，卷37，Garland Publishing，NY中查找，其在此通过引用并入。

[0243] EG组合物和使用方法

[0244] 本文所描述的变体内切葡聚糖酶的产生具有多种工业应用；其包括但不限于，糖产生(例如，葡萄糖糖浆)、生物燃料产生、纺织品处理、纸浆或纸处理和清洁剂或动物饲料中的应用。可使用含有本发明的变体内切葡聚糖酶的宿主细胞而不回收和纯化重组内切葡聚糖酶，例如，以用于大规模的生物发酵器中。或者，可从宿主细胞中表达和纯化重组内切葡聚糖酶。

[0245] 本文所描述的变体内切葡聚糖酶对于将纤维素分解为较小的寡糖、二糖和单糖是特别有用的。如以上所详细讨论的，变体内切葡聚糖酶在章节III中所描述的糖化方法中是有用的。可选地，可将变体内切葡聚糖酶与包括诸如常规酶促糖化方法的其它纤维素酶相组合，以产生可发酵的糖类。

[0246] 在一些实施方案中，EG酶组合物可与生物质底物在约25℃到100℃、约30℃到90℃、约30℃到80℃、和约30℃到70℃的范围中反应。而且生物质可与EG酶组合物在约
25℃、在约30℃、在约35℃、在约40℃、在约45℃、在约50℃、在约55℃、在约60℃、在约
65℃、在约70℃、在约75℃、在约80℃、在约85℃、在约90℃、在约95℃和在约100℃反应。
一般，pH范围将为从约pH 3.0到8.5、pH 3.5到8.5、pH 4.0到7.5、pH 4.0到7.0和pH
4.0到6.5。孵育时间可以不同，例如从1.0到240小时、从5.0到180小时和从10.0到
150小时。例如孵育时间将为至少1小时、至少5小时、至少10小时、至少15小时、至少25小时、至少50小时、至少100小时、至少180小时和诸如此类)。在这些条件下孵育纤维素酶将导致大量的可溶性糖类从底物释放。例如与通过母体多肽释放糖相比较，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的或更多的可溶性或可发酵糖可以是可获得的。

[0247] 可将可发酵糖类发酵为用作生物燃料的醇类(例如，乙醇)。本发明的变体内切葡聚糖酶可在用来从纤维素产生醇类或其它生物燃料的任何方法中应用，并且不必限于本文所描述的那些方法。两种常用的方法是分步糖化发酵(SHF)方法(参见，Wilke等人.，Biotechnol.Bioengin.6：155-75(1976))或同步糖化发酵(SSF)方法，例如在美国专利第3,990,944号和第3,990,945号中所公开的。

[0248] 糖化的SHF方法包括以下步骤：将纤维素酶与含纤维素的底物相接触以将纤维素酶促分解成可发酵糖类(例如，诸如葡萄糖的单糖)，将可发酵糖类与产醇微生物相接触以产生醇(例如，乙醇或丁醇)并回收该醇。

[0249] 除SHF方法之外，可使用SSF方法。在一些情况中，SSF方法与SHF方法所提供的醇产生相比导致了较高效率的醇产生(Drissen等人.，Biocatalysis and
Biotransformation 27：27-35(2009)。SSF相比SHF的一个缺点是SSF所需的温度高于SHF所需的温度。在一个实施方案中，本发明要求保护具有高于参考EG的热稳定性的EG多肽，并且实践本发明的人如果使用本文所描述的纤维素酶与SSF相组合将预期乙醇产量增高。

[0250] 为了在本发明的纤维素酶存在下，将纤维素物质有效地用作糖化反应的底物，需要预处理底物。预处理纤维素物底物的方法是本领域中已知的，且本发明不受这些方法的限制。

[0251] 本发明可应用诸如酿酒酵母的本领域已知的任何产醇微生物，以将可发酵糖类发酵为醇类和其它终产物。

[0252] 使用本发明所包含的一种或多种EG变体产生的可发酵或可溶性糖类可用来产生除醇类外的其它终产物，比如但不限于其它生物燃料化合物，丙酮、氨基酸、有机酸、甘油、抗坏血酸、1，3-丙二醇和其它化学品。

[0253] 本发明的变体内切葡聚糖酶也可用于纺织品加工或清洁。这样的加工包括但不限于，石洗、去起球(depilling)、去起毛(defuzzing)、颜色净化(color clariﬁcation)、粗糙度降低、改变含纤维素织物的纹理、触感和/或外观或含纤维素织物的生产或清洁/修复过程中使用的其它技术。此外，在本发明的情况中进行的处理考虑了从纤维素织物或纤维中去除“未成熟”或“死”棉。由于诸如不均匀染色，未成熟棉显著地比成熟棉更加杂乱。

[0254] 可从本发明的内切葡聚糖酶开发清洁剂。根据本发明有用的清洁剂组合物可包括专门制剂，比如预洗、预浸泡和家庭使用颜色修复组合物。这样的处理组合物可以是需要稀释的浓缩物的形式，或稀释溶液的形式或可直接应用于含纤维素织物的形式。作为清洁剂，本发明的内切葡聚糖酶对于污物去除是有用的，以提高织物护理性质、或提高家用颜色净化和修复作用。用于纺织品的纤维素酶处理的一般处理技术在例如欧洲专利公布第2200016号中被描述。

[0255] 利用本发明的酶制品处理的纺织品材料可由含天然纤维素的纤维或含合成纤维素的纤维或其混合物制成。天然纤维素制品的例子为棉、亚麻织物、大麻制品、黄麻纤维和苎麻制品。合成纤维素制品的例子为黏胶纤维、醋酸纤维素、三乙酰纤维素、人造丝、铜纤维和溶解性纤维(lyocell)。上述的纤维素制品还可用于多种掺和物中，包括合成纤维诸如聚酯、聚酰胺或丙烯酸纤维。纺织材料可以是纱线或针织的或编织的、或通过任何其它方式形成的。

[0256] 本文所述的内切葡聚糖酶在纸浆和纸工业中也是有用的。在纸浆和纸工业中，可将中性纤维素酶用于，例如，具有中性或碱性pH的不同的再利用纸和纸板的脱墨、改良纤维品质、或提高造纸中的排水。其它例子包括印刷膏增稠剂和纺织品印刷后过量染料的去除，或作为对动物饲料的处理以协助含高水平纤维素的饲料的消化。

[0257] 在一些实施方案中，可将变体EG与其它纤维素酶组合以形成纤维素酶混合物。本领域中的技术人员知道可与本发明的变体EG组合使用的其它纤维素酶。商业纤维素酶是已知的并是从Danisco Inc，Genencor division，Novozymes，and Iogen可获得的。纤维素酶混合物的酶类共同作用导致来自生物质底物的纤维素的解晶作用和水解以产生可溶性糖类，比如但不限于葡萄糖(Brigham等人.，(1995)in Handbook on Bioethanol(C.Wyman编辑)第119-141页，Taylor and Francis，Washington DC)。

[0258] 本发明的内切葡聚糖酶可与诸如缓冲液、表面活性剂和/或擦洗剂的其它任选的成分相组合。缓冲液可与本发明的纤维素酶一起使用在应用纤维素酶的溶液中维持4-5的pH。所应用的缓冲液的精确浓度将根据一些因素而不同，这些因素是本领域中的技术人员可测定的。适宜的缓冲液是本领域中熟知的。可进一步将表面活性剂与本发明的纤维素酶一起使用。适宜的表面活性剂包括与所应用的纤维素酶和织物相容的任何表面活性剂，包括例如阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂和两性表面活性剂。适宜的阴离子表面活性剂包括但不限于，线性或分支的烷基苯磺酸盐；具有线性的或分支的烷基基团或烯基基团的烷基醚硫酸盐或烯基醚硫酸盐；烷基硫酸盐或烯基硫酸盐；烯烃磺酸盐；烷基磺酸盐等。用于阴离子表面活性剂的适宜的抗衡离子包括但不限于，碱金属离子诸如钠和钾；碱土金属离子诸如钙和镁；铵离子；和具有1至3个碳数2或3的烷醇胺。两性表面活性剂包括，例如，季铵盐磺酸盐类，和甜菜碱型两性表面活性剂。非离子表面活性剂一般包括聚氧化烯醚，以及高级脂肪酸链烷醇酰胺或其氧化烯加合物、和脂肪酸甘油单酯。如本领域中已知的，还可应用表面活性剂的混合物。

[0259] 本发明可以有效的量、浓度和时间长度来实践。纤维素酶的有效量是足够用于其预期目的的纤维素酶的浓度。例如，溶液中纤维素酶的有效量可根据是否预期目的为在糖化过程中或例如在诸如石洗牛仔的纺织品应用中使用包括EG的酶组合物而不同。所应用的内切葡聚糖酶的量进一步取决于所应用的设备、所应用的工艺参数和纤维素酶活性，例如，其中与较低活性的纤维素酶组合物相比使用了较高活性的纤维素酶组合物的特定的溶液将需要较低浓度的内切葡聚糖酶。内切葡聚糖酶的浓度和内切葡聚糖酶与预期靶标相接触的时间长度进一步取决于本领域技术人员所应用的如本文所描述的特定用途。

[0260] 本领域中的技术人员可在水溶液或固体内切葡聚糖酶浓缩物中利用内切葡聚糖酶来实践本发明。当应用水溶液时，可方便地稀释内切葡聚糖酶溶液以提供精确的浓度。浓缩物可以为本领域中所识别的任何形式，包括但不限于，液体、乳液、凝胶、糊剂、颗粒、粉末、附聚物或固体盘状物。按照需要，根据组合物的预期用途，可与本发明的纤维素组合物一起使用或放置于本发明的纤维素组合物中的其它材料包括石料、浮石粉、填料、溶剂、酶激活剂和抗再沉积剂。
实施例

[0261] 提供以下的实施例以示例但非限制要求保护的发明。

[0262] 实施例1

[0263] 野生型除虫链霉菌内切葡聚糖酶(SavO EG)基因获得和表达载体的构建

[0264] 基于报道的氨基酸序列(Omura等人.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：12215-20)和如在此通过引用并入的WO2008042876中的实施例1中所描述的并入的密码子优化算法，对编码除虫链霉菌内切葡聚糖酶(SavO EG)的基因进行密码子优化以用于在巨大芽孢杆菌和大肠杆菌中表达。由GenScript Corporation(GenScript Corporation，120 Centennial Ave.，Piscataway，NJ 08854，USA)合成基因并验证DNA序列。利用BsrGI/NgoMIV克隆位点在巨大芽孢杆菌“优化的”信号肽加间隔区(编码氨基酸残基DTSM的12个碱基，SEQ ID 16)之后将基因克隆到大肠杆菌/巨大芽孢杆菌穿梭载体pSSBm27中。载体pSSBm27是基于穿梭载体pMM1525(Boca Scientiﬁc Inc.，Boca Raton，FL)经修饰的载体。
信号肽和基因在由存在于穿梭载体上的木糖抑制基因(xylR)调控的木糖启动子(Pxyl)的控制下。载体含有用于芽孢杆菌的“rep U”复制起点和四环素氨苄青霉素抗性标记。载体还含有用于在大肠杆菌中维持的pBR322复制起点和氨苄青霉素抗性标记。将所得的质粒(pSSBm27-SavO EG)通过DNA转移的标准PEG-介导的方法转化到巨大芽孢杆菌原生质体中。验证来自转化体的SavO EG序列。被克隆到穿梭载体pSSBm27中的催化结构域、连接体和纤维素结合结构域的多核苷酸序列由SEQ ID NO：5所限定。

[0265] 如以下所讨论的，SavO天然4和SavO变体(例如，变体1、3、5、6等)被表达为融合蛋白，该融合蛋白包括巨大芽孢杆菌信号肽和氨基末端间隔子序列。

[0266] 实施例2

[0267] 摇瓶程序

[0268] 将包含具有SavO EG基因的质粒的巨大芽孢杆菌的单一微生物菌落接种到含有10μg/mL四环素的1ml Luria-Bertani(LB)肉汤(0.01g/L来自酪蛋白的蛋白胨、0.005g/L酵母提取物、0.01g/L氯化钠)中。在培养箱中在37℃下在250rpm的振动下使细胞生长过夜(至少16小时)。然后将培养物稀释到含50mL A5培养基(2g/L(NH4)2SO4、3.5g/L KH2HPO4、7.3g/L Na2HPO4、1g/L酵母提取物、pH至6.8)、50μL的痕量元素溶液(49g/L MnCl2.4H2O、45g/L CaCl2、2.5g/L(NH4)Mo7.O24.H2O、2.5g/L CoCl2.6H2O)、750μL的20％葡萄糖、75μL的1M MgSO4、50μL的10mg/mL四环素、50μL的2.5g/L FeSO4.7H2O的250ml烧瓶中，至600nm处的光密度(OD600)为0.2，并在37℃下使其生长。当培养物的OD600为0.6至
0.8时用0.5％的木糖(终浓度)诱导SavO EG基因的表达，并过夜孵育(至少16小时)。
通过离心使细胞沉淀(4000rpm，15分钟，4℃)。收集含有分泌的SavO EG酶的澄清的培养基上清液，并贮存在-20℃。如通过Lemaire，等人.1993，J.Bact.，175(11)：3353-3360(其在此通过引用并入)所描述的，用pNPC(对硝基苯基-β-D-纤维二糖糖苷)作为底物验证SavO EG活性。实验程序还用于内切葡聚糖酶活性测定。

[0269] 实施例3

[0270] 接种摇瓶程序

[0271] 将包含编码SavO EG的质粒的巨大芽孢杆菌的单一微生物菌落接种到含10μg/ml四环素和0.5％葡萄糖的250ml A5肉汤(2.0g/L硫酸铵、7.26g/L的磷酸氢二钠、3.52g/L的磷酸二氢钾、1.0g/L的Tastone-154酵母提取物、1.5ml/L的1M硫酸镁溶液、1.0ml的2.5g/L七水合硫酸亚铁溶液和包含45.0g/L的氯化钙、49.0g/L的氯化镁四水合物、2.5g/L的氯化钴六水合物、和2.5g/L钼酸铵水合物的1.0ml/L的痕量元素溶液)中。在培养箱中在37℃下在250rpm的摇动下使细胞生长过夜(至少12小时)。当培养物的OD600为3.0至5.0时，从培养箱中移出细胞并立即用于接种发酵罐，或在4℃下贮存直到使用。

[0272] 实施例4

[0273] 参考内切葡聚糖酶表达；发酵程序

[0274] 在15L通气搅拌发酵罐中，将包含0.88g/L硫酸铵、1.0g/L柠檬酸钠、12.5g/L磷酸氢二钾三水合物、6.25g/L磷酸二氢钾、3.3g/L Tastone-154酵母提取物、2.0g/L Phytone蛋白胨、和包含45.0g/L的氯化钙、49.0g/L的氯化镁四水合物、2.5g/L的氯化钴六水合物和2.5g/L钼酸铵水合物的1.0ml/L的痕量元素溶液的6.0L生长培养基进行灭菌并调至37℃的温度。添加包含500g/L葡萄糖一水合物、12g/L氯化铵和5.0g/L无水硫酸镁的120.0mL料液。添加0.083g/L的柠檬酸铁铵和10μg/mL的四环素。用巨大芽孢杆菌的指数后期培养物接种发酵罐，该培养物包含包含编码SavOEG的质粒，并如实施例3中所描述的在摇瓶中生长至起始OD600为3.0至5.0。在500-1200rpm下搅拌发酵罐并以0.6-25.0L/分钟向发酵容器供给空气以维持50％饱和的溶解氧水平。通过添加28％v/v的氢氧化铵将培养物的pH控制在7.0。通过添加包含500g/L葡萄糖一水合物、12g/L氯化铵和5.0g/L无水硫酸镁的料液来维持培养物的生长。在培养物达到70±10的OD600之后，通过添加木糖诱导SavO EG的表达以获得并维持0.5％的浓度。使培养物再生长12小时。然后将培养物冷却至4℃并在4℃下维持直至收获。通过在Sorval RC12BP离心机中在4℃下在5000G下离心30分钟来收获培养基上清液。

[0275] 倒出澄清的上清液，并利用具有10kDa的分子量截留的聚醚砜聚合物超滤薄膜将其浓缩10倍。利用至少3个体积的100mM的醋酸钠缓冲液pH5.0对浓缩物进行透析。将最终浓缩物分散到浅容器中并贮存在-80℃下。.

[0276] 实施例5

[0277] 测定内切葡聚糖酶活性的测定

[0278] 可通过对硝基苯基-β-D-纤维二糖糖苷(pNPC)测定，或纤维素测定来测定内切葡聚糖酶活性。

[0279] 利用基于pNPC(对硝基苯基-β-D-纤维二糖)的比色测定来测量EG活性。在150μL的总体积中，将包含EG酶的50μL澄清的培养基上清液添加到在25mM醋酸钠缓冲液pH 4-5中的5mM pNPC(来自Sigma)溶液。在pH 5、50℃下或pH 4、70℃下孵育反应24小时。在150μL的总体积中，将20μL(pH 5、50℃)或75μL(pH 4、70℃)的反应混合物用1M碳酸钠pH 11溶液来猝灭。在405nm处测量溶液的吸光度以测定pNPC到对硝基苯基的转化。在405nm处测量对硝基苯酚的释放(ε＝17,700M-1cm-1)以计算EG活性。在高通量筛查条件下(pH 4、70℃)观察到可检测的EG活性(～20％相比于最佳条件(pH 5、
50℃)下)。

[0280] 还利用纤维素测定测定了EG活性，其使用Avicel(微晶纤维素酶，来自Sigma)作为底物。在150μL的总体积中，将包含EG酶的75μL澄清培养基上清液添加到含200g/L Avicel的300mM醋酸钠缓冲液(pH 4-5)中。在50-70℃下孵育反应24小时。用150μL的10mM硫酸来猝灭生物转化。利用装备有HPX-87H离子排阻柱(300mm x 7.8mm)的Agilent HPLC 1200，使用80℃下1.0mL/分钟流速的水作为洗脱剂测量Avicel到可溶性糖寡聚物的转化。纤维二糖和葡萄糖的保留时间分别为4.7分钟和5.8分钟。在高通量筛查条件下(pH 4、70℃)观察到可检测的SavO EG活性(～20％相比于最佳条件下(pH 5、50℃))。

[0281] 实施例6

[0282] 最佳SavO EG活性的评估

[0283] 在不同的温度(50℃、60℃和70℃)和pH(4.4-6.8)下利用Avicel(200g/L)作为底物研究CDX-SavOcat(SEQ ID NO：2)的活性曲线。实验程序和分析程序如实施例5中所描述。如图3中所示，在pH 5和50℃下CDX-SavOcat(SEQ ID NO：2)表现出最佳活性，并在pH 4.4和70℃下观察到可检测的内切葡聚糖酶活性。

[0284] 实施例7

[0285] 鉴定改良的SavO EG变体的高通量测定

[0286] 将包含变体eg基因的质粒文库转化到巨大芽孢杆菌中并铺板于包含3μg/mL四环素的Luria-Bertani(LB)琼脂板上，该琼脂板具有DM3再生培养基覆盖物(400mM琥珀酸二钠盐、pH 7.3、0.5％酪蛋白氨基酸、0.5％酵母提取物、0.4％K2HPO4、0.2％KH2PO4、20mM MgCl2、0.5％葡萄糖和0.2％BSA)。在30℃下孵育至少18小时后，利用Q-bot 机器菌落挑选器(Q-bot robotic colony picker)(Genetix USA，Inc.，Beaverton，OR)将菌落挑选到包含180μL LB和10μg/mL四环素的浅的96孔孔式微量滴定板中。在200rpm摇动和85％湿度下，在37℃下使细胞生长过夜。然后将20μL的该培养物转移到包含如实施例2中所描述的380μL A5-葡萄糖培养基和10μg/mL四环素的96孔微量滴定板(深孔)中。
在37℃下在250rpm的摇动下孵育深孔板2小时(OD6000.6-0.8)后，通过终浓度至1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导细胞培养物表达重组基因。然后将平板在37℃下在250rpm的摇动和85％湿度下孵育过夜(～15-18小时)。在4000rpm下将深孔板离心15分钟并将包含分泌的EG酶的澄清培养基上清液用于高通量pNPC或Avicel测定。

[0287] 利用分级的过程高通量筛查SavO EG文库。通过1级比色的基于pNPC的高通量测定筛查SavO EG变体(底物：pNPC；pH：4.0；温度：70℃；时间：24小时)。随后使从1级测定鉴定的活性EG变体经受2级HPLC测定(底物：Avicel；pH：4.0-5.0；温度：60-70℃；时间：24小时)以鉴定改良的变体。

[0288] 1级变体筛查是基于pNPC的高通量测定。在浅的、96孔微量滴定板中将50μL的培养基上清液添加到含5mM pNPC的100μL醋酸钠缓冲液pH 4.0中。在用铝/聚丙烯薄片热封胶带(Velocity11(Menlo Park，CA)，Cat#06643-001)密封后，在70℃下摇动平板达24小时。在4000rpm下离心平板5分钟。在浅孔透明微量滴定板中，每孔用75μL的1M碳酸钠pH11溶液来猝灭75μL的反应混合物。轻轻混合溶液3次，并在405nm处测量吸光度以鉴定活性SavO EG变体。

[0289] 2级变体筛查为基于纤维素的高通量测定。在深的96孔微量滴定板中，将75μL培养基上清液添加到含200g/LAvicel(微晶纤维素，来自Sigma)的75μL的300mM醋酸钠缓冲液pH 4.0-5.0中。在用铝/聚丙烯薄片热封胶带(Velocity11(Menlo Park，CA)，Cat#06643-001)密封后，在60-70℃下摇动平板达24小时。通过将150μL的10mM硫酸添加到深孔板中来猝灭反应物。在4000rpm下离心平板5分钟。用0.45μm弱结合亲水PTFE过滤板(low-binding hydrophilic PTFE ﬁlter plate)(Millipore，Billerica，MA)过滤来自反应混合物的150μL的上清液。用热封胶带密封HPLC样品板以防止蒸发。如实施例5B中一样，利用装备有HPX-87H离子排阻柱(300mm x 7.8mm)的Agilent HPLC 1200，使用
80℃下1.0mL/分钟流速的水作为洗脱剂测量Avicel到可溶性糖寡聚物的转化。如实施例
5中所描述的，纤维二糖和葡萄糖的保留时间分别为4.7分钟和5.8分钟。

[0290] 实施例8

[0291] 基因工程化的SavO EG变体的改良的内切葡聚糖酶活性

[0292] 如实施例7中所描述的，从不同的SavO EG变体文库的高通量筛查中鉴定改良的SavO EG变体。表4A、4B和4C描绘了本发明所包含的EG变体活性的改良。

[0293] 表4A显示了来源于CDX-SavOcat(SEQ ID NO：2)的改良的SavO EG变体。在筛查中将这些变体与CDX-SavOcat(SEQ ID NO：2)直接对比。CDX-SavOcat变体和SavO EG变体都包含N-末端“DTSM”间隔子(SEQ ID NO：16)。在表4A中，使用无N-末端间隔子的SavO EG催化结构域(对应于SEQ ID NO：1)用作对改变的氨基酸残基编号的参考序列。星号对应于用于表4B中所描述的变体的后一轮比较的变体。

[0294] 表4A

[0295]

[0296]

[0297]

[0298]

[0299]

[0300] 1改良倍数如下所示：

[0301] +＝超越CDX-SavOcat(SEQ ID NO：2)的1.1至2.0倍改良

[0302] ++＝超越CDX-SavOcat(SEQ ID NO：2)的2.1至2.2倍改良

[0303] 表4B显示了来源于CDX-SavOcat(SEQ ID NO：2)的改良的SavO EG变体。在筛查中变体不直接与CDX-SavOcat比较，而是与来自表4A的最佳变体(A29P、A53P、S74P、N191P)比较，且该序列用作对照(“+对照”)以评价超越CDX-SavOcat活性的改良倍数(FI)。CDX-SavOcat和变体均含有N-末端“DTSM”间隔子(SEQ ID NO：16)。在表4B中，天然SavO EG序列(无N-末端间隔子的催化结构域，SEQ ID NO：1)用作参考序列用于改变的氨基酸残基的编号。双星号(**)对应于用于表4C中所描述的变体的后一轮比较的变体。

[0304] 表4B

[0305]

[0306]

[0307]

[0308] 1改良倍数如下所示：

[0309] ++＝超越对照(A29P，A53P，S74P，N191P)的1.1至1.5倍改良

[0310] +++＝超越对照(A29P，A53P，S74P，N191P)的1.6至2.8倍改良

[0311] 表4C显示了来源于“SavO天然4”EG催化结构域的改良的内切葡聚糖酶变体，也称为“CDX-SavOcat”(SEQ ID NO：2)。在筛查中变体不直接与CDX-SavOcat相比，而是与来自表4B(S10W、A29P、Q43R、A53P、S74P、V82I、M98V、N191P)的最佳变体相比，且将该序列用作对照(“+对照”)以评价超越CDX-SavOcat活性的改良倍数(FI)。CDX-SavOcat和表4A-C中的变体均包含N-末端“DTSM”间隔子(SEQ ID NO：16)。在表4C中，将无N-末端间隔子的SavO EG催化结构域(对应于SEQ ID NO：1)用作对改变的氨基酸残基编号的参考序列。

[0312] 表4C

[0313]

[0314]

[0315] 1改良倍数是超越来自表4B的对照变体

[0316] (S10W，A29P，Q43R，A53P，S74P，V82I，M98V，N191P)SEQ ID NO：7，按如下表示：

[0317] ++++＝超越对照(S10W，A29P，Q43R，A53P，S74P，V82I，M98V，N191P)的1.1至1.5倍改良

[0318] +++++＝超越对照(S10W，A29P，Q43R，A53P，S74P，V82I，M98V，N191P)的1.6至3.0倍改良

[0319] 对六个SavO EG变体和CDX-SavOcat进行表征以测定它们在高温(65-70℃)下的稳定性。在pH4-5、65-70℃下将包含多种SavO EG变体酶的样品预孵育0-48小时。在热攻击(thermal challenge)后利用pNPC作为底物在pH5、50℃下持续1小时而测量残留酶活性。表5示出了改良的SavO EG变体在pH 5、65℃和pH 4、70℃下的半衰期。

[0320] 表5

[0321] 改良的SavO EG变体的半衰期

[0322]

[0323] 在糖化条件下验证改良的SavO EG变体。图4显示了在200g/L Avicel、pH 4、70℃的条件下通过本发明的多种内切葡聚糖酶(SavO天然4、SavO变体3、SavO变体5、和SavO变体6)经过48小时纤维二糖和葡萄糖的产生。在所检验的条件下SavO变体5表现出最高的稳定性。

[0324] 实施例9

[0325] 基因工程化的SavO EG变体的改良的生成葡糖活性

[0326] 在糖化相关条件pH 5、65℃下评估CDX-SavOcat(SEQ ID NO：2)或SavO变体5(SEQ ID NO：8)的剂量响应。利用不同的SavO EG载量(0-2.5g/L)测量经过48小时时段从Avicel进行的纤维二糖和葡萄糖产生。令人惊奇地，SavO EG变体5表现出显著的生成葡糖活性。在该条件下，SavO变体5与CDX-SavOcat(SEQ ID NO：2)相比表现出～16x改良的生成葡糖活性。参见图5。

[0327] 实施例10

[0328] 用于巨大芽孢杆菌中SavO EG产生的信号肽

[0329] 在巨大芽孢杆菌宿主中将来自巨大芽孢杆菌ORF 2879的信号肽序列MKRIVMVGFILLFPLNMLAGPIS SIAEAQ(SEQ ID NO：9)用于SavO EG的产生。如实施例1中所描述的，将信号肽和SavO EG基因(SavO变体5，SEQ ID NO：8)克隆到大肠杆菌/巨大芽孢杆菌穿梭载体中。导入以协助克隆的SpeI位点将三肽TSM导入到信号肽羧基末端和EG氨基末端之间(SEQ ID NO：10)。将所得的质粒转化到如实施例1中所描述的巨大芽孢杆菌原生质体中。在HTP中培养构建体，通过实施例5中所描述的pNPC和Avicel测定来测定澄清培养基上清液和细胞裂解物的活性。测定条件为5mM pNPC，pH 5，45℃持续1小时。
活性数据表明～97％的SavO EG从巨大芽孢杆菌分泌。

[0330] 通过按照实施例2、3和4中所描述的程序在摇瓶和发酵规模下利用该信号肽还产生了SavO EG变体5。图6显示了包括SEQ ID NO：10的两个独立分离的克隆(SO544和SO704)将EG产生的量与阳性对照(如上所述，将巨大芽孢杆菌优化的信号肽与SavO序列相连接)相比提高了约1.5倍。

[0331] 实施例11

[0332] 通过SavOEG降低预处理的甘蔗渣的屈服应力

[0333] 利用IKA A11分析型磨机(Wilmington、U.S.A)碾磨包含60％葡聚糖的预处理的甘蔗渣，并利用35筛目筛网过筛。收集小于35筛目的级分并在所需pH(3.5-5.5)的250mM醋酸钠缓冲液中制备甘蔗渣的溶液。在20ml闪烁管中以10ml的总体积进行实验。添加SavO EG变体5至终浓度为3.7％(相对于葡聚糖重量w/w)且最终底物负载为200g/l。在同样条件下孵育不含SavO的对照。在46小时的反应时间末期测量可溶性糖类和屈服应力。使用振荡应力扫描来测定屈服应力，一般如在Knutson和Liberatore，2009，J.Rheol.53：
877-92中所描述的。利用Malvern Bohlin Gemini流变仪(Westborough，Ma，USA)在振荡模式中在1Hz的频率下测量样品和对照的屈服应力和相角。为实现该目的使用了两种几何形状。对于浓和粘稠的样品(初级的，对照)，使用平行板几何形状(20mm)来测定屈服应力。用SavO进行的处理使甘蔗渣样品呈粒径减小并完全均质化的“流体样”。因此使用杯中叶片(vane-in-cup)几何形状(10mm叶片在14mm杯中)来测量这些样品的屈服应力。所有测量在25℃下进行，温度由Peltier热交换器来控制。屈服应力被定义为相角变为大于
45°处的应力。

[0334] 为测量可溶性糖类，将1ml的等份取出至离心管中并离心。收集上清液并通过添加10mM硫酸(1∶1)来猝灭，且然后进行过滤。利用装备有HPX-87H离子排阻柱的Agilent HPLC 1200，使用65℃下0.6mL/分钟流速的5mM的H2SO4作为洗脱剂测量纤维二糖和葡萄糖。纤维二糖和葡萄糖的保留时间分别为7.5分钟和9.1分钟。

[0335] 结果

[0336] 如表6中所示，SavO EG可有效地用于降低甘蔗渣的屈服应力。不添加酶的对照具有3000Pa的屈服应力。添加3.7％SavO EG变体5(SEQ ID NO：8)持续46小时导致预处理的甘蔗渣的屈服应力的显著降低(90％至99.7％降低)。这表明改良的SavO EG能够在一系列的pH和温度条件下降低甘蔗渣的屈服应力。

[0337] 表6

[0338]SavO pH 温度(℃) 屈服应力(Pa)
对照，无酶 3.5 65 3000
3.7％ 3.5 65 295
3.7％ 4.5 50 8
3.7％ 4.5 75 33
3.7％ 5.0 75 9
3.7％ 5.0 60 18

[0339] 实施例12

[0340] 酶的组合(SavO+AccelleraseTM1000)

[0341] 利用添加SavO变体6的AccelleraseTM1000进行糖化反应。反应以2个阶段进行。在第一阶段中，将0.25％SavO EG添加到反应器中并在pH5.0、75℃下孵育反应器持续TM24小时。在这之后，添加另外的Accellerase 1000以使最终酶负载相对于甘蔗渣中的葡聚糖为2％w/w。然后将反应在50℃下孵育24小时。如实施例1中所描述，在48小时的反应时间末期测量可溶性糖类。结果显示于表7中。

[0342] 表7

[0343]

[0344] 如表7中所见，当将2％AccelleraseTM1000单独用于200g/l甘蔗渣时，获得了25g/l的葡萄糖产量(实验2)。然而当使用0.25％SavO+1.75％AccelleraseTM1000时，获得了40g/l的产量(实验1)。因此添加SavO导致了产量的60％增加。

[0345] 实施例13

[0346] 测定CBH2活性的分析型方法

[0347] 利用纤维素测定可检验样品的CBH2活性，其中将微晶纤维素(例如，Avicel；来自Sigma)用作底物。在150μL的总体积中，将60μL澄清的样品溶液(其可包含CBH2酶)添加到含200g/L Avicel的100-250mM醋酸钠缓冲液(pH 3-6)中。将反应在50-70℃下孵育24小时。用50％的乙腈猝灭生物转化。离心反应混合物，收集上清液(150μl)并通过0.45μm过滤器来过滤。通过HPLC测量Avicel到可溶性糖类寡聚物的转化。例如，利用装备有HPX-87H离子排阻柱(300mm x 7.8mm)的Agilent HPLC 1200，使用65℃下0.6mL/分钟流速的5mM的H2SO4，纤维二糖和葡萄糖的典型保留时间分别为7.5分钟和9.1分钟。

[0348] 实施例14

[0349] 测量β-葡糖苷酶活性

[0350] β-葡糖苷酶活性的测定是熟知的并包括pNPG和纤维二糖测定。在一个示例性的pNPG测定中，在100μL的总体积中，在pH6.5下将包含β-葡糖苷酶的20μL澄清的培养基上清液添加到在50mM磷酸钠缓冲液中4mM的pNPG(Sigma-Aldrich，Inc.St.Louis，MO)溶液。在pH 6.5、45℃下将反应孵育1小时。用100μL的1M碳酸钠pH11溶液猝灭反应混合物。在405nm处测量溶液的吸光度以测定pNPG到对硝基苯酚的转化。在405nm处测量对硝基苯酚的释放(ε＝17,700M-1cm-1)以计算β-葡糖苷酶活性。在高通量筛查条件下(pH 7，50℃)观察到了可检测的β-葡糖苷酶活性。参见Breves等人.，1997，Appl.Environmental Microbiol.63：3902，在此通过引用并入。

[0351] 可选地，可利用使用纤维二糖作为底物的测定来测定β-葡糖苷酶活性。在100μL的总体积中，将包含β-葡糖苷酶的25μL澄清的培养基上清液添加到含10g/L纤维二糖(Fluka目录号22150，Sigma-Aldrich，Inc.，St.Louis、MO)的100mM磷酸钠缓冲液中(pH 6-7)或醋酸钠缓冲液(pH 5-5.5)中。将反应在45-70℃下孵育适当的时间(根据酶浓度的不同，25分钟至过夜)伴随摇动。利用酶促葡萄糖测定(K-GLUC，Megazyme，Ireland)测定葡萄糖产生。将10μl的每种反应添加到190μl的GOPOD试剂中(作为K-GLUC测定试剂盒的部分来提供)。将反应在45℃下孵育20分钟，并在510nm下测量溶液的吸光度。
GOPOD试剂包含50mM磷酸钾缓冲液pH7.4、0.011M对羟基苯甲酸、0.008％w/v叠氮化钠、葡糖氧化酶(＞12,000U/L)、过氧化物酶(＞650U/L)和80mg/L 4-氨基安替比林。试剂中的葡糖氧化酶与样品中存在的任何葡萄糖反应并产生过氧化氢，过氧化氢然后与4-氨基安替比林反应产生与存在的葡萄糖的量成比例的醌亚胺染料，其可在510nm处用分光光度计法来测量。

[0352] 序列ID表

[0353] <110>杨劼

[0354] 安德鲁·肖

[0355] 伊什·库马尔·达万

[0356] 奥诺拉托·坎波皮亚诺

[0357] 克丽帕·拉奥

[0358] <130>026501-002810PC

[0359] <140>WO尚未分配

[0360] <141>尚未分配

[0361] <150>US 61/165,312

[0362] <151>2009-03-31

[0363] <160>16

[0364] <170>FastSEQ for Windows Version 4.0

[0365] <210>1

[0366] <211>222

[0367] <212>PRT

[0368] <213>人工序列

[0369] <220>

[0370] <223>合成的野生型除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)内切葡聚糖酶催化结构域

[0371] <400>1

[0372] Asp Thr Ser Ile Cys Glu Pro Phe Gly Ser Thr Thr Ile Gln Gly Arg[0373] 1 5 10 15

[0374] Tyr Val Val G1n Asn Asn Arg Trp Gly Thr Ser Glu Ala G1n Cys Ile[0375] 20 25 30

[0376] Thr Ala Thr Asp Ser Gly Phe Arg Ile Thr Gln Ala Asp Gly Ser Val[0377] 35 40 45

[0378] Pro Thr Asn Gly Ala Pro Lys Ser Tyr Pro Ser Val Tyr Asn Gly Cys[0379] 50 55 60

[0380] His Tyr Thr Asn Cys Ser Pro Gly Thr Ser Leu Pro Ala Gln Leu Ser[0381] 65 70 75 80

[0382] Thr Val Ser Ser Ala Pro Thr Ser Ile Ser Tyr Ser Tyr Val Ser Asn[0383] 85 90 95

[0384] Ala Met Tyr Asp Ala Ala Tyr Asp Ile Trp Leu Asp Pro Thr Pro Arg[0385] 100 105 110

[0386] Thr Asp Gly Val Asn Arg Thr Glu Ile Met Val Trp Phe Asn Lys Val[0387] 115 120 125

[0388] Gly Ser Val Gln Pro Val Gly Ser Gln Val Gly Thr Ala Thr Val Ala[0389] 130 135 140

[0390] Gly Arg Gln Trp Gln Val Trp Ser Gly Asn Asn Gly Ser Asn Asp Val[0391] 145 150 155 160[0392] Leu Ser Phe Val Ala Pro Ser Ala Ile Thr Ser Trp Ser Phe Asp Val[0393] 165 170 175

[0394] Met Asp Phe Val Arg Gln Ala Val Ser Arg Gly Leu Ala Gln Asn Ser[0395] 180 185 190

[0396] Trp Tyr Leu Thr Ser Val Gln Ala Gly Phe Glu Pro Trp Gln Asn Gly[0397] 195 200 205

[0398] Ala Gly Leu Ala Val Thr Ser Phe Ser Ser Thr Val Asn Thr

[0399] 210 215 220

[0400] <210>2

[0401] <211>226

[0402] <212>PRT

[0403] <213>人工序列

[0404] <220>

[0405] <223>具有N-末端DTSM间隔子的合成的野生型除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)内切葡聚糖酶催化结构域

[0406] <400>2

[0407] Asp Thr Ser Met Asp Thr Ser Ile Cys Glu Pro Phe Gly Ser Thr Thr[0408] 1 5 10 15

[0409] Ile Gln Gly Arg Tyr Val Val Gln Asn Asn Arg Trp Gly Thr Ser Glu[0410] 20 25 30

[0411] Ala Gln Cys Ile Thr Ala Thr Asp Ser Gly Phe Arg Ile Thr Gln Ala[0412] 35 40 45

[0413] Asp Gly Ser Val Pro Thr Asn Gly Ala Pro Lys Ser Tyr Pro Ser Val[0414] 50 55 60

[0415] Tyr Asn Gly Cys His Tyr Thr Asn Cys Ser Pro Gly Thr Ser Leu Pro[0416] 65 70 75 80

[0417] Ala Gln Leu Ser Thr Val Ser Ser Ala Pro Thr Ser Ile Ser Tyr Ser[0418] 85 90 95

[0419] Tyr Val Ser Asn Ala Met Tyr Asp Ala Ala Tyr Asp Ile Trp Leu Asp[0420] 100 105 110

[0421] Pro Thr Pro Arg Thr Asp Gly Val Asn Arg Thr Glu Ile Met Val Trp[0422] 115 120 125

[0423] Phe Asn Lys Val Gly Ser Val Gln Pro Val Gly Ser Gln Val Gly Thr[0424] 130 135 140

[0425] Ala Thr Val Ala Gly Arg Gln Trp Gln Val Trp Ser Gly Asn Asn Gly[0426] 145 150 155 160[0427] Ser Asn Asp Val Leu Ser Phe Val Ala Pro Ser Ala Ile Thr Ser Trp[0428] 165 170 175

[0429] Ser Phe Asp Val Met Asp Phe Val Arg Gln Ala Val Ser Arg Gly Leu[0430] 180 185 190

[0431] Ala Gln Asn Ser Trp Tyr Leu Thr Ser Val Gln Ala Gly Phe Glu Pro[0432] 195 200 205

[0433] Trp Gln Asn Gly Ala Gly Leu Ala Val Thr Ser Phe Ser Ser Thr Val[0434] 210 215 220

[0435] Asn Thr

[0436] 225

[0437] <210>3

[0438] <211>375

[0439] <212>PRT

[0440] <213>除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)

[0441] <220>

[0442] <223>野生型除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)菌株MA-4680

[0443] β-1，4-内切葡聚糖酶、β-1，4-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，

[0444] 基因座SAV_555，celA1，内切葡聚糖酶

[0445] <400>3

[0446] Met Arg Pro Ser Pro Pro His Ala Arg Ser Ala Arg Gly Leu Phe Gly[0447] 1 5 10 15

[0448] Ala Leu Leu Thr Ala Leu Val Ser Leu Ala Ala Leu Leu Thr Thr Ala[0449] 20 25 30

[0450] Ser Val Ala Gln Ala Asp Thr Ser Ile Cys Glu Pro Phe Gly Ser Thr[0451] 35 40 45

[0452] Thr Ile Gln Gly Arg Tyr Val Val Gln Asn Asn Arg Trp Gly Thr Ser[0453] 50 55 60

[0454] Glu Ala Gln Cys Ile Thr Ala Thr Asp Ser Gly Phe Arg Ile Thr Gln[0455] 65 70 75 80

[0456] Ala Asp Gly Ser Val Pro Thr Asn Gly Ala Pro Lys Ser Tyr Pro Ser[0457] 85 90 95

[0458] Val Tyr Asn Gly Cys His Tyr Thr Asn Cys Ser Pro Gly Thr Ser Leu[0459] 100 105 110

[0460] Pro Ala Gln Leu Ser Thr Val Ser Ser Ala Pro Thr Ser Ile Ser Tyr[0461] 115 120 125

[0462] Ser Tyr Val Ser Asn Ala Met Tyr Asp Ala Ala Tyr Asp Ile Trp Leu[0463] 130 135 140

[0464] Asp Pro Thr Pro Arg Thr Asp Gly Val Asn Arg Thr Glu Ile Met Val[0465] 145 150 155 160[0466] Trp Phe Asn Lys Val Gly Ser Val Gln Pro Val Gly Ser Gln Val Gly[0467] 165 170 175

[0468] Thr Ala Thr Val Ala Gly Arg Gln Trp Gln Val Trp Ser Gly Asn Asn[0469] 180 185 190

[0470] Gly Ser Asn Asp Val Leu Ser Phe Val Ala Pro Ser Ala Ile Thr Ser[0471] 195 200 205

[0472] Trp Ser Phe Asp Val Met Asp Phe Val Arg Gln Ala Val Ser Arg Gly[0473] 210 215 220

[0474] Leu Ala Gln Asn Ser Trp Tyr Leu Thr Ser Val Gln Ala Gly Phe Glu[0475] 225 230 235 240[0476] Pro Trp Gln Asn Gly Ala Gly Leu Ala Val Thr Ser Phe Ser Ser Thr[0477] 245 250 255

[0478] Val Asn Thr Gly Gly Gly Asn Pro Gly Asp Pro Gly Ser Pro Thr Ala[0479] 260 265 270

[0480] Cys Lys Val Ala Tyr Ala Thr Asn Val Trp Gln Gly Gly Phe Thr Ala[0481] 275 280 285

[0482] Asp Val Thr Val Thr Asn Thr Gly Ser Ser Pro Val Asn Gly Trp Lys[0483] 290 295 300

[0484] Leu Ala Phe Thr Leu Pro Ala Gly Gln Gln Ile Thr Ser Ser Trp Ser[0485] 305 310 315 320[0486] Ala Gly Val Ser Pro Ser Ser Gly Ala Val Thr Ala Ser Ser Leu Ala[0487] 325 330 335

[0488] Tyr Asn Ala Gln Ile Ala Thr Gly Gly Arg Val Ser Phe Gly Phe Gln[0489] 340 345 350

[0490] Gly Ser Tyr Ser Gly Thr Phe Ala Ala Pro Ala Gly Phe Ser Leu Asn[0491] 355 360 365

[0492] Gly Ala Ala Cys Thr Thr Ala

[0493] 370 375

[0494] <210>4

[0495] <211>1017

[0496] <212>DNA

[0497] <213>人工序列

[0498] <220>

[0499] <223>合成的密码子优化的除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)内切葡聚糖酶

[0500] <400>4

[0501] gatacttcta tttgtgaacc atttggatct actacaatcc aaggacgcta tgtagtacag 60[0502] aataatcgtt ggggcacaag tgaagctcaa tgtataacag caaccgattc aggattccgc 120[0503] attacccaag cggatggttc tgtaccaacg aatggtgctc ctaaatctta tccaagtgtc 180[0504] tataacggat gtcattatac aaattgctct cctgggacgt cgcttccagc ccaattatca 240[0505] acagtttcat ctgctccaac atctattagt tattcttacg tgtcaaatgc catgtatgat 300[0506] gccgcgtacg acatttggtt agatccaaca ccgcgcacag atggtgtaaa tcgaacagaa 360[0507] atcatggtgt ggtttaataa agtaggcagc gtgcagccag taggatctca agtaggtacg 420[0508] gctacggtgg caggccgaca atggcaggtt tggtcaggaa ataacggatc taatgatgtg 480[0509] cttagtttcg tagctccaag tgccattact tcatggtctt ttgatgtaat ggactttgtt 540[0510] cgtcaagccg ttagtcgcgg attagctcaa aactcttggt atttgacatc tgtccaagct 600[0511] ggatttgaac cgtggcagaa tggcgctgga ctagcagtaa cttctttttc gtctacggta 660[0512] aacactggag gcggcaatcc aggagatccg ggatctccta ctgcttgcaa agttgcttat 720[0513] gcaacgaatg tttggcaagg tggatttacg gctgacgtaa ctgtaacgaa tacagggtcc 780[0514] tcacctgtca atggatggaa acttgctttt acgttaccag caggccaaca aattacttcg 840[0515] tcttggtcag caggagtatc tccgtcatct ggagcagtga cagcttctag ccttgcatac 900[0516] aatgcacaaa ttgcaaccgg gggacgtgta tcatttggat ttcaaggtag ttattctggc 960[0517] acatttgcag cacctgcagg tttttcttta aatggggctg cttgcacaac ggcatga 1017[0518] <210>5

[0519] <211>1029

[0520] <212>DNA

[0521] <213>人工序列

[0522] <220>

[0523] <223>具有N-末端DTSM间隔子的合成的密码子优化的除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)内切葡聚糖酶

[0524] <400>5

[0525] gatactagta tggatacttc tatttgtgaa ccatttggat ctactacaat ccaaggacgc 60[0526] tatgtagtac agaataatcg ttggggcaca agtgaagctc aatgtataac agcaaccgat 120[0527] tcaggattcc gcattaccca agcggatggt tctgtaccaa cgaatggtgc tcctaaatct 180[0528] tatccaagtg tctataacgg atgtcattat acaaattgct ctcctgggac gtcgcttcca 240[0529] gcccaattat caacagtttc atctgctcca acatctatta gttattctta cgtgtcaaat 300[0530] gccatgtatg atgccgcgta cgacatttgg ttagatccaa caccgcgcac agatggtgta 360[0531] aatcgaacag aaatcatggt gtggtttaat aaagtaggca gcgtgcagcc agtaggatct 420[0532] caagtaggta cggctacggt ggcaggccga caatggcagg tttggtcagg aaataacgga 480[0533] tctaatgatg tgcttagttt cgtagctcca agtgccatta cttcatggtc ttttgatgta 540[0534] atggactttg ttcgtcaagc cgttagtcgc ggattagctc aaaactcttg gtatttgaca 600[0535] tctgtccaag ctggatttga accgtggcag aatggcgctg gactagcagt aacttctttt 660[0536] tcgtctacgg taaacactgg aggcggcaat ccaggagatc cgggatctcc tactgcttgc 720[0537] aaagttgctt atgcaacgaa tgtttggcaa ggtggattta cggctgacgt aactgtaacg 780[0538] aatacagggt cctcacctgt caatggatgg aaacttgctt ttacgttacc agcaggccaa 840[0539] caaattactt cgtcttggtc agcaggagta tctccgtcat ctggagcagt gacagcttct 900[0540] agccttgcat acaatgcaca aattgcaacc gggggacgtg tatcatttgg atttcaaggt 960[0541] agttattctg gcacatttgc agcacctgca ggtttttctt taaatggggc tgcttgcaca 1020[0542] acggcatga 1029[0543] <210>6

[0544] <211>222

[0545] <212>PRT

[0546] <213>人工序列

[0547] <220>

[0548] <223>合成的除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)内切葡聚糖酶变体[0549] <400>6

[0550] Asp Thr Ser Ile Cys Glu Pro Phe Gly Ser Thr Thr Ile Gln Gly Arg[0551] 1 5 10 15

[0552] Tyr Val Val Gln Asn Asn Arg Trp Gly Thr Ser Glu Pro Gln Cys Ile[0553] 20 25 30

[0554] Thr Ala Thr Asp Ser Gly Phe Arg Ile Thr Gln Ala Asp Gly Ser Val[0555] 35 40 45

[0556] Pro Thr Asn Gly Pro Pro Lys Ser Tyr Pro Ser Val Tyr Asn Gly Cys[0557] 50 55 60

[0558] His Tyr Thr Asn Cys Ser Pro Gly Thr Pro Leu Pro Ala Gln Leu Ser[0559] 65 70 75 80

[0560] Thr Val Ser Ser Ala Pro Thr Ser Ile Ser Tyr Ser Tyr Val Ser Asn[0561] 85 90 95

[0562] Ala Met Tyr Asp Ala Ala Tyr Asp Ile Trp Leu Asp Pro Thr Pro Arg[0563] 100 105 110

[0564] Thr Asp Gly Val Asn Arg Thr Glu Ile Met Val Trp Phe Asn Lys Val[0565] 115 120 125

[0566] Gly Ser Val Gln Pro Val Gly Ser Gln Val Gly Thr Ala Thr Val Ala[0567] 130 135 140

[0568] Gly Arg Gln Trp Gln Val Trp Ser Gly Asn Asn Gly Ser Asn Asp Val[0569] 145 150 155 160[0570] Leu Ser Phe Val Ala Pro Ser Ala Ile Thr Ser Trp Ser Phe Asp Val[0571] 165 170 175

[0572] Met Asp Phe Val Arg Gln Ala Val Ser Arg Gly Leu Ala Gln Pro Ser[0573] 180 185 190

[0574] Trp Tyr Leu Thr Ser Val Gln Ala Gly Phe Glu Pro Trp Gln Asn Gly[0575] 195 200 205

[0576] Ala Gly Leu Ala Val Thr Ser Phe Ser Ser Thr Val Asn Thr

[0577] 210 215 220

[0578] <210>7

[0579] <211>222

[0580] <212>PRT

[0581] <213>人工序列

[0582] <220>

[0583] <223>合成的除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)内切葡聚糖酶变体[0584] <400>7

[0585] Asp Thr Ser Ile Cys Glu Pro Phe Gly Trp Thr Thr Ile Gln Gly Arg[0586] 1 5 10 15

[0587] Tyr Val Val Gln Asn Asn Arg Trp Gly Thr Ser Glu Pro Gln Cys Ile[0588] 20 25 30

[0589] Thr Ala Thr Asp Ser Gly Phe Arg Ile Thr Arg Ala Asp Gly Ser Val[0590] 35 40 45

[0591] Pro Thr Asn Gly Pro Pro Lys Ser Tyr Pro Ser Val Tyr Asn Gly Cys[0592] 50 55 60

[0593] His Tyr Thr Asn Cys Ser Pro Gly Thr Pro Leu Pro Ala Gln Leu Ser[0594] 65 70 75 80

[0595] Thr Ile Ser Ser Ala Pro Thr Ser Ile Ser Tyr Ser Tyr Val Ser Asn[0596] 85 90 95

[0597] Ala Val Tyr Asp Ala Ala Tyr Asp Ile Trp Leu Asp Pro Thr Pro Arg[0598] 100 105 110

[0599] Thr Asp Gly Val Asn Arg Thr Glu Ile Met Val Trp Phe Asn Lys Val[0600] 115 120 125

[0601] Gly Ser Val Gln Pro Val Gly Ser Gln Val Gly Thr Ala Thr Val Ala[0602] 130 135 140

[0603] Gly Arg Gln Trp Gln Val Trp Ser Gly Asn Asn Gly Ser Asn Asp Val[0604] 145 150 155 160[0605] Leu Ser Phe Val Ala Pro Ser Ala Ile Thr Ser Trp Ser Phe Asp Val[0606] 165 170 175

[0607] Met Asp Phe Val Arg Gln Ala Val Ser Arg Gly Leu Ala Gln Pro Ser[0608] 180 185 190

[0609] Trp Tyr Leu Thr Ser Val Gln Ala Gly Phe Glu Pro Trp Gln Asn Gly[0610] 195 200 205

[0611] Ala Gly Leu Ala Val Thr Ser Phe Ser Ser Thr Val Asn Thr

[0612] 210 215 220

[0613] <210>8

[0614] <211>222

[0615] <212>PRT

[0616] <213>人工序列

[0617] <220>

[0618] <223>合成的除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)内切葡聚糖酶变体[0619] <400>8

[0620] Asp Thr Ser Ile Cys Glu Pro Phe Gly Trp Thr Val Ile Gln Gly Arg[0621] 1 5 10 15

[0622] Tyr Val Val Gln Asn Asn Arg Trp Gly Thr Ser Glu Pro Gln Cys Ile[0623] 20 25 30

[0624] Thr Ala Thr Asp Ser Gly Phe Arg Ile Thr Arg Ala Asp Gly Ser Lys[0625] 35 40 45

[0626] Pro Thr Asn Gly Pro Pro Lys Ser Tyr Pro Ser Val Tyr Asn Gly Cys[0627] 50 55 60

[0628] His Tyr Thr Ile Cys Ser Pro Gly Thr Pro Leu Pro Ala Gln Ile Ser[0629] 65 70 75 80

[0630] Lys Ile Ser Ser Ala Pro Thr Ser Ile Ser Tyr Ser Tyr Val Ser Asn[0631] 85 90 95

[0632] Ala Val Tyr Asp Ala Ala Tyr Asp Ile Trp Leu Asp Pro Thr Pro Arg[0633] 100 105 110

[0634] Thr Asp Gly Val Asn Arg Thr Glu Ile Met Val Trp Phe Asn Lys Val[0635] 115 120 125

[0636] Gly Ser Val Gln Pro Val Gly Ser Gln Val Gly Thr Ala Thr Val Ala[0637] 130 135 140

[0638] Gly Arg Gln Trp Gln Val Trp Met Gly Asn Asn Gly Ser Asn Asp Val[0639] 145 150 155 160[0640] Leu Ser Phe Val Ala Pro Ser Ala Ile Thr Ser Trp Ser Phe Asp Val[0641] 165 170 175

[0642] Met Asp Phe Val Arg Gln Ala Val Gln Arg Gly Leu Ala Gln Pro Ser[0643] 180 185 190

[0644] Trp Tyr Leu Thr Ser Val Gln Ala Gly Phe Glu Pro Trp Glu Asn Gly[0645] 195 200 205

[0646] Ala Gly Leu Ala Val Thr Ser Phe Ser Ser Thr Val Asn Thr

[0647] 210 215 220

[0648] <210>9

[0649] <211>29

[0650] <212>PRT

[0651] <213>人工序列

[0652] <220>

[0653] <223>合成的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)信号肽

[0654] <400>9

[0655] Met Lys Arg Ile Val Met Val Gly Phe Ile Leu Leu Phe Pro Leu Asn[0656] 1 5 10 15

[0657] Met Leu Ala Gly Pro Ile Ser Ser Ile Ala Glu Ala Gln

[0658] 20 25

[0659] <210>10

[0660] <211>254

[0661] <212>PRT

[0662] <213>人工序列

[0663] <220>

[0664] <223>具有巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)信号肽、三肽间隔子TSM和除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)内切葡聚糖酶的合成的构建体

[0665] <400>10

[0666] Met Lys Arg Ile Val Met Val Gly Phe Ile Leu Leu Phe Pro Leu Asn[0667] 1 5 10 15

[0668] Met Leu Ala Gly Pro Ile Ser Ser Ile Ala Glu Ala Gln Thr Ser Met[0669] 20 25 30

[0670] Asp Thr Ser Ile Cys Glu Pro Phe Gly Trp Thr Val Ile Gln Gly Arg[0671] 35 40 45

[0672] Tyr Val Val Gln Asn Asn Arg Trp Gly Thr Ser Glu Pro Gln Cys Ile[0673] 50 55 60

[0674] Thr Ala Thr Asp Ser Gly Phe Arg Ile Thr Arg Ala Asp Gly Ser Lys[0675] 65 70 75 80

[0676] Pro Thr Asn Gly Pro Pro Lys Ser Tyr Pro Ser Val Tyr Asn Gly Cys[0677] 85 90 95

[0678] His Tyr Thr Ile Cys Ser Pro Gly Thr Pro Leu Pro Ala Gln Ile Ser[0679] 100 105 110

[0680] Lys Ile Ser Ser Ala Pro Thr Ser Ile Ser Tyr Ser Tyr Val Ser Asn[0681] 115 120 125

[0682] Ala Val Tyr Asp Ala Ala Tyr Asp Ile Trp Leu Asp Pro Thr Pro Arg[0683] 130 135 140

[0684] Thr Asp Gly Val Asn Arg Thr Glu Ile Met Val Trp Phe Asn Lys Val[0685] 145 150 155 160[0686] Gly Ser Val Gln Pro Val Gly Ser Gln Val Gly Thr Ala Thr Val Ala[0687] 165 170 175

[0688] Gly Arg Gln Trp Gln Val Trp Met Gly Asn Asn Gly Ser Asn Asp Val[0689] 180 185 190

[0690] Leu Ser Phe Val Ala Pro Ser Ala Ile Thr Ser Trp Ser Phe Asp Val[0691] 195 200 205

[0692] Met Asp Phe Val Arg Gln Ala Val Gln Arg Gly Leu Ala Gln Pro Ser[0693] 210 215 220

[0694] Trp Tyr Leu Thr Ser Val Gln Ala Gly Phe Glu Pro Trp Glu Asn Gly[0695] 225 230 235 240[0696] Ala Gly Leu Ala Val Thr Ser Phe Ser Ser Thr Val Asn Thr

[0697] 245 250

[0698] <210>11

[0699] <211>218

[0700] <212>PRT

[0701] <213>人工序列

[0702] <220>

[0703] <223>合成的施韦尼兹肉座菌(Hypocrea schweinitzii)内切葡聚糖酶Cel12催化结构域

[0704] <400>11

[0705] Gln Thr Ser Cys Asp Gln Tyr Ala Thr Phe Ser Gly Asn Gly Tyr Ile[0706] 1 5 10 15

[0707] Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Phe Gly Cys[0708] 20 25 30

[0709] Val Thr Ser Val Ser Leu Asn Gly Ala Ala Ser Trp His Ala Asp Trp[0710] 35 40 45

[0711] Gln Trp Ser Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Gln Asn Val Gln[0712] 50 55 60

[0713] Ile Asn Ile Pro Gln Lys Arg Thr Val Asn Ser Ile Gly Ser Met Pro[0714] 65 70 75 80

[0715] Thr Thr Ala Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Asp Ile Arg Ala Asn Val[0716] 85 90 95

[0717] Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Pro Asn His Val Thr Tyr Ser[0718] 100 105 110

[0719] Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asp Ile Gly[0720] 115 120 125

[0721] Pro Ile Gly Ser Ser Gln Gly Thr Val Asn Val Gly Gly Gln Thr Trp[0722] 130 135 140

[0723] Thr Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Met Gln Val Tyr Ser Phe Val[0724] 145 150 155 160[0725] Ala Gln Ser Asn Thr Thr Ser Tyr Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe Phe[0726] 165 170 175

[0727] Asn Tyr Leu Arg Asp Asn Lys Gly Tyr Asn Ala Gly Gly Gln Tyr Val[0728] 180 185 190

[0729] Leu Ser Tyr Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr Leu[0730] 195 200 205

[0731] Asn Val Ala Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn

[0732] 210 215

[0733] <210>12

[0734] <211>227

[0735] <212>PRT

[0736] <213>人工序列

[0737] <220>

[0738] <223>合成的海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)内切葡聚糖酶Cel12催化结构域

[0739] <400>12

[0740] Thr Val Glu Leu Cys Gly Arg Trp Asp Ala Arg Asp Val Ala Gly Gly[0741] 1 5 10 15

[0742] Arg Tyr Arg Val Ile Asn Asn Val Trp Gly Ala Glu Thr Ala Gln Cys[0743] 20 25 30

[0744] Ile Glu Val Gly Leu Glu Thr Gly Asn Phe Thr Ile Thr Arg Ala Asp[0745] 35 40 45

[0746] His Asp Asn Gly Asn Asn Val Ala Ala Tyr Pro Ala Ile Tyr Phe Gly[0747] 50 55 60

[0748] Cys His Trp Gly Ala Cys Thr Ser Asn Ser Gly Leu Pro Arg Arg Val[0749] 65 70 75 80

[0750] Gln Glu Leu Ser Asp Val Arg Thr Ser Trp Thr Leu Thr Pro Ile Thr[0751] 85 90 95

[0752] Thr Gly Arg Trp Asn Ala Ala Tyr Asp Ile Trp Phe Ser Pro Val Thr[0753] 100 105 110

[0754] Asn Ser Gly Asn Gly Tyr Ser Gly Gly Ala Glu Leu Met Ile Trp Leu[0755] 115 120 125

[0756] Asn Trp Asn Gly Gly Val Met Pro Gly Gly Ser Arg Val Ala Thr Val[0757] 130 135 140

[0758] Glu Leu Ala Gly Ala Thr Trp Glu Val Trp Tyr Ala Asp Trp Asp Trp[0759] 145 150 155 160[0760] Asn Tyr Ile Ala Tyr Arg Arg Thr Thr Pro Thr Thr Ser Val Ser Glu[0761] 165 170 175

[0762] Leu Asp Leu Lys Ala Phe Ile Asp Asp Ala Val Ala Arg Gly Tyr Ile[0763] 180 185 190

[0764] Arg Pro Glu Trp Tyr Leu His Ala Val Glu Thr Gly Phe Glu Leu Trp[0765] 195 200 205

[0766] Glu Gly Gly Ala Gly Leu Arg Ser Ala Asp Phe Ser Val Thr Val Gln[0767] 210 215 220

[0768] Lys Leu Ala

[0769] 225

[0770] <210>13

[0771] <211>222

[0772] <212>PRT

[0773] <213>人工序列

[0774] <220>

[0775] <223>合成的链霉菌Streptomyces sp.11AG8内切葡聚糖酶Cel12催化结构域[0776] <400>13

[0777] Asn Gln Gln Ile Cys Asp Arg Tyr Gly Thr Thr Thr Ile Gln Asp Arg[0778] 1 5 10 15

[0779] Tyr Val Val Gln Asn Asn Arg Trp Gly Thr Ser Ala Thr Gln Cys Ile[0780] 20 25 30

[0781] Asn Val Thr Gly Asn Gly Phe Glu Ile Thr Gln Ala Asp Gly Ser Val[0782] 35 40 45

[0783] Pro Thr Asn Gly Ala Pro Lys Ser Tyr Pro Ser Val Tyr Asp Gly Cys[0784] 50 55 60

[0785] His Tyr Gly Asn Cys Ala Pro Arg Thr Thr Leu Pro Met Arg Ile Ser[0786] 65 70 75 80

[0787] Ser Ile Gly Ser Ala Pro Ser Ser Val Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Asn[0788] 85 90 95

[0789] Gly Val Tyr Asn Ala Ala Tyr Asp Ile Trp Leu Asp Pro Thr Pro Arg[0790] 100 105 110

[0791] Thr Asn Gly Val Asn Arg Thr Glu Ile Met Ile Trp Phe Asn Arg Val[0792] 115 120 125

[0793] Gly Pro Val Gln Pro Ile Gly Ser Pro Val Gly Thr Ala His Val Gly[0794] 130 135 140

[0795] Gly Arg Ser Trp Glu Val Trp Thr Gly Ser Asn Gly Ser Asn Asp Val[0796] 145 150 155 160[0797] Ile Ser Phe Leu Ala Pro Ser Ala Ile Ser Ser Trp Ser Phe Asp Val[0798] 165 170 175

[0799] Lys Asp Phe Val Asp Gln Ala Val Ser His Gly Leu Ala Thr Pro Asp[0800] 180 185 190

[0801] Trp Tyr Leu Thr Ser Ile Gln Ala Gly Phe Glu Pro Trp Glu Gly Gly[0802] 195 200 205

[0803] Thr Gly Leu Ala Val Asn Ser Phe Ser Ser Ala Val Asn Ala

[0804] 210 215 220

[0805] <210>14

[0806] <211>222

[0807] <212>PRT

[0808] <213>人工序列

[0809] <220>

[0810] <223>合成的浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)内切葡聚糖酶Cel12催化结构域

[0811] <400>14

[0812] Asp Thr Thr Ile Cys Glu Pro Phe Gly Thr Thr Thr Ile Gln Gly Arg[0813] 1 5 10 15

[0814] Tyr Val Val Gln Asn Asn Arg Trp Gly Ser Thr Ala Pro Gln Cys Val[0815] 20 25 30

[0816] Thr Ala Thr Asp Thr Gly Phe Arg Val Thr Gln Ala Asp Gly Ser Ala[0817] 35 40 45

[0818] Pro Thr Asn Gly Ala Pro Lys Ser Tyr Pro Ser Val Phe Asn Gly Cys[0819] 50 55 60

[0820] His Tyr Thr Asn Cys Ser Pro Gly Thr Asp Leu Pro Val Arg Leu Asp[0821] 65 70 75 80

[0822] Thr Val Ser Ala Ala Pro Ser Ser Ile Ser Tyr Gly Phe Val Asp Gly[0823] 85 90 95

[0824] Ala Val Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp Ile Trp Leu Asp Pro Thr Ala Arg[0825] 100 105 110

[0826] Thr Asp Gly Val Asn Gln Thr Glu Ile Met Ile Trp Phe Asn Arg Val[0827] 115 120 125

[0828] Gly Pro Ile Gln Pro Ile Gly Ser Pro Val Gly Thr Ala Ser Val Gly[0829] 130 135 140

[0830] Gly Arg Thr Trp Glu Val Trp Ser Gly Gly Asn Gly Ser Asn Asp Val[0831] 145 150 155 160[0832] Leu Ser Phe Val Ala Pro Ser Ala Ile Ser Gly Trp Ser Phe Asp Val[0833] 165 170 175

[0834] Met Asp Phe Val Arg Ala Thr Val Ala Arg Gly Leu Ala Glu Asn Asp[0835] 180 185 190

[0836] Trp Tyr Leu Thr Ser Val Gln Ala Gly Phe Glu Pro Trp Gln Asn Gly[0837] 195 200 205

[0838] Ala Gly Leu Ala Val Asn Ser Phe Ser Ser Thr Val Glu Thr

[0839] 210 215 220

[0840] <210>15

[0841] <211>218

[0842] <212>PRT

[0843] <213>人工序列

[0844] <220>

[0845] <223>合成的里氏木霉(Trichoderma reesei)内切葡聚糖酶Cel12催化结构域[0846] <400>15

[0847] Gln Thr Ser Cys Asp Gln Trp Ala Thr Phe Thr Gly Asn Gly Tyr Thr[0848] 1 5 10 15

[0849] Val Ser Asn Asn Leu Trp Gly Ala Ser Ala Gly Ser Gly Phe Gly Cys[0850] 20 25 30

[0851] Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Gly Gly Ala Ser Trp His Ala Asp Trp[0852] 35 40 45

[0853] Gln Trp Ser Gly Gly Gln Asn Asn Val Lys Ser Tyr Gln Asn Ser Gln[0854] 50 55 60

[0855] Ile Ala Ile Pro Gln Lys Arg Thr Val Asn Ser Ile Ser Ser Met Pro[0856] 65 70 75 80

[0857] Thr Thr Ala Ser Trp Ser Tyr Ser Gly Ser Asn Ile Arg Ala Asn Val[0858] 85 90 95

[0859] Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Ala Asn Pro Asn His Val Thr Tyr Ser[0860] 100 105 110

[0861] Gly Asp Tyr Glu Leu Met Ile Trp Leu Gly Lys Tyr Gly Asp Ile Gly[0862] 115 120 125

[0863] Pro Ile Gly Ser Ser Gln Gly Thr Val Asn Val Gly Gly Gln Ser Trp[0864] 130 135 140

[0865] Thr Leu Tyr Tyr Gly Tyr Asn Gly Ala Met Gln Val Tyr Ser Phe Val[0866] 145 150 155 160[0867] Ala Gln Thr Asn Thr Thr Asn Tyr Ser Gly Asp Val Lys Asn Phe Phe[0868] 165 170 175

[0869] Asn Tyr Leu Arg Asp Asn Lys Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Gln Tyr Val[0870] 180 185 190

[0871] Leu Ser Tyr Gln Phe Gly Thr Glu Pro Phe Thr Gly Ser Gly Thr Leu[0872] 195 200 205

[0873] Asn Val Ala Ser Trp Thr Ala Ser Ile Asn

[0874] 210 215

[0875] <210>16

[0876] <211>4

[0877] <212>PRT

[0878] <213>人工序列

[0879] <220>

[0880] <223>合成的N-末端DTSM间隔子

[0881] <400>16

[0882] Asp Thr Ser Met

[0883] 1

[0884] 应理解本文所描述的实施例和实施方案仅为示例性目的，且其多种改变形式和变化形式对于本领域中的技术人员是暗示的，且包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。本文所引用的所有出版物、专利和专利申请在此以其整体通过引用并入以用于所有目的。

改良的内切葡聚糖酶转让专利

申请号 : CN201080021302.7

文献号 : CN102428170B

文献日 : 2015-03-18

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发明人 : 杨劼 , 安德鲁·肖 , 伊什·库马尔·达万 , 奥诺拉托·坎波皮亚诺 , 克丽帕·拉奥

申请人 : 科德克希思公司

摘要 :

权利要求 :

说明书 :

改良的内切葡聚糖酶