本发明具体涉及一种重瓣芍药幼胚培养的培养基配方，以及利用该培养基培养芍药种苗的方法。所述培养基包括诱导不定芽培养基、不定芽壮苗培养基、生根培养基，是在改良MS或1/2 改良MS基础上添加TDZ、蔗糖、琼脂等。所述培养方法，包括选取种胚、培养基配配制和接种培养的步骤，接种培养是用上述的3种培养基依次实施诱导不定芽、不定芽壮苗及生根步骤。本发明使未成熟胚成苗率达60%以上，克服了重瓣芍药种子因种胚发育不良不能成苗的技术障碍。每个萌动的种胚可以形成3-8个不定芽，5-10个肉质根，达到了正常种子播种苗3年才能分化苗的效果，提高了芍药种苗的生长速度，有利于芍药杂种苗早期开花，缩短芍药育种周期。
1.一组重瓣芍药幼胚培养的培养基，其特征在于包括：-1
① 诱导不定芽培养基，配方为：改良MS + TDZ 0.5～1.5 mg/L，蔗糖100g·L ,琼-1脂6g·L ，pH为5.8；
② 不定芽壮苗培养基，配方为：改良 MS + TDZ 0.01～0.05 mg/L,蔗糖30 g·L ，琼-1脂6 g·L ，pH为5.8；
③ 生根培养基，配方为：1/2 改良MS + IAA 0.5～1.0 mg/L,蔗糖30 g·L ，-1琼脂6 g·L ，活性炭0.1%，pH为5.8；
其中所述改良MS，是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO3 125 mg/L、NH4NO3 250 mg/L、MgSO4·7H2O 125 mg/L、KH2PO4 275 mg/L、CaCl2·2H2O 250 mg/L，其它微量元素、铁盐与有机成分含量不变；
改良1/2 MS是指将所述改良MS中的大量元素含量减半，其它成分不变。
2.一种重瓣芍药幼胚培养方法，包括选取种胚、培养基配制和接种培养的步骤，其特征在于所述接种培养的步骤为：① 诱导不定芽：将种胚接入诱导不定芽培养基，置于25℃ 暗培养2个月；所述诱导不-1 -1定芽培养基配方为：改良MS + TDZ 0.5～1.5 mg/L，蔗糖100g·L ,琼脂6g·L ，pH为
② 不定芽壮苗：将上述培养的不定芽转入不定芽壮苗培养基，置于 25℃，1200lx光强下培养2个月；所述不定芽壮苗培养基配方为：改良 MS + TDZ 0.01～0.05 mg/L,蔗糖-1 -1
③ 生根：将上述步骤②得到的健壮的芽转入生根培养基继续置于 25℃，1200lx光强下培养2-3个月；所述生根培养基配方为：1/2 改良MS + IAA 0.5～1.0 mg/L,蔗糖-1 -1
30 g·L ，琼脂6 g·L ，活性炭0.1%，pH为5.8；
其中所述改良MS，是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO3 125 mg/L、NH4NO3 250 mg/L、MgSO4·7H2O 125 mg/L、KH2PO4 275 mg/L、CaCl2·2H2O 250 mg/L，其它微量元素、铁盐与有机成分含量不变；
改良1/2 MS是指将所述改良MS中的大量元素含量减半，其它成分不变。
重瓣芍药幼胚培养的培养基与培养方法
技术领域
[0001] 本发明涉及植物的组织培养领域，具体涉及一种重瓣芍药幼胚培养的培养基配方，以及利用该培养基培养芍药种苗的方法。
背景技术
[0002] 我国现有的芍药优良观赏品种主要通过自然实生选种获得，有关芍药品种介绍的书籍中都未表明它们的亲本来源。虽然许多科研单位都已有目的地通过芍药亲本的选择选配开展了芍药杂交育种，但是多年来进展很慢，究其原因，这是由于芍药（Paeonia lactiflora Pall.）观赏品质中最重要的的重瓣性状是由其雌蕊或者雄蕊退化后发生瓣化变异形成，因此，利用观赏性状优良的芍药重瓣品种作父母本开展杂交育种时，很难受精结实，或虽能结实但许多种胚发育不良而不能播种出苗；根据我们的工作体验，在获得的杂交种子中，由于种子胚乳发育不充实而不能正常发芽的种子比率占70%左右，因此，提高杂交种子的成苗率是决定芍药杂交育种工作效率的关键技术。
[0003] 植物幼胚培养技术是利用现代组织培养手段将植物幼胚从种子中分离出来在离体无菌条件下发育成幼苗的技术，主要针对不能正常发育的种子进行胚拯救，这在早熟桃、杏、无籽葡萄、樱桃等作物上被成功应用。关于牡丹、芍药胚培养的工作，在程金水主编的《园林植物遗传育种学》教材第32章“牡丹芍药育种”中，李嘉钰先生指出可借鉴杂种胚培养技术提高牡丹芍药远缘杂种成苗率，但是没有引用有关文献具体说明；同样，在吕振伟的“牡丹与牡丹与芍药的育种方法”一文中也没有牡丹芍药胚培养的具体引用资料。
[0004] 关于芍药组织培养的研究已有许多工作，主要集中于利用带节间茎段、腋芽诱导丛生芽的快繁技术研究，这些研究在芍药杂交育种应用上作用不大。在周美艳(2007)的硕士学位论文“芍药组织培养及遗传转化的初步研究”中，作者开展了芍药种胚的离体培养工作，并已成苗，但是在取材方面，该研究“①、选用的品种‘粉玉奴’是单瓣品种，②、种胚为9月份的成熟种子”，这两点对于芍药育种中“①选用的品种主要为重瓣类型，②种胚发育不良，不能正常成熟”条件不一致，因此，该项研究对芍药杂交育种工作也没有直接应用价值。
发明内容
[0005] 为了解决重瓣芍药由于种胚发育不良而不能正常播种出苗的技术难题，本发明提供了一种重瓣芍药幼胚培养的培养基配方，以及利用该培养基培养芍药种苗的方法，为芍药杂交育种提供关键技术支撑。
[0006] 本发明公开了一组重瓣芍药幼胚培养的培养基，它包括：
[0007] ① 诱导不定芽培养基，配方为：改良MS + TDZ 0.5～1.5 mg/L，蔗糖100g·L-1 ,-1琼脂6g·L ，pH为5.8；
[0008] ② 不定芽壮苗培养基，配方为：改良 MS + TDZ 0.01～0.05 mg/L,蔗糖30 -1 -1g·L ，琼脂6 g·L ，pH为5.8；
[0009] ③ 生根培养基，配方为：1/2 改良MS + IAA 0.5～1.0 mg/L,蔗糖30 -1 -1g·L ，琼脂6 g·L ，活性炭0.1%，pH为5.8；
[0010] 其中所述改良MS，是将MS培养基中的大量元素含量改良为KNO3 125 mg/L、NH4NO3250 mg/L、MgSO4·7H2O 125 mg/L、KH2PO4 275 mg/L、CaCl2·2H2O 250 mg/L，其它微量元素、铁盐与有机成分含量不变；
[0011] 改良1/2 MS是指将所述改良MS中的大量元素含量减半，其它成分不变。
[0012] 本发明还公开了用上述培养基培养重瓣芍药幼胚的方法，具体步骤为：
[0013] （1）取材：7月上旬取生长健康的未成熟重瓣芍药种子，挑取种胚。
[0014] （2）培养基配方：
[0015] ① 诱导不定芽：改良MS + TDZ 0.5～1.5 mg/L，蔗糖100g·L-1 ,琼脂6g·L-1，pH为5.8。置于25℃ 暗培养2个月(附图1)；
[0016] ② 不定芽壮苗：将上述材料转入改良 MS + TDZ 0.01～0.05 mg/L,蔗糖30 -1 -1g·L ，琼脂6 g·L ，pH为5.8。置于 25℃，1200lx光强下培养2个月(附图2)；
[0017] ③ 生根：将上述健壮的芽转入1/2 改良MS + IAA 0.5～1.0 mg/L,蔗糖-1 -130 g·L ，琼脂6 g·L ，活性炭0.1%，pH为5.8。继续置于 25℃，1200lx光强下培养2-3个月(附图3)。
[0018] 效果：（1)未成熟胚成苗率达60%以上，克服了重瓣芍药种子因种胚发育不良不能成苗的技术障碍。
[0019] （2)每个萌动的种胚可以形成3-8个不定芽，5-10个肉质根，达到了正常种子播种苗3年才能分化苗的效果，提高了芍药种苗的生长速度，有利于芍药杂种苗早期开花，缩短芍药育种周期。
附图说明
[0020] 图1是伤口一侧形成丛生不定芽。
[0021] 图2是不定芽在壮苗培养基中生长情况。
[0022] 图3是幼苗生根情况。
具体实施方式
[0023] 在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0024] 下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0025] 在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
[0026] 实施例1：
[0027] 以重瓣芍药品种‘红艳争辉’为试材，开展本项研究工作：
[0028] （1）取材：7月上旬采集‘红艳争辉’果皮开始转色的荚果，用洗涤液浸泡 10 min，自来水冲洗净洗涤液，用1%浸泡20分钟后自来水冲洗干净，剥去果荚，取出种子，先用 75% 酒精表面灭菌 30 s，再用0.1 % 的升汞灭菌 8min，无菌水冲洗 5～6遍。置于无菌滤纸上，用解剖刀剖开种子，用解剖针挑出种胚。
[0029] （2）培养基配方：
[0030] ① 将种胚先接种于以下3种诱导不定芽的培养基：1）、改良MS + TDZ 0.5 mg/L，-1 -1 -1蔗糖100g·L ,琼脂6g·L ，pH为5.8；2）、改良MS + TDZ 1.0 mg/L，蔗糖100g·L ,-1 -1 -1
琼脂6g·L ，3）、改良MS + TDZ 2.0 mg/L，蔗糖100g·L ,琼脂6g·L ，pH为5.8，pH为
5.8，置于25℃ 暗培养2个月，在伤口一侧的横切面上均能出现一轮约5-10个丛生芽(附图1)。
[0031] ② 将上述丛生芽根据芽的多少分割成1-3块，每块3-5个芽，转入降低TDZ的3种-1 -1培养基：1）、改良MS + 0.01 mg/L + TDZ 0.01～0.05 mg/L,蔗糖30 g·L ，琼脂6 g·L ，-1 -1
pH为5.8；2）、改良 MS + TDZ 0.02 mg/L,蔗糖30 g·L ，琼脂6 g·L ，pH为5.8，3）改-1 -1
良MS + TDZ 0.05 mg/L,蔗糖30 g·L ，琼脂6 g·L ，pH为5.8，置于 25℃，1200lx光强下进行壮苗培养2个月，苗均能健壮成长(附图2)。
[0032] ③ 将上述健壮的芽转入以下2种生根培养基：1）、1/2改良MS + IAA 0.5 mg/-1 -1L,蔗糖30 g·L ，琼脂6 g·L ，活性炭0.1%，pH为5.8；2）、1/2改良MS + IAA 0.5 -1 -1
mg/L,蔗糖30 g·L ，琼脂6 g·L ，活性炭0.1%，pH为5.8；置于 25℃，1200lx光强下进行生根培养，2-3个月后均能形成5-10个肉质根，可进行炼苗移栽(附图3)。
[0033] 本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求范围的各种变型和等效变化。
