一种布鲁氏菌bp26蛋白表位及其单克隆抗体和应用

摘要

本发明公开了布鲁氏菌bp26蛋白表位及其抗体和应用，表位的序列为QPIYVYPD。本发明的布鲁氏菌bp26蛋白表位，为bp26蛋白的核心表位，疫苗株中该段序列突变后获得的突变bp26蛋白在免疫羊之后，无法诱导产生抗该表位的抗体，从而达到自然感染与疫苗接种免疫的鉴别诊断。

权利要求

1.布鲁氏菌bp26蛋白表位，其序列为QPIYVYPD ( SEQ ID NO：1)。

2.权利要求1所述布鲁氏菌bp26蛋白表位在制备布鲁氏菌病诊断试剂中的应用。

说明书

一种布鲁氏菌bp26蛋白表位及其单克隆抗体和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种布鲁氏菌bp26蛋白表位，以及使用该表位刺激得到的抗布鲁氏菌bp26蛋白单克隆抗体。本发明还涉及该细胞表位抗体及该细胞表位的应用。

背景技术

[0002] 布鲁氏菌病（Brucellosis）是目前世界上流行最广的人畜共患传染病之一，近十几年来，该病的发生和流行在世界范围内呈上升趋势。据世界卫生组织统计表明，全世界每年出现50万例人布鲁氏菌病，每年造成的经济损失达30亿美元 ，我国布病的流行以羊种布氏杆菌为主的混合感染，羊种占流行株的80%。

[0003] 布鲁氏菌病目前缺乏特异有效的治疗手段，大剂量抗菌素即使长期治疗收效仍有限，尤其难以克服菌株耐药问题，疫苗接种和清除感染宿主是防控的主要手段。布鲁氏菌病的免疫制剂种类繁多，主要包括弱毒活疫苗﹑死疫苗﹑亚单位疫苗﹑抗独特性疫苗和DNA疫苗等。

[0004] 由于热灭活菌缺乏活性抗原刺激，不能在体内诱发可检测的IL-12，并且抑制IL-12的产生，免疫效果不佳，而且死菌诱发的多是无保护力的体液免疫应答。而亚单位疫苗虽然可起到短期的保护作用，但并不能诱发有效的长期免疫，只有活菌才能诱发细胞免疫。

[0005] 我国主要是以布鲁氏菌弱毒菌苗株M5-90来免疫羊。它对成年羊有很好的免疫保护效果，但会导致妊娠羊流产。bp26蛋白与弱毒菌苗株毒力相关，并含有保护性抗原表位，若将M5-90疫苗株携带的bp26基因全部敲除，则影响弱毒菌苗株的免疫效果。另外，由于M5-90免疫的动物和野毒菌株自然感染的动物现有诊断方法不能鉴别，严重影响了布鲁氏菌病的检验和疫苗免疫预防。因此，针对bp26蛋白的抗原表位进行修饰或改造标记疫苗，可建立该表位多肽ELISA诊断方法及其诊断试剂，进而解决布鲁氏菌病鉴别诊断和基因工程标记弱毒菌苗株的技术难题。

[0006] 关于bp26蛋白的表位研究，Patricia Seco-Mediavilla 等人构建了系列的截短多肽的表达质粒，并表达纯化融合蛋白对抗bp26单克隆抗体进行表位筛选，但是筛选出来的抗原表位段并不明确。(参见Epitope Mapping of the Brucella melitensis bp26 Immunogenic Protein: Usefulness for Diagnosis of Sheep Brucellosis ， Seco-Mediavilla， Verger et al. Clin. Vaccine. Immunol. 2003， 10(4):647)。

发明内容

[0007] 本发明的一个目的在于提供一种布鲁氏菌bp26蛋白表位。

[0008] 本发明的另一个目的在于提供上述bp26蛋白表位在制备诊断、预防或治疗布鲁氏菌病诊断试剂或药物中的应用。

[0009] 本发明的又一个目的在于提供由上述表位刺激产生的单克隆抗体。

[0010] 本发明的再一个目的在于提供上述单克隆抗体在制备诊断、预防或治疗布鲁氏菌病诊断试剂或药物中的应用。

[0011] 本发明所采取的技术方案是：

[0012] 布鲁氏菌bp26蛋白表位，其序列为QPIYVYPD ( SEQ ID NO：1)。

[0013] 抗布鲁氏菌bp26蛋白的单克隆抗体，其制备方法为：

[0014] 1)将上述的布鲁氏菌bp26蛋白表位免疫动物；

[0015] 2)取经免疫的动物脾细胞与瘤细胞融合，得到可稳定分泌抗布鲁氏菌bp26蛋白的杂交瘤细胞；

[0016] 3)收集、纯化杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，即为抗布鲁氏菌bp26蛋白的单克隆抗体。

[0017] 优选的，产生免疫反应的动物的血清间接ELISA效价不低于1：51200。

[0018] 本发明的有益效果是：

[0019] 本发明的布鲁氏菌bp26蛋白表位，为bp26蛋白的核心表位，疫苗株中该段序列突变后获得的突变bp26蛋白在免疫羊之后，无法诱导产生抗该表位的抗体，从而达到自然感染与疫苗接种免疫的鉴别诊断。

[0020] 本发明的布鲁氏菌bp26蛋白表位，偶联之后可用于检测羊血清中的布鲁氏菌病，建立Peptide-ELISA检测方法，为新型分子标记疫苗的研制提供依据。

[0021] 本发明的单克隆抗体，对bp26蛋白具有很好的特异性识别能力，可以精确地识别布鲁氏菌的表位。

[0022] 本发明的单克隆抗体及bp26蛋白表位用于布鲁氏菌病的诊断，可以很好地鉴别出动物是自然感染布病的还是接种免疫的。

附图说明

[0023] 图1 是重组蛋白bp26表达与纯化电泳鉴定图；M ：marker；1：诱导前全菌；2：诱导后全菌；3：超声后上清；4：超声后沉淀；5：包涵体洗涤并复性浓缩

[0024] 图2 是Western-Blot 试验检测单克隆抗体bp26-2A4与布鲁氏菌疫苗株M5-90中提取的天然膜蛋白的反应性结果。

[0025] 图3 和4是肽矩阵设计初步筛选bp26-2A4抗原表位。

[0026] 图5 是竞争抑制ELISA测定单克隆抗体株bp26-2A4抗原表位。

[0027] 图6 是抗原表位多肽及突变肽与单克隆抗体bp26-2A4反应。

具体实施方式

[0028] 下面结合实施例，进一步说明本发明。

[0029] 本发明使用的布鲁氏菌M5-90疫苗株购自兰州兽医研究所，为本行业所公知的疫苗株。

[0030] 布鲁氏菌重组膜蛋白bp26的制备

[0031] 将构建的重组质粒pET-28a-bp26（新疆石河子大学陈创夫教授惠赠）转化感受态BL21。将重组菌摇至对数生长期后，以终浓度1mM IPTG加入诱导目的蛋白表达。诱导后超声破碎，经鉴定目的蛋白主要处于沉淀中。将包涵体以5M尿素浓度的包涵体洗涤液（1×PBS，5M脲，1% TritonX-100，1mmol/L EDTA， pH8.0）洗涤后，目的蛋白纯度达85%以上。将洗涤后的沉淀用6M盐酸胍(1×PBS， 6M盐酸胍，pH8.0)溶解后进行梯度透析复性，复性后将蛋白浓缩并测定蛋白浓度（见附图1，图中，M ：marker；1：诱导前全菌；2：诱导后全菌；3：超声后上清；4：超声后沉淀；5：包涵体洗涤并复性浓缩）。

[0032] 当然，也可以使用其他方法制备得到的布鲁氏菌重组膜蛋白bp26，或直接购买纯化的布鲁氏菌重组膜蛋白bp26。

[0033] 制备重组膜蛋白bp26的单克隆抗体

[0034] 1.小鼠免疫

[0035] 1)选择6周龄的纯系雌性BALB/c小鼠，用纯化的重组bp26蛋白作为免疫抗原免疫小鼠，将bp26蛋白与等体积的弗氏完全佐剂（CFA）乳化后，背部或腹腔皮下多点注射；

[0036] 2)初次免疫后2周将纯化的bp26与等体积的弗氏不完全佐剂（IFA）乳化后，背部或腹腔皮下多点注射；

[0037] 3)2周后，小鼠尾部取血，离心获得血清将血清倍比稀释采用间接-ELISA方法测效价，效价需不低于1：51200；

[0038] 4)融合前三天，腹腔注射bp26蛋白；

[0039] 三次免疫抗原的量分别为100μg/鼠、50μg/鼠、50μg/鼠。

[0040] 2.细胞融合

[0041] 断颈处死上述免疫好的BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞按5:1在50% PEG4000融合剂下融合，融合后以HAT选择培养基铺板置于37℃ 5%CO2培养。

[0042] 3.阳性克隆筛选及克隆

[0043] 利用纯化的重组bp26蛋白以间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，将阳性孔扩大培养后，用有限稀释法进行细胞克隆，经过三次克隆获得1株能稳定传代并分泌抗bp26蛋白的特异性单克隆抗体细胞株bp26-2A4。

[0044] 单克隆抗体的鉴定

[0045] 1.单克隆抗体的亚类鉴定

[0046] 参照Hycult Biotechnol公司鼠源抗体分型试剂盒说明书对杂交瘤细胞bp26-2A4进行鉴定，经鉴定bp26-2A4重链为IgG1，轻链为 κ链。

[0047] 2. Western-Blot 鉴定

[0048] 按Bio-rad膜蛋白提取试剂盒说明书提取布鲁氏菌M5-90疫苗株膜蛋白，提取后膜蛋白按1:1加入2×SDS上样缓冲液，沸水浴中煮5min，12000rpm离心1min，取上清10μl进行分离胶12%，浓缩胶5%的SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜上， PVDF膜以含5%脱脂奶粉TBST封闭2h， 随后以各株单抗的细胞上清1:3稀释孵育1h，TBST洗膜三次，每次10min；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG & IgM作为二抗孵育1h，TBST洗膜后发光显影。
试验中以HCV NS3的一株单抗作为阴性对照。试验结果显示bp26-2A4与天然膜蛋白在约为28KDa处有一明显条带，而阴性对照HCV NS3的单抗不与膜蛋白反应（图2）。

[0049] 肽矩阵设计初步筛选bp26-2A4抗原表位

[0050] 根据pET-28a-bp26测序结果（见SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5所示的序列），设计并合成了28条重叠肽，长度10～16个氨基酸，每两条多肽之间重叠7个氨基酸（包括所有≤8个氨基酸残基的表位）(表1)。将多肽分为11个肽池（见表2），肽池中每条多肽终浓度5μg/ml，每孔100μl包被过夜；洗涤液PBST洗涤4次后，以PBS+4%BSA，每孔200μl37℃封闭一小时；洗涤液洗涤4次后，以50μl各单克隆抗体株细胞上清+50μl抗体稀释液（PBST+1%BSA）为一抗37℃孵育45min；洗涤液洗涤6次后，1:10000抗体稀释液稀释的HRP标记羊抗鼠IgG+IgM为二抗，每孔100μl，37℃孵育30min；洗涤液洗涤6次后，加入TMB-H2O2，每孔100μl避光显色10min，每孔50μl 2M H2SO4终止反应。测量450nm波长下每孔的光密度（OD）。以小鼠免疫bp26蛋白后血清作为阳性对照，阴性对照为小鼠免疫前血清。以待测孔OD450nm≥2.1倍阴性对照OD450nm判为阳性。经过测定单抗bp26-2A4仅与POOLY6肽池反应(图3)，所以又分别将bp26-2A4与POOLY6中的四条多肽P06，12，18，
24反应，结果显示bp26-2A4与多肽12反应（图4）。

[0051]

[0052]

[0053]

[0054] 竞争抑制ELISA试验精确测定单克隆抗体bp26-2A4的B细胞表位

[0055] 根据上述肽矩阵筛选得到的bp26-2A4抗原表位可知，单抗bp26-2A4能与P12反应，所以将P12以5μg/ml包被96孔板4℃过夜，PBS +4%BSA封闭1h后，以50μl细胞上清+50μl 以对应的六条9肽P1201～P1206 （终浓度0μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，4μg/ml，8μg/ml，16μg/ml）进行竞争抑制。以P12作为阳性对照，HCV NS3的其中一条16肽作为阴性对照。测量结果双复孔的OD450nm的均值表示。

[0056] 经过竞争抑制ELISA试验得到以下结果：P1202，P1203，P1204都能有效抑制mAb bp26-2A4与P12结合，所以其共同序列QPIYVYP (SEQ ID NO：1)104～110是bp26-2A4单克隆抗体最小抗原表位基序（图5）。

[0057]

[0058] 抗原表位核心序列的突变分析

[0059] 重新合成了一条同样包含核心序列的多肽P12’NIQPIYVYPDDKNNLK（102～117），见SEQ ID NO：2。根据精确测定的bp26-2A4抗原表位，其核心区域为QPIYVYPD （SEQ ID NO：1）（104～110） 将P12’中第107及109位氨基酸的酪氨酸突变为苯丙氨酸成为MutP12’其氨基酸序列为SEQ.ID.NO：3所示的序列NIQPIFVFPDDKNNLK。 以Peptide-ELISA的方法，将P12’，MutP12’分别与单抗bp26-2A4反应，其结果显示突变之后的多肽(MutP12’)较突变之前的抗原表位肽(P12’)反应明显下降，进一步证实P12’中包含bp26的一个B细胞表位(图6)。

[0060] 表位多肽检测羊血清

[0061] 将多肽P12’与血蓝蛋白(KLH)偶联之后，以之前所述5μg/ml包被过夜，60份免疫或感染羊血清作为一抗，HRP-兔抗羊IgG & IgM为二抗。经测定53份血清阳性，检出率88.3%。

[0062]