用于T淋巴细胞的体外培养方法

摘要

一种用于T淋巴细胞的体外培养方法，从根本上解决现有T淋巴细胞的体外培养方法存在的成本高、使用不方便、且不利于医学研究和临床应用的问题，本发明包括对T淋巴细胞进行定向分选、诱导、分化、培养、扩增等步骤，采用了特殊的细胞因子组合用于对T淋巴细胞进行诱导分化，这三种因子分别是CD3单克隆抗体、γ-干扰素、白细胞介素-1α，这三种因子的最佳浓度比例为10:1:1，这三种因子在培养基中的总终浓度为1200ng/ml，实验表明这种组合是诱导T淋巴细胞分化的极有效的方式。

权利要求

1.一种用于T淋巴细胞的体外培养方法，包括对T淋巴细胞进行定向分选、诱导、分化、培养、扩增，其特征在于：具体操作步骤如下：第一步、对T淋巴细胞进行定向分选：

将稀释好的血细胞以1：1的比例缓慢注入细胞分选液上，并离心处理；用移液管吸出分选后的第一层液体即血浆或细胞组织均浆液层，弃去，吸取第二层细胞即环状乳白色淋巴细胞于新的离心管中；向新收集的细胞中补加生理盐水，离心处理后弃上清；重复洗两次；其中细胞分选液的配制方法为：取9% Ficoll溶液720ml与33.4%泛影葡胺30ml充分混合，再向该混合液中加入7.5g的明胶，充分混匀；用高浓度的泛影葡胺或稀释的Ficoll来调整溶液的相对密度至1.077g/ml；最后放入温度为121℃的高压蒸汽灭菌中30min，室温保存备用；

第二步、对T淋巴细胞进行诱导、分化、培养：

取包被瓶一个，所述包被瓶是预先包被了CD3单克隆抗体、γ-干扰素、白细胞介素-1α三种因子的细胞培养瓶，用生理盐水或培养基润洗一次并弃去，加入患者自体血浆

2~5ml；取培养基重悬细胞，混匀后将其移入包被瓶中；而后用培养基润洗离心管，将润洗液再次移入包被瓶中；将包被瓶放入5% CO2、37℃的培养箱中培养24h；

包被瓶的制备：取CD3单克隆抗体、γ-干扰素、白细胞介素-1α加入到40ml磷酸盐缓冲液中，CD3单克隆抗体、γ-干扰素、白细胞介素-1α三种因子的浓度比例为10:1:1，制成总浓度为1200ng/ml的混合溶液，充分混匀；将该混合溶液加入到600ml培养瓶中，4℃静置至少24小时，制成初始包被瓶；将初始包被瓶在-40℃条件下冷冻24小时；启动冷冻干燥机的压缩机，使机器腔室内的温度降至-40℃，将包被瓶瓶口拧松，放入干燥室；开启真空泵，使压力达到<15Pa，真空冻干20小时；打开CO2进气阀，关闭真空泵；待压力到110K后关闭CO2进气阀，取出包被瓶，拧紧盖子，封好口，4℃保存；在规定的保质期内使用；

第三步、对T淋巴细胞进行扩增：

吸取新鲜培养基溶解细胞因子A，即20万单位的白细胞介素-2，注入包被瓶中，此时细胞因子A在培养瓶中的浓度为0.4万单位/ml；于5%CO2，37℃培养箱中培养2~3天后，向包被瓶中补加新鲜培养基100ml；再于5% CO2，37℃培养箱中继续培养1~2天，当细胞基本铺满包被瓶底时，进行转袋；

用移液管吹下包被瓶中的贴壁细胞，用注射器吸取新鲜培养基溶解细胞因子B，即200万单位的白细胞介素-2，加入包被瓶中，同时加入患者自体血浆2~5ml，将培养瓶中的细胞培养液倒入培养袋中；用新鲜培养基润洗包被瓶两次，将润洗液一并倒入培养袋中，补加培养基至1000ml，此时细胞因子B在培养瓶中的浓度为0.2万单位/ml；将培养袋放入5%CO2，

37℃培养箱中培养3~4天后，补加新鲜培养基1000ml，继续放入5%CO2，37℃培养箱中培养；

补液后第二天，进行检菌，证明培养袋中的培养物是否可以用于医学研究。

2.根据权利要求1所述的用于T淋巴细胞的体外培养方法，其特征在于：还包括检菌、回输步骤：

所述检菌时，取出培养袋，用注射器由取样口吸取培养物分别注入两个双相血培养瓶中，一瓶送与第三方进行无菌检测，一瓶用于自检；将双向血培养瓶置于37℃恒温培养箱中培养；双相血培养瓶培养3天后若无菌生长，证明培养袋中的培养物可以用于医学研究；

回输时，准备离心管8个，将培养物倒入离心管中，剩余培养物放回培养箱继续培养；

4℃条件下，离心处理弃去上清，用生理盐水重悬细胞并集中到2个离心管中；4℃条件下，离心处理弃去上清；用生理盐水重悬细胞并集中到1个离心管中；4℃条件下，离心处理弃去上清，用生理盐水重悬细胞；4℃条件下，离心处理弃去上清，用生理盐水重悬细胞；用注射器吸取一只细胞分散剂注入新的离心管中，该细胞分散剂为10%人血清白蛋白，而后将无菌筛网放到该离心管上；吸取细胞悬液，注入装有无菌滤器的离心管中；通过滤网滤去大的细胞团；取回输袋一个，倒入细胞并加生理盐水备用。

3.根据权利要求1或2所述的用于T淋巴细胞的体外培养方法，其特征在于：用于处理人外周血、脐带血、胸水、腹水中的单个核细胞的体外定向分选、诱导、分化、培养、扩增。

说明书

用于T淋巴细胞的体外培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于处理人外周血、脐带血、胸水、腹水等样品中的单个核细胞成为细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-Induced Killer，简称CIK）的方法，特别是一种用于T淋巴细胞的体外培养方法，该方法可以应用于临床细胞生物治疗，也可以应用于基础医学研究、临床应用研究及生物技术研究，尤其可以应用于免疫系统研究和肿瘤杀伤作用的研究。

背景技术

[0002] 随着肿瘤对人类生存健康的威胁日益严重，应对肿瘤的治疗模式也发生着日新月异的变化，各种新药物、新技术、新方法层出不穷，其中细胞生物治疗是继手术、放疗和化疗后发展的第四类肿瘤治疗方法，成为肿瘤生物治疗中重要的发展方向。癌症是肿瘤细胞逃脱免疫监视系统的细胞疾病，机体免疫功能的缺陷是癌症发生和发展的关键。机体的抗肿瘤免疫主要为T淋巴细胞所介导。细胞生物治疗技术将自体免疫细胞经体外诱导、分化、扩增再回输至体内，绕过体内肿瘤免疫障碍机制，通过激发机体的免疫反应来对抗、抑制和杀灭癌细胞。继淋巴因子激活杀伤细胞、浸润肿瘤淋巴细胞及分化抗原（Cluster of Differentiation, 简称CD）3单抗激活的杀伤细胞后，CIK的杀瘤作用日益受到重视。

[0003] CIK细胞是1991年由美国斯坦福大学施密特等首次报道。他们发现在体外模拟人体内环境的条件下，外周血淋巴细胞可以被多种细胞因子定向诱导并增殖为一群具有高效细胞毒活性的异质效应细胞。由于该细胞群同时表达CD3、CD8和CD56膜蛋白分子，故又称为自然杀伤细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤细胞的非主要组织相容性复合物限制性杀瘤的优点，可特异性聚集于肿瘤局部发挥抗瘤杀瘤作用。CIK+ + +细胞在体内归巢于脾脏和淋巴结，在肝脏中分布最多，其次是外周血。其中CD3、CD8、CD56是CIK细胞群中的主要效应细胞，在正常人外周血中仅占淋巴细胞的1-5%，而在体外经多种因子刺激培养10-25天后，细胞数量较培养前可增加1000倍以上。

[0004] 与其他过继性免疫治疗细胞相比，CIK细胞具有增殖快、杀瘤活性强、杀瘤谱广、副作用小、对正常骨髓造血影响轻微等优点。对化疗耐药的肿瘤细胞株有杀伤作用，而对正常造血集落细胞的生长没有影响。通过取病人少量单个核细胞，在体外特定条件下制备出大量CIK细胞，回输体内后直接发挥有效清除肿瘤作用，尤其对手术后或放化疗后患者效果显著，能消除残留微小的转移病灶，防止癌细胞扩散和复发，提高机体免疫力，并实现了延长患者生存期，快速提高患者生活质量等多重目标。因此，CIK被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的优选细胞。目前肿瘤生物治疗中心应用树突状细胞（Dendritic Cell，简称DC）和CIK细胞联合回输的方法，用于恶性黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌、食道癌、胃癌、膀胱癌等疾病治疗。但目前各个实验室培养CIK的方法，使用材料，培养时间均不一致，导致有效细胞的培养周期、质量和数量参差不齐，给临床应用带来了效果不稳定的风险因素。

[0005] 另外，在中国专利申请号为200910045790.4的“一种CIK细胞及其制备方法和细胞制剂”中，公开了一种CIK细胞及其制备方法和细胞制剂。其记载的CIK细胞的诱导因子组合为植物血凝素、抗CD3单抗和抗CD28单抗。该方案中所使用的植物血凝素是一种有丝分裂原，能激活小淋巴细胞转化为淋巴母细胞，继而分裂增殖，释放淋巴因子，提高巨噬细胞的吞噬功能，但由于其较难提纯，且成本极高，所以一直以来仅在实验室中作为刺激淋巴细胞增殖的试剂，很难应用于临床的大规模使用。在中国专利申请号为200310109565.5的“一种CIK细胞体外培养方法”中，公开了一种CIK细胞体外培养方法。该培养方法同样采用了植物血凝素和抗CD3单克隆抗体两种有丝分裂原联合激活细胞，虽然能够增强细胞的刺激强度，但该方法需要借助生物反应器完成，不仅成本高，使用不方便，且不利于医学研究和临床应用。

[0006] 综上，现有CIK细胞（T淋巴细胞）体外培养方法急需改进。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种用于T淋巴细胞的体外培养方法，该培养方法可以用于T淋巴细胞体外定向分选、诱导、分化、培养、扩增。

[0008] 本发明所采用的技术方案是：该用于T淋巴细胞的体外培养方法，包括对T淋巴细胞进行定向分选、诱导、分化、培养、扩增，其技术要点是：具体操作步骤如下：

[0009] 第一步、对T淋巴细胞进行定向分选：

[0010] 将稀释好的血细胞以1：1的比例缓慢注入细胞分选液上，并离心处理；用移液管吸出分选后的第一层液体即血浆或细胞组织均浆液层，弃去，吸取第二层细胞即环状乳白色淋巴细胞于新的离心管中；向新收集的细胞中补加生理盐水，离心处理后弃上清；重复洗两次；其中细胞分选液的配制方法为：取9% Ficoll溶液720ml与33.4%泛影葡胺30ml充分混合，再向该混合液中加入7.5g的明胶，充分混匀；用高浓度的泛影葡胺或稀释的Ficoll来调整溶液的相对密度至1.077g/ml；最后放入温度为121℃的高压蒸汽灭菌中
30min，室温保存备用；

[0011] 第二步、对T淋巴细胞进行诱导、分化、培养：

[0012] 取包被瓶一个，所述包被瓶是预先包被了CD3单克隆抗体、γ-干扰素、白细胞介素-1α、三种因子的细胞培养瓶，用生理盐水或培养基润洗一次并弃去，加入患者自体血浆2~5ml；取培养基重悬细胞，混匀后将其移入包被瓶中；而后用培养基润洗离心管，将润洗液再次移入包被瓶中；将包被瓶放入5% CO2、37℃的培养箱中培养24h；

[0013] 包被瓶的制备：取CD3单克隆抗体、γ-干扰素、白细胞介素-1α加入到40ml磷酸盐缓冲液中，CD3单克隆抗体、γ-干扰素、白细胞介素-1α三种因子的浓度比例为10:1:1，制成总浓度为1200ng/ml的混合溶液，充分混匀；将该混合溶液加入到600ml培养瓶中，4℃静置至少24小时，制成初始包被瓶；将初始包被瓶在-40℃条件下冷冻24小时；启动冷冻干燥机的压缩机，使机器腔室内的温度降至-40℃，将包被瓶瓶口拧松，放入干燥室；开启真空泵，使压力达到<15Pa，真空冻干20小时；打开CO2进气阀，关闭真空泵；待压力到110K后关闭CO2进气阀，取出包被瓶，拧紧盖子，封好口，4℃保存；在规定的保质期内使用；

[0014] 第三步、对T淋巴细胞进行扩增：

[0015] 吸取新鲜培养基溶解细胞因子A，即20万单位的白细胞介素-2，注入包被瓶中，此时细胞因子A在培养瓶中的浓度为0.4万单位/ml；于5%CO2，37℃培养箱中培养2~3天后，向包被瓶中补加新鲜培养基100ml；再于5% CO2，37℃培养箱中继续培养1~2天，当细胞基本铺满包被瓶底时，进行转袋；

[0016] 用移液管吹下包被瓶中的贴壁细胞，用注射器吸取新鲜培养基溶解细胞因子B，即200万单位的白细胞介素-2，加入包被瓶中，同时加入患者自体血浆2~5ml，将培养瓶中的细胞培养液倒入培养袋中；用新鲜培养基润洗包被瓶两次，将润洗液一并倒入培养袋中，补加培养基至1000ml，此时细胞因子B在培养瓶中的浓度为0.2万单位/ml；将培养袋放入
5%CO2，37℃培养箱中培养3~4天后，补加新鲜培养基1000ml，继续放入5%CO2，37℃培养箱中培养；补液后第二天，进行检菌，证明培养袋中的培养物是否可以用于医学研究。

[0017] 还包括检菌、回输步骤：

[0018] 所述检菌时，取出培养袋，用注射器由取样口吸取培养物分别注入两个双相血培养瓶中，一瓶送与第三方进行无菌检测，一瓶用于自检；将双向血培养瓶置于37℃恒温培养箱中培养；双相血培养瓶培养3天后若无菌生长，证明培养袋中的培养物可以用于医学研究；

[0019] 回输时，准备离心管8个，将培养物倒入离心管中，剩余培养物放回培养箱继续培养；4℃条件下，离心处理弃去上清，用生理盐水重悬细胞并集中到2个离心管中；4℃条件下，离心处理弃去上清；用生理盐水重悬细胞并集中到1个离心管中；4℃条件下，离心处理弃去上清，用生理盐水重悬细胞；4℃条件下，离心处理弃去上清，用生理盐水重悬细胞；用注射器吸取一只细胞分散剂注入新的离心管中，该细胞分散剂为10%人血清白蛋白，而后将无菌筛网放到该离心管上；吸取细胞悬液，注入装有无菌滤器的离心管中；通过滤网滤去大的细胞团；取回输袋一个，倒入细胞并加生理盐水备用。

[0020] 所述培养方法用于处理人外周血、脐带血、胸水、腹水中的单个核细胞的体外定向分选、诱导、分化、培养、扩增。

[0021] 本发明具有的优点及积极效果是：由于本发明采用了特殊的细胞因子组合用于对T淋巴细胞进行诱导分化，这三种因子分别是CD3单克隆抗体、γ-干扰素、白细胞介素-1α；这三种因子的最佳浓度比例为10:1:1，这三种因子在培养基中的总终浓度为1200ng/ml，实验表明这种组合是诱导T淋巴细胞分化的极有效的方式。同时，以细胞因子预先包被细胞培养瓶的方法诱导T淋巴细胞分化，增加了T淋巴细胞与细胞因子接触的面积和时间，使之更容易接受到细胞因子刺激而迅速被诱导分化。另外，本发明采用了冻干的方法制备包被瓶，这种方法对于保证细胞因子的活性是非常有效的。如果这种方法应用于产业化生产，既可以延长包被瓶的保质期，又降低了对运输条件的要求，是一种适用于实际生产的极好方法。

[0022] γ-干扰素是由CD4+或CD8+细胞产生的同源二聚体糖蛋白，可通过多种途径直接或间接发挥抗肿瘤作用，增强自然杀伤细胞、巨噬细胞以及细胞毒性T细胞的活性。在诱导CIK细胞形成过程中加入γ-干扰素可降低白细胞介素-2用量；同时γ-干扰素加入的顺序与细胞毒活性密切相关，先加入γ-干扰素后加入白细胞介素-2可提高细胞毒活性。这是因为先加入γ-干扰素可促使外周血单核细胞上白细胞介素-2受体数量增加，从而有效地激活了效应细胞。抗CD3单克隆抗体作为一种有丝分裂促进剂可促进细胞增殖。20世纪80年代初研究者们就发现抗CD3抗体或抗T细胞受体抗体能模拟生理配体体外激活静止的T细胞，使之大量增殖，表达白细胞介素-2受体，产生内源性白细胞介素-2。抗CD3单抗具有抗肿瘤转移的作用，抗体抑制恶性肿瘤的生长可能是免疫增强的效果，抗体使抗肿瘤特异性T细胞数量增多，活性增强，同时内源性细胞因子的诱生放大了这种作用。抗CD3单克隆抗体不仅在CIK细胞培养过程中起着重要作用，在提高CIK细胞对白血病及淋巴瘤的杀伤敏感性上同样具有促进作用。白细胞介素-1主要由激活的单核巨噬细胞产生。白细胞介素-1的体内抗肿瘤作用机制是增强T细胞及增加肿瘤浸润淋巴细胞的数量和功能。白细胞介素-1可以介导外周血单个核细胞上表达白细胞介素-2受体，与γ-干扰素、CD3单克隆抗体联合使用时可以明显提高CIK的细胞毒效应，但白细胞介素-1对CIK细胞扩增不起作用。白细胞介素-2是T淋巴细胞分泌的一种细胞因子（由133个氨基酸组成的多肽，
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相对分子质量约为15×10）。它是人体免疫应答的核心物质，具有免疫增强、抗肿瘤和抗感染等作用。临床上已用于肾癌、黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肠癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、白血病及癌性胸腹水等病症的治疗。与放疗、化疗比较，白细胞介素-2对正常细胞毒副作用轻微，能减轻肿瘤患者的疼痛，提高患者生活质量。此外结核病、肝炎、艾滋病、性病、成瘾性吸毒者及其他免疫功能低下患者均可使用白细胞介素-2。CIK细胞是多种细胞因子共同诱导培养的一群异质细胞群，多种细胞因子的作用是相互协同的，单一因子对效应细胞的增殖及细胞毒活性无作用或者小于多种细胞因子的联合作用。联合作用的机制是最终共同激活静止T细胞，提高细胞表达白细胞介素-2受体和产生白细胞介素-2的能力，启动自分泌途径白细胞介素-2依赖的T细胞激活反应。

[0023] 另外，本发明制备了一种高效的细胞分选液，该细胞分选液能够有效裂解血液中的红细胞，使红细胞成分充分沉淀，与待分离的单个核细胞分开。再则，本发明试剂盒采用无血清培养基，无血清培养基可达到生物洁净要求，成分明确，质量稳定，便于质控，克服了人AB 血清的缺点，能减少病人意外感染的机会，对于免疫治疗的推广应用有重要意义。使+ + +用本发明所述培养方法处理T淋巴细胞，可以收获95%以上的CD3 细胞，其中CD3CD8 细+ + + +
胞达80%以上，CD3CD4 细胞达10-20%以上，CD3CD56 细胞达16-20%。

附图说明

[0024] 以下结合附图对本发明作进一步描述：

[0025] 图1是人外周血经本发明所述培养方法处理后所获得培养4天的 40倍镜下CIK细胞实拍图；

[0026] 图2是人外周血经本发明所述培养方法处理后所获得培养7天的 40倍镜下CIK细胞实拍图；

[0027] 图3是人外周血经本发明所述培养方法处理后所获得培养7天的 100倍镜下CIK细胞实拍图；

[0028] 图4是人外周血经本发明所述培养方法处理后所获得培养9天的 40倍镜下CIK细胞实拍图；

[0029] 图5是人外周血经本发明所述培养方法处理后所获得培养10天的 40倍镜下CIK细胞实拍图；

[0030] 图6是人外周血经本发明所述培养方法处理后所获得培养10天的 400倍镜下CIK细胞实拍图；

[0031] 图7是人胸水经本发明所述培养方法处理后获得的CIK细胞，经流式细胞仪测定+ +反馈出的CD45 散点图，图中圈出的是CD45 细胞，这些细胞代表样品中的白细胞，包括淋巴细胞、巨噬细胞等；

[0032] 图8是人胸水经本发明所述培养方法处理后获得的CIK细胞，经流式细胞仪测定+ +反馈出的CD3 散点图，图中圈出的是CD3 细胞，这些细胞代表样品中的T淋巴细胞；

[0033] 图9是人胸水经本发明所述培养方法处理后获得的CIK细胞，经流式细胞仪测定+ + + + +反馈出的CD3CD8 散点图，图中根据CD8抗原将CD3 细胞分成了的两部分，上方是CD3CD8+ -
双阳细胞，代表的是细胞毒性T细胞；下方是CD3CD8 单阳细胞；

[0034] 图10是人胸水经本发明所述培养方法处理后获得的CIK细胞，经流式细胞仪测+ + +定反馈出的CD4CD8 散点图，图中根据CD4和CD8抗原将CD3 细胞分成四部分，右上方+ + - +
是CD4CD8 双阳细胞；右下方是CD4CD8 单阳细胞，代表的是细胞毒性T细胞；左下方是- - + -
CD4CD8 双阴细胞；左上方是CD4CD8 单阳细胞，代表的是辅助性T细胞。

具体实施方式

[0035] 结合图1~10和对本发明作详细描述。

[0036] 本发明所述T淋巴细胞的体外培养方法主要用于T淋巴细胞体外定向分选、诱导、分化、培养、扩增等；其处理的生物样品包括人外周血、脐带血、胸水、腹水等；可以应用于临床细胞生物治疗，包括肾癌、恶性黑色素瘤、白血病、乳腺癌、直肠癌、胃癌、肺癌、食管癌、宫颈癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤（非T细胞淋巴瘤）等恶性肿瘤疾病，也可以应用于基础医学研究、临床应用研究及生物技术研究，尤其可以应用于免疫系统研究和肿瘤杀伤作用的研究。具体培养方法如下：

[0037] 实施例一：

[0038] 现以人外周血为处理样品，使用本发明所述试剂盒中内容物分选诱导CIK细胞，并应用于临床生物治疗。具体操作步骤如下：

[0039] 步骤一．血液处理

[0040] 1. 将50ml抗凝血注入50ml离心管中，4℃条件下1600~2000×g离心10min。如不能马上离心，可放于4℃保存，但不能超过4小时。

[0041] 2. 用移液管将上层血浆移入新50ml离心管中，标注好患者信息。56℃灭活30min。

[0042] 3. 生理盐水稀释血细胞至50ml，用移液管混匀。以上为稀释血细胞过程。

[0043] 4. 将稀释好的血细胞以1：1的比例缓慢注入每管7ml的细胞分选液上。注意不要打破界面。

[0044] 5. 20℃条件下，2200~2500×g离心20min。此时离心管中细胞由上至下分为四层。第一层：血浆或细胞组织均浆液层；第二层：环状乳白色淋巴细胞层；第三层：透明细胞分选液层；第四层：红细胞层。用移液管吸出第一层液体，弃去；吸取第二层细胞于新的50ml离心管中。

[0045] 6. 向新收集的细胞中补加生理盐水至50ml，4℃条件下，1600~2000×g离心4~5min。

[0046] 7. 弃去上清。轻弹离心管管底，打散沉淀。

[0047] 8. 重复步骤6~7两次。以上为细胞分选过程。

[0048] 9. 取已包被细胞因子24小时以上的包被瓶，用生理盐水或培养基润洗一次并弃去，加入患者自体血浆2~5ml。

[0049] 10. 取25ml培养基重悬细胞，用移液管充分混匀后将其移入包被瓶中。

[0050] 11. 用25ml培养基润洗离心管，将润洗液再次移入包被瓶中。

[0051] 12. 将包被瓶放入5%CO2，37℃培养箱中培养。以上为细胞诱导分化培养过程。

[0052] 步骤二．加细胞因子A

[0053] 1. 血液处理第二天，从上述培养箱中取出包被瓶，观察细胞状态。

[0054] 2. 用5ml注射器吸取新鲜培养基2ml溶解细胞因子A，注入包被瓶中。

[0055] 3. 将包被瓶放入5%CO2，37℃培养箱中培养。

[0056] 步骤三．补液

[0057] 1. 上述培养2~3天时，如图1所示，细胞出现生长迹象，向包被瓶中补加新鲜培养基100ml。

[0058] 2. 将包被瓶放入5%CO2，37℃培养箱中培养。

[0059] 步骤四．转袋

[0060] 1. 上述培养1~2天时，如图2、图3所示，当细胞基本铺满包被瓶底时，进行转袋。

[0061] 2. 用移液管吹下包被瓶中的贴壁细胞，用5ml注射器吸取新鲜培养基2ml溶解细胞因子B，加入包被瓶中，同时加入患者自体血浆2~5ml。

[0062] 3. 取培养袋，标注好患者信息。

[0063] 4. 取下培养袋管帽、50ml注射器针头和内栓。将培养袋进液口与注射器头相连。

[0064] 5. 将包被瓶中的细胞培养液倒入培养袋中；用新鲜培养基润洗包被瓶两次，将润洗液一并倒入培养袋中。

[0065] 6. 向培养袋中补加新鲜培养基至1000ml。

[0066] 7. 夹紧进液口，除去注射器，盖好管帽。

[0067] 8. 将培养袋放入5%CO2，37℃培养箱中培养。

[0068] 步骤五．补液

[0069] 1. 转袋后3-4天，如图4、图5、图6所示，细胞开始大量成团生长，此时可以适度揉动培养袋，以打散细胞团，使细胞个体能更好的与培养基中的生长因子相接触。

[0070] 2. 取下培养袋管帽、50ml注射器针头和内栓。将培养袋进液口与注射器头相连。补加新鲜培养基1000ml。

[0071] 3. 夹紧入液口。除去注射器，盖好管帽。

[0072] 4. 将培养袋放入5%CO2，37℃培养箱中培养。完成细胞扩增，待检菌后，备用。

[0073] 步骤六．检菌

[0074] 1. 补液后第二天，进行检菌。

[0075] 2. 取出培养袋，用5ml注射器由取样口吸取培养物5ml注入两个双相血培养瓶中，一瓶送与第三方进行无菌检测，一瓶用于自检。将双向血培养瓶置于37℃恒温培养箱中培养。

[0076] 3. 将培养袋放入5%CO2，37℃培养箱中培养。

[0077] 4. 双相血培养瓶培养3天后若无菌生长，证明培养袋中的培养物可以用于回输治疗。

[0078] 步骤七．回输

[0079] 1. 观察细胞生长情况，确定回输时间。

[0080] 2. 准备50ml离心管8个，标注好患者信息。

[0081] 3. 将培养物倒入50ml离心管中，剩余培养物放回培养箱继续培养。

[0082] 4. 4℃条件下，1600~2000×g离心4~5min。弃去上清，轻弹离心管管底打散细胞。

[0083] 5. 用生理盐水重悬细胞并集中到2个离心管中。

[0084] 6. 4℃条件下，1600~2000×g离心4~5min。弃去上清，轻弹离心管管底打散细胞。

[0085] 7. 用生理盐水重悬细胞并集中到1个离心管中。

[0086] 8. 4℃条件下，1600~2000×g离心4~5min。弃去上清，轻弹离心管管底打散细胞。

[0087] 9. 用生理盐水重悬细胞。

[0088] 10. 4℃条件下，1600~2000×g离心4~5min。弃去上清，轻弹离心管管底打散细胞。

[0089] 11. 用生理盐水重悬细胞。

[0090] 12. 用5ml注射器吸取一只细胞分散剂注入新的50ml离心管中。将无菌筛网放到离心管上。

[0091] 13. 用移液管吸取细胞悬液，注入装有无菌滤器的离心管中。通过滤网滤去大的细胞团。

[0092] 14. 取回输袋一个，标注好患者信息。剪开管口，连接50ml注射器，倒入细胞并加生理盐水至150ml。

[0093] 15. 用止血钳夹住管口，热合机封口。

[0094] 在操作过程中应该注意以下几点：

[0095] 1. 将血液注入细胞分离液上时，应轻柔缓慢，切勿打破界面。

[0096] 2. 培养瓶放入培养箱后应宁松瓶口使气体流通。

[0097] 3. 每天观察细胞生长状况，发现培养袋中的细胞出现细胞集落时，轻柔培养袋打散集落。防止因细胞大量聚集导致核心部的细胞死亡。

[0098] 4. 操作过程要求在万级洁净实验室的局部百级超净工作台内完成，以保证整个过程的安全无菌。

[0099] 5. 培养瓶应尽可能水平放置。

[0100] 取回输前的细胞悬液进行细胞计数，结果表明，50ml的外周血经本方法处理后，可9 11
收获细胞数约5×10~5×10 个。取某一例样品经本方法处理收获的细胞进行流式细胞+
仪检测，结果如图7~10所示。细胞群中白细胞共同抗原CD45 的细胞约占全部回输细胞的+
68.61%（见图7），其中T淋巴细胞表面抗原CD3 细胞的比例达到99%（见图8），细胞毒性T+ + + +
细胞表面抗原CD3 CD8 双阳细胞占68%（见图9），辅助性T细胞表面抗原CD3 CD4 双阳细胞占32%（见图10），由此可以看出，本发明方法培养T淋巴细胞具有非常高的收率和纯度。

[0101] 实施例二：

[0102] 本发明还可用于人脐带血中T淋巴细胞的体外诱导扩增。具体操作步骤如下：

[0103] 步骤一．血液处理

[0104] 1. 将80ml抗凝脐带血分别注入4个50ml离心管中，4℃条件下1600~2000×g离心10min。如不能马上离心，可放于4℃保存，但不能超过4小时。

[0105] 2. 弃去上层血浆。

[0106] 3. 生理盐水分别稀释4管血细胞至50ml，用移液管混匀。以上为稀释血细胞过程。

[0107] 4. 将稀释好的血细胞以1：1的比例缓慢注入每管7ml的细胞分选液上。注意不要打破界面。

[0108] 5. 20℃条件下，2200~2500×g离心20min。吸取第二层细胞于新的50ml离心管中。

[0109] 6. 向新收集的细胞中补加生理盐水至50ml，4℃条件下，1600~2000×g离心4~5min。

[0110] 7. 弃去上清。轻弹离心管管底，打散沉淀。

[0111] 8. 重复步骤6~7两次。以上为细胞分选过程。

[0112] 9. 取已包被细胞因子24小时以上的包被瓶，用生理盐水或培养基润洗一次并弃去。10. 取25ml培养基重悬细胞，用移液管充分混匀后将其移入包被瓶中。

[0113] 11. 用25ml培养基润洗离心管，将润洗液再次移入包被瓶中。

[0114] 12. 将包被瓶放入5%CO2，37℃培养箱中培养。以上为细胞诱导分化培养过程。

[0115] 步骤二．加细胞因子A

[0116] 1. 血液处理第二天，从上述培养箱中取出包被瓶，观察细胞状态。

[0117] 2. 用5ml注射器吸取新鲜培养基2ml溶解细胞因子A，注入包被瓶中。

[0118] 3. 将包被瓶放入5%CO2，37℃培养箱中培养。

[0119] 步骤三．补液

[0120] 1. 上述培养2~3天时，向包被瓶中补加新鲜培养基100ml。

[0121] 2. 将包被瓶放入5%CO2，37℃培养箱中培养。

[0122] 步骤四．转袋

[0123] 1. 上述培养1~2天时，当细胞基本铺满包被瓶底时，进行转袋。

[0124] 2. 用移液管吹下包被瓶中的贴壁细胞，用5ml注射器吸取新鲜培养基2ml溶解细胞因子B，加入包被瓶中。

[0125] 3. 取培养袋，标注好患者信息。

[0126] 后续步骤同实施例一。

[0127] 实施例三：

[0128] 本发明还可用于人胸水或腹水中T淋巴细胞的体外诱导扩增。具体操作步骤如下：

[0129] 步骤一．取胸水或腹水1000ml，4℃条件下，1600~2000×g离心4~5min。

[0130] 步骤二．弃去上清，轻弹离心管管底，打散沉淀。

[0131] 步骤三．用生理盐水漂洗细胞3次。

[0132] 步骤四．取包被瓶，用生理盐水或培养基润洗一次并弃去。

[0133] 步骤五．取25ml培养基重悬细胞，用移液管充分混匀后将其移入包被瓶中。

[0134] 步骤六．用25ml培养基润洗离心管，将润洗液再次移入包被瓶中。

[0135] 步骤七．将培养瓶放入5%CO2，37℃培养箱中培养。

[0136] 后续步骤除不再加入患者自体血浆以外，其他步骤同实施例一。

[0137] 为使本发明所述培养方法能够在规范的、标准化仪器状态下进行，对其所用试剂及试验器材进行介绍：

[0138] 其中包括：用于盛装液体的无菌离心管，50×50ml/个；用于吸放液体的无菌移液管，9×10ml/支；用于分选细胞的细胞分选液，7×7ml/管；用于诱导培养细胞的包被瓶，1瓶；用于为细胞提供生长所需营养的无血清培养基，2×1L/瓶；用于吸放液体的无菌注射器7×5ml/个；用于作为漏斗转接液体的无菌注射器，7×50ml/个；用于刺激T淋巴细胞分裂的细胞因子A，即白细胞介素-2，20万单位/支；用于作为培养细胞容器的无菌细胞培养袋，1×2L/个；用于刺激T淋巴细胞分裂的细胞因子B，即白细胞介素-2，200万单位/支；用于检菌的双向血培养瓶，2个；用于防止细胞聚集的细胞分散剂，5×2ml/支；用于过滤细胞团的无菌过滤网，5个；用于盛装细胞悬液的无菌回输袋，5×250ml/个；用于标注回输信息的标签，5个。

[0139] 上述试剂及试验器材的制备及来源如下：

[0140] 1、 包被瓶的制备：取CD3单克隆抗体、γ-干扰素、白细胞介素-1α加入到40ml磷酸盐缓冲液中，CD3单克隆抗体、γ-干扰素、白细胞介素-1α三种因子的最佳浓度比例为10:1:1，制成总浓度为1200ng/ml的混合溶液，充分混匀；将该混合溶液加入到
600ml培养瓶中，4℃静置至少24小时，制成初始包被瓶；将初始包被瓶在-40℃条件下冷冻
24小时；启动冷冻干燥机的压缩机，使机器腔室内的温度降至-40℃，将包被瓶瓶口拧松，放入干燥室；开启真空泵，使压力达到<15Pa，真空冻干20小时；打开CO2进气阀，关闭真空泵；待压力到110K后关闭CO2进气阀，取出包被瓶，拧紧盖子，封好口，4℃保存；在规定的保质期内使用。

[0141] 2、 细胞分选液的制备

[0142] 取9% Ficoll溶液720ml与33.4%泛影葡胺30ml充分混合，再向该混合液中加入7.5g的明胶，充分混匀。用高浓度的泛影葡胺或稀释的Ficoll来调整溶液的相对密度至
1.077g/ml。于121℃高压蒸汽灭菌30min，室温保存备用。

[0143] 3、 离心管和移液管均购买于美国康宁公司。注射器均购买于沈阳北华医材有限公司。

[0144] 4、磷酸盐缓冲液购买于北京中杉金桥生物技术有限公司（2000ml/袋）；CD3单克隆抗体购买于日本转基因公司（5mg/5ml/支）；白细胞介素-1α购买于美国GIBCO公司（100μg/支）；白细胞介素-2购买于北京双鹭药业股份有限公司（20万单位/支，200万单位/支）；γ-干扰素购买于山东泉港药业有限公司（100万单位/支）；细胞分散剂即人血清白蛋白，购买于德国杰特贝森生物制品有限公司（10g/50ml/瓶）；无血清培养基购买于美国GIBCO公司（1000ml/瓶）。