一种天然红色素卟啉锌的制备方法

摘要

本发明属于食品领域，公开了一种天然红色素卟啉锌的制备方法。该方法包含：(1)利用动物肝脏及心脏制备Zn2+螯合酶；(2)以原卟啉二钠、氯化血红素、血红蛋白或肌红蛋白为底物在Zn2+螯合酶催化作用下与锌离子溶液反应制备卟啉锌；(3)利用高效液相色谱对卟啉锌进行分离纯化。本发明方法制备方法简单易行，制备出的卟啉锌安全稳定、呈色效果良好。

权利要求

1. 一种天然红色素卟啉锌的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

2+

（1）Zn 螯合酶的制备：

（a）清洗牛肝、猪肝、动物心脏，称取100g均匀切碎的牛肝、猪肝、动物心脏放入已预冷的组织捣碎机中，加入等质量冷却蒸馏水将其绞碎；

（b）绞碎的肉糜在4℃下15000g条件下离心8~15min，去除上清液；

（c）下层的细胞组织用蒸馏水溶解混匀，相同条件下离心，反复操纵2~3次；

（d）得到的细胞组织沉淀，4℃储藏备用；

（2）卟啉锌的制备：

2+

（a）分别称取制备的Zn 螯合酶、原卟啉二钠和氯化锌粉末，加入蒸馏水至总体积为

2+

100mL溶解混匀,使Zn 螯合酶浓度为0.1ｇ/mL，原卟啉二钠浓度为1g/L，氯化锌浓度为

0.1g/L；

（b）混合溶液置于水浴锅中，55℃反应7h；

（c）添加1倍上述混合液体积的75%丙酮提取卟啉锌；

（3）将制备的卟啉锌采用高效液相色谱仪进行分离纯化，具体包含如下步骤：（a）设置柱温为25℃，流速为0.5mL/min，紫外/可见检测波长420nm； （b）采用pH9.0体积比为76:24的甲醇/0.01M磷酸氢二钠为洗脱液； （c）卟啉锌标准品购自Sigma公司，商品名为Zinc protoporphyrin，称取0.06g的标准品溶于100mL甲醇/0.01M磷酸氢二钠溶液即配得质量浓度为0.06%标准液，进样前用0.45μm滤膜过滤。记录仪上的基线平直后进样20μL，卟啉锌标准品的出峰时间为

8.25min；

（d）记录仪上的基线平直后，取制备的卟啉锌溶液20μL进样, 制备的卟啉锌溶液出峰时间为8.04min；

（e）收集前一次进样出峰时间为7.8~8.5min的组分，在相同的色谱条件下经过3次分离，得到纯化的卟啉锌溶液；

（4）将多次提取的卟啉锌溶液混合后经冷冻干燥得到卟啉锌粉末。

说明书

一种天然红色素卟啉锌的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于食品领域，涉及一种天然红色素卟啉锌的制备方法。

背景技术

[0002] 色泽是影响肉品质的重要指标之一，也是影响消费者购买行为的决定性因素之一。肉中主要的红色素即亚铁血红素在加工及贮藏过程中容易被氧化，肉色由鲜红色转变为棕褐色，大大降低了肉的感官品质。为使肉制品具有正常的鲜红色，改善产品的组织结构，目前国内外肉制品企业多采用硝酸盐或亚硝酸盐作为肉品的发色剂来获得理想的色泽-和风味。然而亚硝酸使用量超过一定标准会导致NO2 大量残留并与蛋白质代谢产物仲胺结合生成亚硝胺，这些亚硝基化合物均是致癌因子，对人们的饮食健康造成威胁，因此开发一种新型安全的发色剂迫在眉睫。意大利帕玛火腿，色泽嫩红，口感柔软，在不添加亚硝酸盐等发色剂的情况下就呈现出稳定的红色，其主要的呈色物质即是天然稳定的红色素卟啉锌。然而目前关于卟啉锌的合成制备研究甚少，本发明旨在制备天然红色素卟啉锌，健康安全，具有广阔的市场前景。

发明内容

[0003] 本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种天然红色素卟啉锌的制备方法。

[0004] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：

[0005] 一种天然红色素卟啉锌的制备方法，包含如下步骤：

[0006] (1)Zn2+螯合酶的制备：称取洗净的动物肝脏及心脏放入组织捣碎机中加等质量的蒸馏水绞碎，15000g条件下离心8～15min，重复2～3次后得到沉淀的细胞组织；

[0007] (2)卟啉锌的制备：称取步骤(1)中制备的Zn2+螯合酶，加入含锌离子化合物和底物后，加入蒸馏水溶解，混匀，于55～65℃反应5～7h得到卟啉锌溶液；其中所述的含锌离子化合物为氯化锌、醋酸锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌或柠檬酸锌中的一种；底物为原卟啉二钠、氯化血红素、血红蛋白或肌红蛋白中的一种；

[0008] (3)卟啉锌的分离纯化：利用高效液相色谱仪对步骤(2)中制备的卟啉锌进行分离纯化。

[0009] 其中，步骤(2)中所述的Zn2+螯合酶在蒸馏水中的终浓度优选0.1～0.3g/mL，底物在蒸馏水中的终浓度优选0.5～5g/L，含锌离子化合物在蒸馏水中的终浓度优选0.05～1.5g/L。

[0010] 所述的(2)卟啉锌的制备具体包括如下步骤：

[0011] (a)称取步骤(1)中制备的Zn2+螯合酶，底物和含锌离子化合物，加入蒸馏水溶解，2+
Zn 螯合酶在蒸馏水中的终浓度为0.1～0.3g/mL；所述的底物为原卟啉二钠、氯化血红素、血红蛋白、肌红蛋白中的一种，底物在蒸馏水中的终浓度为0.5～5g/L；锌离子粉末为氯化锌、醋酸锌、硫酸锌、葡萄糖酸锌或柠檬酸锌中的一种，含锌离子化合物在蒸馏水中的终浓度为0.05～1.5g/L；

[0012] (b)上述混合溶液置于水浴锅中，55～65℃反应5～7h；

[0013] (c)添加1～2倍上述混合液体积的75％丙酮提取卟啉锌。

[0014] 所述的(3)卟啉锌的分离纯化将制备的卟啉锌采用高效液相色谱仪进行分离纯化，具体包含如下步骤：

[0015] (a)设置柱温为25℃，流速为0.5-0.8mL/min，紫外/可见检测波长420nm；

[0016] (b)采用pH9.0体积比为76∶24的甲醇/0.01M磷酸氢二钠为洗脱液。

[0017] (c)记录仪上的基线平直后，进样20μL；

[0018] (d)收集出峰时间为7.8～8.5min的组分，经过3～4次分离纯化得到纯化的卟啉锌溶液。

[0019] 所述的动物肝脏及心脏为猪或牛的肝脏及心脏。

[0020] 该方法还包括将步骤(3)分离纯化的卟啉锌溶液混合后经冷冻干燥得到卟啉锌粉末。

[0021] 本发明的有益效果是：

[0022] 1.本发明提供了一种制备天然红色素卟啉锌的新方法。

[0023] 2.该制备方法简单易行，制备出的卟啉锌安全稳定、呈色效果良好。

[0024] 3.天然红色素卟啉锌的开发应用可避免由亚硝酸盐摄入引发的一系列健康隐患，更加安全，具有很好的经济价值及市场前景。

附图说明

[0025] 图1卟啉锌标准品在实施例1的色谱条件下的HPLC图谱。

[0026] 图2实施例1制备的卟啉锌第4次进样色谱图谱。

具体实施方式

[0027] 实施例1

[0028] 1.Zn2+螯合酶的制备

[0029] (a)清洗牛肝、猪肝、动物心脏，称取100g均匀切碎的牛肝、猪肝、动物心脏放入已预冷的组织捣碎机中，加入等质量冷却蒸馏水将其绞碎。

[0030] (b)绞碎的肉糜在4℃下15000g条件下离心8～15min，去除上清液。

[0031] (c)下层的细胞组织用蒸馏水溶解混匀，相同条件下离心，反复操纵2～3次。

[0032] (d)得到的细胞组织沉淀，4℃储藏备用。

[0033] 2.BBD响应面实验设计优化

[0034] 2.1实验方法

[0035] (a)分别称取制备的Zn2+螯合酶、氯化血红素和硫酸锌粉末，加入蒸馏水溶解至总体积为100mL，混匀；

[0036] (b)混合溶液置于水浴锅中，60℃反应6h；

[0037] (c)添加1倍上述混合液体积的75％丙酮提取卟啉锌。

[0038] (d)采用荧光分光光度法在420nm激发波长、589nm发射波长下对卟啉锌含量进行测定。

[0039] 2.2响应面分析方案设计如下：

[0040] 表1试验自变量因素编码及水平

[0041]

[0042] 表2响应面分析方案及实验结果

[0043]

[0044]

[0045] 对表2的实验结果进行响应面分析，经回归拟合，各因素对响应值的影响可以用以下公式表示：

[0046] Y＝569.69-55.48X1-7.66X2+45.46X3-24.52X1X2-130.25X1X3+52.87X2X3-276.69X122 2
-23.24X2+84.64X3

[0047] (b)进行回归模型方差分析：

[0048] 表3回归模型方差分析表

[0049]

[0050] 由响应面设计得出的最佳组合条件为酶用量0.13g/mL，氯化血红素用量为0.5g/L，硫酸锌用量为0.05g/L。

[0051] 2.3卟啉锌的分离纯化

[0052] 将在最优条件下制备的卟啉锌，采用高效液相色谱仪进行分离纯化。

[0053] (a)设置柱温为25℃，流速为0.8mL/min，紫外/可见检测波长420nm。

[0054] (b)采用甲醇/0.01M磷酸氢二钠(76∶24，v/v，pH＝9.0)为洗脱液。

[0055] (c)卟啉锌标准品购自Sigma公司，商品名为Zinc protoporphyrin，称取0.06g的标准品溶于100mL甲醇/0.01M磷酸氢二钠溶液(76∶24，v/v，pH＝9)即配得质量浓度为0.06％标准液，进样前用0.45μm滤膜过滤。记录仪上的基线平直后进样20μL，HPLC图谱见图1，由图1可见卟啉锌标准品的出峰时间为8.25min。

[0056] (d)记录仪上的基线平直后，取制备的卟啉锌溶液进样20μL进样，制备的卟啉锌溶液出峰时间为8.02min。

[0057] (e)收集前一次进样出峰时间为7.8～8.5min的组分，在相同的色谱条件下再经过3次分离，第四次HPLC分离纯化图谱见图2。

[0058] 2.4将多次提取的卟啉锌溶液混合后经冷冻干燥得到卟啉锌粉末。

[0059] 实施例22+

[0060] (1)Zn 螯合酶的制备

[0061] 同实施例1。

[0062] (2)卟啉锌的制备：2+

[0063] (a)分别称取制备的Zn 螯合酶、原卟啉二钠和氯化锌粉末，加入蒸馏水至总体积2+
为100mL溶解混匀，使Zn 螯合酶浓度为0.1g/mL，原卟啉二钠浓度为1g/L，氯化锌浓度为
0.1g/L；

[0064] (b)混合溶液置于水浴锅中，55℃反应7h；

[0065] (c)添加1倍上述混合液体积的75％丙酮提取卟啉锌，利用实施例1中记载的荧光分光光度法检测得卟啉锌浓度为985.34mg/L。

[0066] (3)卟啉锌的分离纯化：

[0067] 将制备的卟啉锌采用高效液相色谱仪进行分离纯化，具体包含如下步骤：

[0068] (a)设置柱温为25℃，流速为0.5mL/min，紫外/可见检测波长420nm；

[0069] (b)采用pH9.0体积比为76∶24的甲醇/0.01M磷酸氢二钠为洗脱液。

[0070] (c)卟啉锌标准品购自Sigma公司，商品名为Zinc protoporphyrin，称取0.06g的标准品溶于100mL甲醇/0.01M磷酸氢二钠溶液(76∶24，v/v，pH＝9)即配得质量浓度为0.06％标准液，进样前用0.45μm滤膜过滤。记录仪上的基线平直后进样20μL，卟啉锌标准品的出峰时间为8.25min。

[0071] (d)记录仪上的基线平直后，取制备的卟啉锌溶液20μL进样，制备的卟啉锌溶液出峰时间为8.04min。

[0072] (e)收集前一次进样出峰时间为7.8～8.5min的组分，在相同的色谱条件下经过3次分离，得到纯化的卟啉锌溶液。

[0073] (4)将多次提取的卟啉锌溶液混合后经冷冻干燥得到卟啉锌粉末。

[0074] 实施例3

[0075] (1)Zn2+螯合酶的制备

[0076] 同实施例1。

[0077] (2)卟啉锌的制备：

[0078] (a)分别称取制备的Zn2+螯合酶、氯化血红素和柠檬酸锌粉末，加入蒸馏水至总体2+
积为100mL溶解混匀，使Zn 螯合酶浓度为0.2g/mL，氯化血红素的浓度为3g/L，柠檬酸锌的浓度为0.8g/L；

[0079] (b)混合溶液置于水浴锅中，60℃反应5.5h；

[0080] (c)添加2倍上述混合液体积的75％丙酮提取卟啉锌，利用实施例1中记载的荧光分光光度法检测得卟啉锌浓度为673.21mg/L。

[0081] (3)卟啉锌的分离纯化：

[0082] 将制备的卟啉锌采用高效液相色谱仪进行分离纯化，具体包含如下步骤：

[0083] (a)设置柱温为25℃，流速为0.7mL/min，紫外/可见检测波长420nm；

[0084] (b)采用pH9.0体积比为76∶24的甲醇/0.01M磷酸氢二钠为洗脱液。

[0085] (c)卟啉锌标准品购自Sigma公司，商品名为Zinc protoporphyrin，称取0.06g的标准品溶于100mL甲醇/0.01M磷酸氢二钠溶液(76∶24，v/v，pH＝9)即配得质量浓度为0.06％标准液，进样前用0.45μm滤膜过滤。记录仪上的基线平直后进样20μL卟啉锌标准品的出峰时间为8.25min。

[0086] (d)记录仪上的基线平直后，取制备的卟啉锌溶液20μL进样，制备的卟啉锌溶液出峰时间为8.07min。

[0087] (e)收集前一次进样出峰时间为7.8～8.5min的组分，在相同的色谱条件下经过3次分离，得到纯化的卟啉锌溶液。

[0088] (4)将多次提取的卟啉锌溶液混合后经冷冻干燥得到卟啉锌粉末。

[0089] 实施例4

[0090] (1)Zn2+螯合酶的制备

[0091] 同实施例1。

[0092] (2)卟啉锌的制备：

[0093] (a)分别称取制备的Zn2+螯合酶、血红蛋白和醋酸锌粉末，加入蒸馏水至总体积为2+
100mL，溶解混匀使Zn 螯合酶浓度为0.3g/mL，血红蛋白的浓度为5g/L，醋酸锌的浓度为
1.5g/L；

[0094] (b)混合溶液置于水浴锅中，65℃反应5h；

[0095] (c)添加2倍上述混合液体积的75％丙酮提取卟啉锌，利用实施例1中记载的荧光分光光度法检测得卟啉锌浓度为589.54mg/L。

[0096] (3)卟啉锌的分离纯化：

[0097] 将制备的卟啉锌采用高效液相色谱仪进行分离纯化，具体包含如下步骤：

[0098] (a)设置柱温为25℃，流速为0.7mL/min，紫外/可见检测波长420nm；

[0099] (b)采用pH9.0体积比为76∶24的甲醇/0.01M磷酸氢二钠为洗脱液。

[0100] (c)卟啉锌标准品购自Sigma公司，商品名为Zinc protoporphyrin，称取0.06g的标准品溶于100mL甲醇/0.01M磷酸氢二钠溶液(76∶24，v/v，pH＝9)即配得质量浓度为0.06％标准液，进样前用0.45μm滤膜过滤。记录仪上的基线平直后进样20μL，卟啉锌标准品的出峰时间为8.25min。

[0101] (d)记录仪上的基线平直后，取制备的卟啉锌溶液20μL进样，制备的卟啉锌溶液出峰时间为8.05min。

[0102] (e)收集前一次进样出峰时间为7.8～8.5min的组分，在相同的色谱条件下经过3次分离，得到纯化的卟啉锌溶液。

[0103] (4)将多次提取的卟啉锌溶液混合后经冷冻干燥得到卟啉锌粉末。

[0104] 实施例5

[0105] (1)Zn2+螯合酶的制备

[0106] 同实施例1。

[0107] (2)卟啉锌的制备：

[0108] (a)分别称取制备的Zn2+螯合酶、肌红蛋白和硫酸锌粉末，加入蒸馏水至总体积为2+
100mL，使Zn 螯合酶浓度为0.15g/mL，肌红蛋白浓度为4g/L，硫酸锌的浓度为0.1g/L；

[0109] (b)混合溶液置于水浴锅中，55℃反应7h；

[0110] (c)添加1倍上述混合液体积的75％丙酮提取卟啉锌，利用实施例1中记载的荧光分光光度法检测得卟啉锌浓度为603.71mg/L。

[0111] (3)卟啉锌的分离纯化：

[0112] 将制备的卟啉锌采用高效液相色谱仪进行分离纯化，具体包含如下步骤：

[0113] (a)设置柱温为25℃，流速为0.8mL/min，紫外/可见检测波长420nm；

[0114] (b)采用pH9.0体积比为76∶24的甲醇/0.01M磷酸氢二钠为洗脱液。

[0115] (c)卟啉锌标准品购自Sigma公司，商品名为Zinc protoporphyrin，称取0.06g的标准品溶于100mL甲醇/0.01M磷酸氢二钠溶液(76∶24，v/v，pH＝9)即配得质量浓度为0.06％标准液，进样前用0.45μm滤膜过滤。记录仪上的基线平直后进样20μL，卟啉锌标准品的出峰时间为8.25min。

[0116] (d)记录仪上的基线平直后，取制备的卟啉锌溶液20μL进样，制备的卟啉锌溶液出峰时间为8.03min。

[0117] (e)收集前一次进样出峰时间为7.8～8.5min的组分，在相同的色谱条件下经过3次分离，得到纯化的卟啉锌溶液。

[0118] (4)将多次提取的卟啉锌溶液混合后经冷冻干燥得到卟啉锌粉末。

[0119] 实施例6

[0120] (1)Zn2+螯合酶的制备

[0121] 同实施例1。

[0122] (2)卟啉锌的制备：

[0123] (a)分别称取制备的Zn2+螯合酶、原卟啉二钠和葡萄糖酸锌粉末，加入蒸馏水至总2+
体积为100mL，使Zn 螯合酶的浓度为0.15g/L，使原卟啉二钠浓度为2g/L，葡萄糖酸锌的浓度为1g/L；

[0124] (b)混合溶液置于水浴锅中，50℃反应7h；

[0125] (c)添加2倍上述混合液体积的75％丙酮提取卟啉锌，利用实施例1中记载的荧光分光光度法检测得卟啉锌浓度为746.52mg/L。

[0126] (3)卟啉锌的分离纯化：

[0127] 将制备的卟啉锌采用高效液相色谱仪进行分离纯化，具体包含如下步骤：

[0128] (a)设置柱温为25℃，流速为0.8mL/min，紫外/可见检测波长420nm；

[0129] (b)采用pH9.0体积比为76∶24的甲醇/0.01M磷酸氢二钠为洗脱液。

[0130] (c)卟啉锌标准品购自Sigma公司，商品名为Zinc protoporphyrin，称取0.06g的标准品溶于100mL甲醇/0.01M磷酸氢二钠溶液(76∶24，v/v，pH＝9)即配得质量浓度为0.06％标准液，进样前用0.45μm滤膜过滤。记录仪上的基线平直后进样20μL，卟啉锌标准品的出峰时间为8.25min。

[0131] (d)记录仪上的基线平直后，取制备的卟啉锌溶液20μL进样，制备的卟啉锌溶液出峰时间为8.06min。

[0132] (e)收集前一次进样出峰时间为7.8～8.5min的组分，在相同的色谱条件下经过3次分离，得到纯化的卟啉锌溶液。

[0133] (4)将多次提取的卟啉锌溶液混合后经冷冻干燥得到卟啉锌粉末。