鉴别蛇皮果性别的DNA片段、引物和方法

摘要

本发明公开了一种鉴别蛇皮果性别的DNA片段、引物和方法。鉴定蛇皮果性别的DNA特异性片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。鉴别引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。鉴定方法是用鉴别引物作为扩增引物，以样品的基因组DNA作为模板进行PCR反应，将PCR产物进行电泳检测，电泳结果中出现一段1579bp条带的样品为雄株，而相同部位没有出现条带的样品为雌株。本发明的引物和鉴定方法能够准确的鉴别出蛇皮果的雌雄性别，相比于传统的肉眼鉴定蛇皮果植株性别，本发明具有简单，方便，随时都可以鉴定的优点，为更有效、合理的种植蛇皮果创造了条件。

权利要求

1.鉴定蛇皮果性别的DNA特异性片段，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.鉴别蛇皮果性别的鉴定引物，其特征在于，由LF4：5′-AGCACAGCCTAGTTAGTT-3′和LR4：5′-TGACACCTCCTCCCATAT-3′组成。

3.一种蛇皮果性别鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：常规提取蛇皮果样品的基因组DNA，以其作为模板，以LF4：5′-AGCACAGCCTAGTTAGTT-3′，LR4：

5′-TGACACCTCCTCCCATAT-3′作为引物进行PCR反应，将PCR产物进行电泳检测，电泳结果中出现一段1579bp条带的样品为雄株，而相同部位没有出现条带的样品为雌株。

4.根据权利要求3所述的蛇皮果性别鉴定方法，其特征在于，所述的PCR反应为：PCR反应体系为15μL，反应液中含10×buffer 1.5μL、dNTPs 0.12mmol/L、Taq DNA聚合酶

0.10U/μL、MgCl2 1.4mmol/L、引物LF4和引物LR4各0.3μmol/L、12ng蛇皮果基因组DNA模板；反应程序为：94℃预变性2分钟；94℃30秒、39℃30秒、72℃2分钟，40个循环；72℃延伸10分钟。

说明书

鉴别蛇皮果性别的DNA片段、引物和方法

技术领域：

[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及鉴别蛇皮果性别的DNA片段、引物和方法。背景技术：

[0002] 蛇皮果(Salacca zalacca)是一种果形独特、果肉富含钙铁、果实采摘方便、适合我国海南和云南栽培的热带果树。有性繁殖是蛇皮果繁殖的重要方式，然而蛇皮果是雌雄异株植物，有性繁殖生产的实生苗肉眼难以鉴定其性别。性别不明的实生苗造林后容易造成雌株分布不均、修复成本高和单产低等后果。传统肉眼鉴定蛇皮果植株性别需要等待植株开始繁殖生长，而蛇皮果植株初次繁殖生长时间的年龄在海南和云南为3年。2009年印尼有报道称可利用同工酶来鉴定蛇皮果实生苗的性别，但该技术的具体步骤和过程资料难以取到，因此国内生产上还不能对蛇皮果实生苗性别进行鉴别，实生苗造林的后果还是难以避免。发明内容：

[0003] 本发明的目的是提供一种用以鉴别蛇皮果雌雄性别的DNA片段、引物和方法。

[0004] 本发明运用RAPD方法在雄性蛇皮果基因组中扩增出一条雄性蛇皮果所特有的特异性条带，通过克隆和测序获得一段长度为1638bp的DNA片段，具体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该DNA片段可以用以鉴别蛇皮果的雌雄性别。本发明人根据该特异性的DNA片段设计了一对蛇皮果雌雄性别鉴定引物：

[0005] LF4：5′-AGCACAGCCTAGTTAGTT-3′，序列如SEQ ID NO.2所示；

[0006] LR4：5′-TGACACCTCCTCCCATAT-3′，序列如SEQ ID NO.3所示。

[0007] 根据该对蛇皮果雌雄性别鉴定引物能够扩增出一条雄性蛇皮果拥有的特异性序列，其长度为1579bp。

[0008] 本发明的蛇皮果性别鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：常规提取蛇皮果样品的基因组DNA，以其作为模板，以LF4：5′-AGCACAGCCTAGTTAGTT-3′，LR4：5′-TGACACCTCCTCCCATAT-3′作为引物进行PCR反应，将PCR产物进行电泳检测，电泳结果中出现一段1579bp条带的样品为雄株，而相同部位没有出现条带的样品为雌株。

[0009] 所述的PCR反应优选为：PCR反应体系为15μL，反应液中含10×buffer 1.5μL、dNTPs 0.12mmol/L、Taq DNA聚合酶0.10U/μL、MgCl2 1.4mmol/L、引物LF4和引物LR4各0.3μmol/L、12ng蛇皮果基因组DNA模板；反应程序为：94℃预变性2分钟；94℃30秒、
39℃30秒、72℃2分钟，40个循环；72℃延伸10分钟。

[0010] 本发明提供的如SEQ ID NO.1所示的DNA序列为雄性蛇皮果所特有的特异性DNA序列，可以用于鉴定蛇皮果的雌雄性别。实验结果表明，本发明的鉴定引物和鉴定方法能够准确的鉴别出蛇皮果的雌雄性别，相比于传统肉眼鉴定蛇皮果植株性别需要等待植株开始繁殖生长才能鉴定，本发明具有简单，方便，随时都可以鉴定的优点，为更有效、合理的种植蛇皮果创造了条件。附图说明：

[0011] 图1是实施例1的RAPD产物的电泳图，其中1～10为雌性蛇皮果实生苗，11～20为雄性蛇皮果实生苗；

[0012] 图2是实施例2的PCR产物的电泳图，其中1～10为雌性蛇皮果实生苗，11～20为雄性蛇皮果实生苗。具体实施方式：

[0013] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0014] 实施例1：

[0015] 以已确定性别的雌雄蛇皮果各10株作为样品，按照下述方法提取基因组DNA，进行RAPD扩增和电泳。

[0016] 步骤1：叶片采集

[0017] 以蛇皮果实生苗直立未展叶为第1叶，往下数第3叶的叶片作为采集叶，在该叶上取5厘米×5厘米的叶片，拭去叶样表面灰尘和水分，并放至塑料袋里，然后将塑料袋密封并放至冰袋。

[0018] 步骤2：基因组DNA提取

[0019] 在10毫升离心管中加入4毫升2％CTAB提取液(CTAB20克/升、NaCl 81.816克/升、EDTA9.306克/升、Tris-HCl 12.114克/升、pH8.0)后再加入2％β-巯基乙醇和5％PVP-40，65℃保温。称取蛇皮果叶样1.2克，将叶样剪碎，放入研钵，加液氮研磨至粉末状。将研磨好的叶样加入预热的提取液中，封口，65℃保温60分钟，每隔10分钟摇动1次。
将样品11000转/分钟离心10分钟，取上清液。上清液中加入氯仿∶异戊醇(24∶1)4毫升，摇匀，11000转/分钟离心10分钟，取上清液；重复1次本步骤。向上清液中2毫升5摩尔/升NaCl，然后再加入4℃冷藏的2毫升异丙醇，轻轻晃动混匀，-20℃下静置1小时以上。取冷冻液，11000转/分钟离心10分钟，倒掉上清液，加入2毫升无水乙醇洗两次，洗后将管倒置于卫生纸上吸干，在真空浓缩仪中干燥5分钟左右。加入1毫升1×TE，溶解沉淀的DNA即为蛇皮果基因组DNA，弹动或震荡以充分溶解，放入冰箱备用。DNA浓度测定通过与100bp DNA Ladder的500bp片段亮度对比进行。

[0020] 步骤3：PCR扩增(RAPD)

[0021] 将1.0微摩尔/升已知10个碱基序列为“CCTGGGTCAG”的引物，加入15微升的反应液中，该反应液含10×buffer 1.5微升、dNTPs 0.12毫摩尔/升、Taq DNA聚合酶0.10U/微升、MgCl21.4毫摩尔/升、RAPD随机引物、12纳克蛇皮果基因组DNA模板，94℃预变性2分钟，再完成94℃30秒、39℃30秒和72℃2分钟的循环40个，最后在72℃下再延伸10分钟，由此得到PCR产物。

[0022] 步骤4：电泳

[0023] 制备含有Gold ViewTM 0.05微摩尔/升的1.2％琼脂糖凝胶，将2微升溴酚蓝和10微升步骤3中的PCR产物混匀，加入到点样孔中，再把点好样的琼脂糖凝胶放在电泳仪上，加入0.5×TBE缓冲液，在150伏电压下电泳45分钟。

[0024] 电泳结果如图1所示，从图1可以看出，在1638bp的位置，10株雄性蛇皮果(11～20)具有一个特异性条带，而10株雌性蛇皮果(1～10)则没有该条带，由此说明该特异性条带可以用于鉴别雌雄蛇皮果，将该特异性条带送去测序，其序列如SEQ ID NO.1所示。

[0025] 实施例2：

[0026] 以SEQ ID NO.1所示的特异性DNA片段设计一对蛇皮果雌雄性别鉴定引物：LF4：5′-AGCACAGCCTAGTTAGTT-3′，LR4：5′-TGACACCTCCTCCCATAT-3′。以实施例
1的蛇皮果样品的基因组DNA作为模板，以LF4：5′-AGCACAGCCTAGTTAGTT-3′，LR4：
5′-TGACACCTCCTCCCATAT-3′作为引物进行PCR扩增反应。PCR扩增反应体系为：15μL的反应液中含10×buffer 1.5μL、dNTPs 0.12mmol/L、Taq DNA聚合酶0.10U/μL、MgCl21.4mmol/L、引物LF4和LR4各0.3μmol/L、12ng蛇皮果基因组DNA模板，94℃预变性
2分钟，再完成94℃30秒、39℃30秒和72℃2分钟的循环40个，最后在72℃下再延伸10分钟，由此获得PCR产物。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，其电泳图如图2所示，由图2可以看出10株雌性蛇皮果(1～10)在1579bp位置没有条带，而10株雄性蛇皮果(11～
20)在1579bp位置有一个特异条带。这表明本发明设计的引物和方法能够用于蛇皮果雌雄性别鉴定。