一种重组人源胶原蛋白及其制备方法

摘要

本发明公开了一种重组人源胶原蛋白，氨基酸序列如SEQNO.3，其含有599个氨基酸，分子量为55.0kDa。其制备方法为：表达重组人源胶原蛋白基因工程菌的构建，得到巴氏毕赤酵母基因工程菌；对基因工程菌进行发酵培养，实现重组人源胶原蛋白的诱导表达，得到含有重组人源胶原蛋白的发酵液；从发酵液中纯化重组人源胶原蛋白。本发明设计的人源胶原蛋白基因Ge1是全新的序列，且长度上大大少于天然人胶原蛋白基因(数Kbp)，实现了在分子水平的操作简单化，更易实现胶原蛋白的基因工程菌发酵生产；该人源胶原蛋白基因Ge1同时包含天然人胶原蛋白基因的特征，其表达的蛋白将具有天然人胶原蛋白的优良特征。

权利要求

1.氨基酸序列如SEQ NO.3所示的重组人源胶原蛋白的制备方法，其特征在于，一、表达重组人源胶原蛋白基因工程菌的构建如下：

1) 基于人Ⅲ型胶原蛋白α1链胶原域Gly-X-Y的三肽重复序列特征，设计并人工合成一段人源胶原蛋白基因单体，其核苷酸序列如SEQ NO.1；然后通过体外酶切连接，利用大肠杆菌作为克隆宿主，构建含有同向六串联人源胶原蛋白基因单体的表达载体，该同向六串联人源胶原蛋白基因单体的核苷酸序列如SEQ NO.2；

2) 将重组表达载体转入巴氏毕赤酵母进行重组人源胶原蛋白的表达，得到的巴氏毕赤酵母基因工程菌，其已在保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO. 5021；

二、基因工程菌的发酵培养条件及重组人源胶原蛋白诱导表达条件为：

1）将种子培养基培养的工程菌按10%接种量加入含分批发酵培养基发酵罐中开 始培养，调节搅拌转速为500 r/min -800 r/min 、罐压为0.2-1.0bar、空气流量为200 In/h -300 In/h，使溶氧>30%，-5

其中种子培养基配方为：100mM pH6.0的磷酸缓冲液，1.34％YNB，4×10 ％生物素，

1％V/V甘油，

而且，其中分批发酵培养基配方为：85% H3PO4 26.7ml/L；CaSO 4 0.93g/L；K2SO4

18.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油 40.0g/L，灭菌后再加入PTM1微量元素；其中PTM1微量元素为：CuSO4·5H2O 6.0g/L；NaI 0.08g/L；MnSO4·H2O 3.0g/L；NaMoO4·2H2O 0.2g/L；H3BO3 0.02g/L；CoCl2 0.5g/L；ZnCl2 20.0g/L；FeSO4·7H2O

65.0g/L；生物素 0.2g/L；H2SO4 5.0ml/L，用0.22μm的滤膜过滤除菌，室温保存；

2）当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加补料生长培养基，流加速率为维持溶氧>20%，至菌体湿重达180~220g/L，停止补加甘油，其中补料生长培养基配方为：50%W/V甘油，每升含12mL的PTM1微量元素；

3）甘油耗尽后补入发酵诱导培养基进行诱导表达，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧>20%，诱导发酵96-120h后，结束发酵，收集发酵液，其中发酵诱导培养基配方为：100%甲醇，每升含12mL的PTM1微量元素；

三、重组人源胶原蛋白的提取纯化如下

对发酵液进行离心分离，收集上清液，上清液经滤膜过滤后，用Sephadex G100凝胶柱层析分离纯化，再经冷冻干燥得到成品。

2.权利要求1所述的方法，该方法制备的重组人源胶原蛋白产量达到16g/L。

3.巴氏毕赤酵母基因工程菌在权利要求1或2所述的方法中的应用，其中所述巴氏毕赤酵母基因工程菌已在保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO. 5021。

说明书

一种重组人源胶原蛋白及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，特别是一种高亲水性重组人源胶原蛋白及其制备方法。

背景技术

[0002] 胶原蛋白(也称胶原)是动物体中含量最丰富的一类蛋白质家族。胶原蛋白具有很强的生物活性及生物功能，能参与细胞的迁移、分化和繁殖，使结缔组织具有机械强度，同时胶原蛋白还能促进细胞生长，具有止血、生物相容性和生物降解性能。基于这些特性，胶原蛋白在烧伤、创伤、眼角膜疾病、保健、美容、矫形、硬组织修复、创面止血、药物传递、缓释技术等医药卫生领域有着广泛的应用。另外，胶原蛋白也可作为食品添加剂、饲料添加剂、絮凝剂、照相乳胶材料、表面活性剂和固定化酶载体材料等应用于各个工业和实验室领域。

[0003] 目前，胶原蛋白的生产主要是利用酸、碱法处理动物来源的组织(猪皮、牛皮、驴皮、鱼皮等)，从中提取胶原蛋白。但所得到的产品成分复杂，主要应用于饲料添加及微生物发酵培养基。四川铭让生物科技有限公司采用生物酶定向剪切技术，生产的胶原蛋白组成稳定，具有生物活性。但以上这些方法得到的胶原蛋白产品都有一定的病毒隐患(如疯牛病、口蹄疫、猪瘟疫、禽流感等)，特别是应用于人体时易引起异体异种的排异反应，从而限制了胶原蛋白在医药方面的应用。

[0004] 随着DNA重组技术迅速发展，为了能充分利用胶原蛋白的优良特性，科研工作者开始寻求动物本身以外的胶原蛋白来源。有许多学者利用基因工程技术.选用各种宿主细胞(包括：哺乳动物、昆虫、酵母、大肠杆菌、转基因烟草、转基因鼠、转基因蚕细胞等)，生产重组人胶原蛋白，产品具有安全性好、重现性好、质量稳定等优点。但是，同样存在着许多不足和困难。例如日本广岛大学的Tomita利用转基因蚕的绢丝腺分泌生产人胶原蛋白，生产的人胶原蛋白长度仅有真正的人胶原蛋白全长的1/5，且含量只有1％左右。总体来说，表达量不高、生产周期长和培养难度大、成本高是以高等动植物细胞为宿主时普遍存在的问题，且不能满足产业化、大批量生产的要求。国内有利用大肠杆菌生产类人胶原蛋白的报道(一种类人胶原蛋白及其生产方法，发明人：范代娣，公开号：CN1371919A，公开日：2002年10月2日，中华人民共和国国家知识产权局)。而细菌表达系统普遍存在产生致热原使表达产物难以应用于临床，蛋白常以包涵体形式表达，致产物纯化困难，及其原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低等不足。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种利用巴氏毕赤酵母进行表达的重组人源胶原蛋白，其具有优于动物体胶原蛋白的独特的化学结构和性能，同时提供该重组人源胶原蛋白的制备方法。

[0006] 实现本发明目的的技术解决方案为：一种重组人源胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ NO.3，其含有599个氨基酸，分子量为55.0kDa。

[0007] 一种重组人源胶原蛋白的制备方法，步骤如下：

[0008] (1)表达重组人源胶原蛋白基因工程菌的构建，得到巴氏毕赤酵母基因工程菌；

[0009] (2)对基因工程菌进行发酵培养，实现重组人源胶原蛋白的诱导表达，得到含有重组人源胶原蛋白的发酵液；

[0010] (3)从发酵液中纯化重组人源胶原蛋白。

[0011] 本发明与现有技术相比，其显著优点：(1)设计的人源胶原蛋白基因Gel是全新的序列，且长度上大大少于天然人胶原蛋白基因(数Kbp)，实现了在分子水平的操作简单化，更易实现胶原蛋白的基因工程菌发酵生产；(2)该人源胶原蛋白基因Gel同时包含天然人胶原蛋白基因的特征，其表达的蛋白将具有天然人胶原蛋白的优良特征；(3)在人源胶原蛋白的分子长度方面，通过制备不同重复数同向串联基因重组质粒，可在进一步的酵母表达研究中实现接近较大的分子量的天然人胶原蛋白的重组人源胶原蛋白的表达生产；(4)该种不同重复数同向串联基因重组质粒的制备方法，仅仅通过简单的体外酶切连接反应和具有成熟技术的原核转化和筛选，实现了任意重复数的目的基因(重组人源胶原蛋白基因Gel)的串联连接；(5)该法比较现有的许多应用PCR技术实现重复更具有可行性和更易获得成功.避免了达到重复串联目的基因的PCR操作中需要的高难度的引物设计和条件探索工作；(6)可诱导表达的毕赤酵母工程菌能实现重组人源胶原蛋白在胞内和胞外的高水平表达，其培养易于放大，并可利用高密度发酵方式高产目的蛋白，分泌表达有利于表达产物的分离纯化，降低生产成本，且其对所表达的外源蛋白有一定的翻译后修饰功能，如糖基化等。

[0012] 下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

附图说明

[0013] 图1是重组人源胶原蛋白的SDS-PAGE检测。

[0014] 图2是纯化过程中的凝胶过滤层析图谱。

[0015] 图3是纯化效果验证用凝胶过滤层析图谱。

[0016] 图4是重组人源胶原蛋白的质谱分析。

[0017] 图5是重组人源胶原蛋白的紫外光谱。

[0018] 图6是重组人源胶原蛋白的红外光谱。

[0019] 图7是重组人源胶原蛋白的扫描电镜。

[0020] 图8是重组人源胶原蛋白海绵促NIH3T3细胞生长趋势。

具体实施方式

[0021] 本发明的重组人源胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ NO.3，其含有599个氨基酸，分子量为55.0kDa。

[0022] 上述重组人源胶原蛋白的制备方法，步骤如下：

[0023] (1)表达重组人源胶原蛋白基因工程菌的构建，得到巴氏毕赤酵母基因工程菌，其巴氏毕赤酵母基因工程菌的构建如下：

[0024] 1)基于人III型胶原蛋白α1链胶原域Gly-X-Y(甘氨酸-X-Y)的三肽重复序列特征，设计并人工合成一段人源胶原蛋白基因单体Gel，其核苷酸序列如SEQNO.1；然后通过体外酶切连接，利用大肠杆菌作为克隆宿主，构建含有同向六串联人源胶原蛋白基因单体的表达载体，该同向六串联人源胶原蛋白基因单体的核苷酸序列如SEQ NO.2；

[0025] 2)将重组表达载体转入巴氏毕赤酵母进行重组人源胶原蛋白的表达，得到的巴氏毕赤酵母基因工程菌已在保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.5021。分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichia Pastoris，保藏日期为2011年6月29日，保藏单位的地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

[0026] 上述巴氏毕赤酵母基因工程菌的构建具体过程如下。

[0027] ①设计重组人源胶原蛋白基因单体(Gel)

[0028] 其碱基序列如图1(SEQ NO.1)。其核酸长度为322bp，命名为Gel。该单体克隆在质粒pUC57的SmaI位点，得到的重组质粒命名为pUC57Gel。选择的一对同尾酶为DraIII和Van91I，位于重组人源胶原蛋白基因单体(Gel)的两端。设计接头A1和A2，其中A1含有的酶切位点为EcoRI和DraIII，A2含有的酶切位点为Not I和Van91I。选择的表达质粒为pPIC9K。

[0029] ②将用一对同尾酶酶切得到的目的基因单体进行体外连接

[0030] 将重组质粒pUC57Gel采用CaCl2法转化大肠杆菌DH5α，经过含Amp的LB平板筛选得到含有质粒pUC57Gel的重组大肠杆菌，命名为DH5α/pUC57Gel。液体LB培养基过夜培养DH5α/pUC57Gel。提取质粒，得到大量的pUC57Gel。以一对同尾酶DraIII和Van9lI双酶切质粒pUC57Gel，电泳回收约300bp的小片段，获得大量人源胶原蛋白基因单体，将这部分人源胶原蛋白基因单体用T4DNA连接酶进行连接，4℃过夜，得到含有不同重复数胶原蛋白基因单体的连接体。

[0031] ③利用接头将步骤2得到的连接产物，直接连入已含有目的基因单体的质粒.获得重复数较少的重组质粒

[0032] 将步骤2得到连接产物加入到含有pUC57Gel的EcoRI/DraIII双酶切后电泳回收得到的大片段和EcoRI酶切回收的复性接头A1的连接体系中，4℃过夜连接。连接产物采用CaCl2法转化大肠杆菌Top10F’，经过含Amp的LB平板筛选阳性克隆，经过提取筛选到的阳性克隆的质粒并进行酶切电泳检验含有质粒的长度判断得到的重组大肠杆菌所含有的质粒中包含类人胶原蛋白基因单体的重复数，主要出现包含有2、3、4重复数的重组质粒的大肠杆菌。将含有重复数为3的质粒定名为pUC57A1G3，含有该pUC57A1G3质粒的重组大肠杆菌命名为Top10F’/pUC57A1G3。

[0033] ④将重复数较少的质粒进行重复数翻倍的连接，获得含有目的基因的重复数较高的重组质粒

[0034] 液体LB培养基过夜培养Top10F’/pUC57A1G3，提取质粒，得大量的pUC57A1G3。以限制性内切酶EcoRI和Van9lI双酶切质粒pUC57A1G3，电泳回收约900bp的小片段，获得大量人源胶原蛋白基因三联体DNA片段。另外以限制性内切酶EcoRI和DraIII双酶切质粒pUC57A1G3，电泳回收大片段，得到含有3重复人源胶原蛋白基因单体的A1G3质粒大片段。将上述回收得到的两种片断用T4DNA连接酶连接，4℃过夜，得到的连接产物直接采用CaCl2法转化大肠杆菌Top10F’，经过含Amp的LB平扳筛选得到含有pUC57A1G6(含有6个人源胶原蛋白基因单体重复的重组质粒)的重组大肠杆菌，命名为Top10F’/pUC57A1G6。

[0035] ⑤将构建好的适当重复数的串联基因克隆到选定的表达质粒中，获得可以转化宿主细胞用于表达的重组质粒

[0036] 液体LB培养基过夜培养Top10F’/pUC57A1G6，提取质粒，得到大量的DUC57A1G6。以限制性内切酶EcoRI和Van91I双酶切质粒pUC57A1G6，电泳回收约1800bp的小片段，获得大量人源胶原蛋白基因六联体DNA片段。加入到含有pPIC9K的EcoRI/NotI双酶切后电泳回收得到的大片段和NotI酶切回收的复性接头A2的连接体系中，4℃过夜连接。得到的连接产物直接采用CaCl2法转化大肠杆菌Top10F’，经过含Amp的LB平板筛选得到含有pPIC9KG6(含有6个人源胶原蛋白基因单体重复以及接头A1和A2的重组表达质粒)的重组大肠杆菌，命名为Top10F’/pPIC9KG6。再以液体LB培养基过夜培养TOp10F’/pPIC9KG6，提取质粒.即得到大量可用于转化毕赤酵母(Pichia Pastoris)的pPIC9KG6质粒。

[0037] ⑥转化巴氏毕赤酵母

[0038] 将上述成功构建的表达载体用SacI对其进行线性化，转化GS115之后，在MD平板+上得到甲醇利用快型(Mut)重组酵母。通过菌落PCR，可以初步确定，线性化的pPIC9KG6已经转化进毕赤酵母GS115，并同源重组入GS115的染色体。

[0039] 电转化后每块MD平板有几十个单菌落，影印到含不同浓度G418的YPD平板，得到抗G418浓度为4.00g/L的多拷贝重组酵母6株。选用其中一株进行表达实验。

[0040] ⑦SDS-PAGE检测

[0041] 随后对重组酵母的表达产物进行SDS-PAGE检测分析，结果显示重组人源胶原蛋白以单体(图1，条带1，左箭头所指)和二聚体形式存在(图1，条带1，中间箭头所指)于发酵上清液中，这与天然胶原蛋白的特性相似。

[0042] 本发明的重组人源胶原蛋白，其基因的核苷酸序列见SEQ NO.2，其氨基酸序列见SEQ NO.3。编码此重组人源胶原蛋白的基因是以人III型胶原蛋白为母体模型，在其胶原域的氨基酸序列基础上，以改善胶原蛋白水溶性和提高表达量为目的，保持胶原蛋白的特征设计合成的全新基因序列。其所对应的蛋白质全部由Gly-X-Y三肽重复序列构成，各种氨基酸的含量接近于天然人胶原蛋白，但是相互排列顺序有所改变，且除了Pro之外的憎水性氨基酸(如Trp、Tyr、Phe、Leu、Ile、Val、Met等)被替换为亲水性氨基酸(如Asp、Asn、Glu、Gln等)，以提高重组人源胶原蛋白的亲水性，因此具有优于动物体胶原蛋白的独特的化学结构和性能。

[0043] (2)对基因工程菌进行发酵培养，实现重组人源胶原蛋白的诱导表达，得到含有重组人源胶原蛋白的发酵液；

[0044] 基因工程菌的培养基为：

[0045] 1)种子培养基(BMG)：100mM磷酸缓冲液(pH6.0)，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油(V/V)。

[0046] 2)分批发酵培养基(BSM)：85％H3PO4 26.7ml/L；CaSO4 0.93g/L；K2SO418.2g/L；MgSO4·7H2O 14.9g/L；KOH 4.13g/L；甘油40.0g/L，灭菌后再加入PTM1微量元素。其中PTM1微量元素：CuSO4·5H2O 6.0g/L；NaI 0.08g/L；MnSO4·H2O 3.0g/L；NaMoO4·2H2O 0.2g/L；
H3BO3 0.02g/L；CoCl2 0.5g/L；ZnCl2 20.0g/L；FeSO4·7H2O 65.0g/L；生物素0.2g/L；H2SO4
5.0ml/L，用0.22μm的滤膜过滤除菌，室温保存。

[0047] 3)补料生长培养基：50％(W/V)甘油，每升含12mL的PTM1微量元素。

[0048] 4)发酵诱导培养基：100％甲醇，每升含12mL的PTM1微量元素。

[0049] 基因工程菌的发酵培养条件及重组人源胶原蛋白诱导表达条件为：

[0050] 采用分批-补料培养方法，培养温度28℃，pH5.0，即1)将BMG培养菌种(接种量10％)加入含分批发酵培养基发酵罐中开始培养，调节搅拌转速为500r/min-800r/min、罐压为0.2-1.0bar、空气流量为200In/h-300In/h，使溶氧(DO)＞30％。2)当碳源耗尽后，溶氧陡然上升，开始流加补料生长培养基(流加速率为维持溶氧＞20％)，至菌体湿重达
180～220g/L，停止补加甘油。3)甘油耗尽后补入发酵诱导培养基进行诱导表达，通过调节转速、罐压、空气流量和流加甲醇速度使溶氧＞20％，诱导发酵约96-120h后，结束发酵，收集发酵液。

[0051] 发酵实验结果：重组人源胶原蛋白产量高达16g/L。

[0052] 本发明利用巴氏毕赤酵母基因工程菌进行重组人源胶原蛋白生产，使用了毕赤酵母偏好密码子以保证重组人源胶原蛋白的高表达；采用上述优化的发酵条件和甲醇流加策略进一步提高产量。

[0053] (3)从发酵液中纯化重组人源胶原蛋白，重组人源胶原蛋白的提取纯化如下：对发酵液进行离心分离，收集上清液，上清液经滤膜过滤后，用Sephadex G100凝胶柱层析分离纯化，再经冷冻干燥得到成品。上述重组人源胶原蛋白的纯化的具体实施过程为：

[0054] 1)对发酵液进行离心(8000r/min)分离，收集上清液，上清液再经滤膜过滤。

[0055] 2)在凝胶过滤层析柱上对上清液经上样、洗脱步骤，收集含重组人源胶原蛋白的洗脱峰(图2，箭头所指；SDS-PAGE检测见图1，条带3)；结果显示经此纯化后，得到重组人源胶原蛋白二聚体，表观分子量为120.0kDa(图1，条带3，箭头所指)，接近其理论分子量(110.0kDa)。其回收率达到93.6％，纯度达到99.5％。

[0056] 3)为验证上述结论，对经上述步骤纯化的样品再次用Sephadex G100凝胶进行过滤层析，结果见图3。图3显示经上述步骤纯化的样品再次进行凝胶过滤层析后仍然只有一个峰，且未出现任何电导率峰，证明样品中既无杂蛋白也无小分子物质或离子，上述纯化方案的效果得到验证。

[0057] 4)经冷冻干燥收集目的蛋白。

[0058] 本发明的巴氏毕赤酵母基因工程菌所表达的杂蛋白含量少，利于重组人源胶原蛋白的分离纯化。

[0059] 本发明的重组人源胶原蛋白的水溶性检测：对重组人源胶原蛋白的水溶性检测实验显示，室温下，重组人源胶原蛋白在水中的饱和浓度达到40.06g/L，远高于天然动物来源产品(7.63g/L)。

[0060] 本发明的重组人源胶原蛋白的结构表征：对分离纯化后的重组人源胶原蛋白进行氨基酸分析(重组人源胶原蛋白的氨基酸分析见表1)，结果显示重组人源胶原蛋白氨基酸组成的检测值与其理论值一致。

[0061] 表1重组人源胶原蛋白的氨基酸分析

[0062]

[0063] 质谱分析(图4)结果显示重组人源胶原蛋白单体分子量为56460.056Da，二聚体分子量为112920.339Da，理论上设计的重组人源胶原蛋白含有599个氨基酸，分子量为55.0kDa，实际的精确分子量(56460.056Da)比理论值略大，可归因于毕赤酵母对分泌蛋白进行了O-连接及N-连接的糖基化修饰。

[0064] 重组人源胶原蛋白紫外光谱扫描(图5)显示其与天然胶原蛋白具有相同的紫外吸收。

[0065] 从红外光谱(图6)中的酰胺A、酰胺B、酰胺I、酰胺II、酰胺III的波数可判断重组人源胶原蛋白与天然胶原蛋白具有相似的结构特征。

[0066] 扫描电镜(图7)显示重组人源胶原蛋白呈海绵状结构，预示其具备作为生物医学材料的潜质。

[0067] 本发明的重组人源胶原蛋白对细胞生长的促进作用：MTT检测(MTT检测实验数据见表2)：实验结果显示：一定浓度的重组人源胶原蛋白海绵和猪皮胶原蛋白海绵与NINH3T3细胞具有很好的相容性，能够促进NIH3T3细胞的生长；在10mg/mL浓度以下，浓度由低到高时，重组人源胶原蛋白海绵(图8，趋势线a)和猪皮胶原蛋白海绵(图8，趋势线b)促进NIH3T3细胞的生长趋势是逐渐升高。

[0068] 表2MTT检测实验数据

[0069]