一种提高天蓝淡红链霉菌柔红霉素产量的方法转让专利
申请号 : CN201010514324.9
文献号 : CN102453708B
文献日 : 2014-11-19
发明人 : 胡又佳 , 殷承慧 , 朱春宝 , 朱宝泉 , 袁天杰 , 张伟
申请人 : 上海医药工业研究院
摘要 :
本发明公开了一种提高天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)的柔红霉素产量的方法，包括以下步骤：1)构建dauW基因敲除质粒，其含有dauW基因同源重组左臂、标记基因和dauW基因同源重组右臂；2)将步骤1)所得的dauW基因敲除质粒接合转移入天蓝淡红链霉菌，制备天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除(knockout)工程菌；3)培养步骤2)所得的天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除工程菌，从培养物中分离柔红霉素。本发明还提供该天蓝淡红链霉菌的dauW基因阻断突变菌及其制备方法。dauW基因被敲除，dauW基因的表达被完全阻断，而所得的天蓝淡红链霉菌柔红霉素的产量却大大提高，比dauW基因被插入非完全阻断的产量还高，从而为柔红霉素产量的提高提供一个更直接、有效的途径。
权利要求 :
1.一种提高天蓝淡红链霉菌（Streptomyces coeruleorubidus）的柔红霉素产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）构建dauW基因敲除质粒，其含有dauW基因同源重组左臂、标记基因和dauW基因同源重组右臂，所述的dauW基因同源重组左臂的序列是Genbank数据库登录号M73758的第
208位到第2334位所示的序列，所述的dauW基因同源重组右臂的序列是Genbank数据库登录号AF048833的第140位到第2218位所示的序列，所述标记基因是安普霉素抗性基因apr；所述的dauW基因敲除质粒的质粒骨架是大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pJTU870；
2）将步骤1）所得的dauW基因敲除质粒接合转移入天蓝淡红链霉菌（Streptomyces coeruleorubidus）SIPI-1482，制备天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除工程菌；
3）培养步骤2）所得的天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除工程菌，从培养物中分离柔红霉素。
2.一种制备天蓝淡红链霉菌（Streptomyces coeruleorubidus）的dauW基因阻断突变菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：a）构建dauW基因敲除质粒，其含有dauW基因同源重组左臂、标记基因和dauW基因同源重组右臂，所述的dauW基因同源重组左臂的序列是Genbank数据库登录号M73758的第
208位到第2334位所示的序列，所述的dauW基因同源重组右臂的序列是Genbank数据库登录号AF048833的第140位到第2218位所示的序列，所述标记基因是安普霉素抗性基因apr；所述的dauW基因敲除质粒的质粒骨架是大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pJTU870；
b）将步骤a）所得的dauW基因敲除质粒转化宿主细胞大肠杆菌，获得转化子；
c）将天蓝淡红链霉菌（Streptomyces coeruleorubidus）SIPI-1482作为受体，与步骤b）所述的转化子进行接合转移，挑选同源重组双交换子，即天蓝淡红链霉菌的dauW基因阻断突变菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤c）所述的受体是天蓝淡红链霉菌SIPI-1482孢子，孢子预萌发后作为受体，预萌发条件为50℃热激10分钟。
4.一种dauW基因敲除质粒，其特征在于，其含有dauW基因同源重组左臂、标记基因和dauW基因同源重组右臂，所述的dauW基因同源重组左臂的序列是Genbank数据库登录号M73758的第208位到第2334位所示的序列，所述的dauW基因同源重组右臂的序列是Genbank数据库登录号AF048833的第140位到第2218位所示的序列，所述标记基因是安普霉素抗性基因apr，所述的dauW基因敲除质粒的质粒骨架是大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pJTU870。
说明书 :
一种提高天蓝淡红链霉菌柔红霉素产量的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种提高天蓝淡红链霉菌柔红霉素产量的方法，以及该天蓝淡红链霉菌的dauW基因阻断突变菌及其制备方法。
背景技术
[0002] 柔红霉素(Daunorubicin，DNR)是重要的蒽环类抗生素，以柔红霉素作为前体可以半合成多柔比星、表柔比星、吡柔比星等一系列临床上一线抗肿瘤药物。目前柔红霉素的生物合成途径已研究的较为清楚，并据此得出柔红霉素生物合成基因簇的结构和功能分布图。在之前的研究中，本实验室从国内柔红霉素生产菌天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组中克隆得到基因dauW，并通过构建插入失活质粒pYG770，进行同源重组单交换，对天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中的dauW进行插入失活，结果发现dauW插入失活突变株的柔红霉素的产量最高增加了6倍。
发明内容
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种提高天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)的柔红霉素产量的方法及其中使用的dauW基因完全阻断的天蓝淡红链霉菌突变菌株。
[0004] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种提高天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)的柔红霉素产量的方法，包括以下步骤：
[0005] 1)构建dauW基因敲除质粒，其含有dauW基因同源重组左臂、标记基因和dauW基因同源重组右臂；
[0006] 2)将步骤1)所得的dauW基因敲除质粒接合转移入天蓝淡红链霉菌，制备天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除(knockout)工程菌；
[0007] 3)培养步骤2)所得的天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除工程菌，从培养物中分离柔红霉素。
[0008] 本发明中，步骤1)所述的dauW基因敲除质粒含有dauW基因同源重组左臂、标记基因和dauW基因同源重组右臂。所述的dauW基因同源重组左臂的长度较佳的是1～3kb，优选2kb，其序列优选是Genbank数据库登录号M73758的第208位到第2334位所示的序列。所述的dauW基因同源重组右臂的长度较佳的是1～3kb，优选2kb，其序列优选是Genbank数据库登录号AF048833的第140位到第2218位所示的序列。所述标记基因可以是本领域常规的标记基因，如抗生素抗性基因或者荧光标记基因等。所述的抗生素抗性基因优选安普霉素抗性基因apr，其序列优选是Genbank数据库登录号AY072040的第2866位到第3681位所示的序列。所述的dauW基因敲除质粒的质粒骨架可以是本领域常规的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，优选质粒pJTU870。
[0009] 本发明中，步骤2)所述的天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)是本领域常用的用于生产柔红霉素的微生物，优选天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)SIPI-1482，更优选柔红霉素高产菌Dau27。将含有步骤1)所得dauW基因敲除质粒的大肠杆菌和天蓝淡红链霉菌共培养，两者发生接合后，所述的dauW基因敲除质粒进入到天蓝淡红链霉菌中和天蓝淡红链霉菌基因组中的dauW基因发生同源重组，挑选同源双交换子即获得天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除工程菌。
[0010] 本发明中，步骤3)所述的培养天蓝淡红链霉菌的dauW基因敲除工程菌的方法，以及从培养物中分离柔红霉素的方法都是本领域的常规方法。
[0011] 本发明发现，天蓝淡红链霉菌基因组中的dauW基因被敲除，dauW基因的表达被完全阻断，而后所得的天蓝淡红链霉菌柔红霉素的产量却大大提高，比dauW基因被插入非完全阻断的天蓝淡红链霉菌产量还高，因此为提高柔红霉素的产量提供了一个更直接、有效的途径。
[0012] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)的dauW基因阻断突变菌，所述的dauW基因被敲除。
[0013] 本发明中，所述的dauW基因较佳的被标记基因替换而敲除。所述的dauW基因被敲除的方法可以是本领域的常规方法，如通过同源重组双交换将dauW基因敲除。所述的天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)是本领域常用的用于生产柔红霉素的微生物，优选天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)SIPI-1482，更优选柔红霉素高产菌Dau27。
[0014] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之三是：一种制备如上所述的天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)的dauW基因阻断突变菌的方法，包括以下步骤：
[0015] a)构建dauW基因敲除质粒，其含有dauW基因同源重组左臂、标记基因和dauW基因同源重组右臂；
[0016] b)将步骤a)所得的dauW基因敲除质粒转化宿主细胞，获得转化子；
[0017] c)将天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)作为受体，与步骤b)所述的转化子进行接合转移，挑选同源重组双交换子，即天蓝淡红链霉菌的dauW基因阻断突变菌。
[0018] 本发明中，步骤a)所述的dauW基因敲除质粒如上所述。步骤b)所述的宿主细胞较佳的是大肠杆菌。步骤c)所述的受体较佳的是天蓝淡红链霉菌孢子，孢子预萌发后作为受体，预萌发条件优选为50℃热激10分钟。
[0019] 本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0020] 本发明除特别说明之外，所用的百分比都是质量百分比。
[0021] 本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
[0022] 相比于现有技术，本发明的有益效果如下：通过同源重组双交换来完全敲除柔红霉素生产菌天蓝淡红链霉菌中的dauW基因，采用抗生素抗性基因替换基因组中原有的dauW基因，考察其功能并研究其对柔红霉素产量的影响，发现柔红霉素产量大大提高，可以提高8倍以上，且在柔红霉素高产菌中进行此项技术操作，dauW阻断突变株的柔红霉素产量提高幅度也在7倍以上，比dauW基因被插入非完全阻断的天蓝淡红链霉菌产量还高，从而为提高柔红霉素的产量提供了一个更加直接、有效的途径。
附图说明
[0023] 以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。
[0024] 图 1PCR扩 增 drrAdrrB和 dnrXdpsY 基 因。A：drrAdrrB S+drrAdrrB AS；B：dnrXdpsY S+ dnrXdpsY AS。M：DL2000；1：SIPI-1482作为模板；2：H2O作为模板。
[0025] 图2质粒pYG255-1的PCR及酶切验证。A：酶切验证。M：λDNA/HindIII；1：pJTU870/EcoRI；2：pYG255-1/EcoRI；3：pYG255-1/EcoRI+BamHI。B：PCR验证。M：DL2000；
1：SIPI-1482作为模板；2：pYG255-1作为模板。
1：SIPI-1482作为模板；2：pYG255-1作为模板。
[0026] 图3质粒pYG255的PCR及酶切验证。A：酶切验证。M：λDNA/HindIII；1：pYG255/EcoRI+BglII；2：pYG255/EcoRI。B：PCR验证。M：DL2000；1：SIPI-1482作为模板；2：pYG255作为模板。
[0027] 图4质粒pYG255的构建。
[0028] 图5同源重组示意图。
[0029] 图6PCR验证SIPI-1482-pYG255突变株。A：Apr1+Apr2作为引物。M：DL2000；1：pYG255作为模板；2：SIPI-1482-pYG255基因组DNA作为模板；3：SIPI-1482-pYG255(1)作为模板；4：SIPI-1482基因组DNA作为模板；5：H2O作为模板。B：P255(2)+、P255(2)作为引物。M：DL2000；1：pYG255作为模板；2：SIPI-1482基因组DNA作为模板；3：
SIPI-1482-pYG255(1)作为模板；4：SIPI-1482-pYG255基因组DNA作为模板；5：H2O作为模板。
SIPI-1482-pYG255(1)作为模板；4：SIPI-1482-pYG255基因组DNA作为模板；5：H2O作为模板。
[0030] 图7出发菌SIPI-1482和突变株SIPI-1482-W2产抗HPLC图。A：柔红霉素(DNR)标准品；B：SIPI-1482；C突变株SIPI-1482-pYG255。
[0031] 图8Dau27-pYG255PCR验证。A：Apr1+Apr2为模板；B：P255(2)+、P255(2)-为模板。M：DL2000；1：H2O为模板；2：Dau-27基因组DNA为模板；3：Dau27--pYG255为模板；4：pYG255为模板。
[0032] 图9Dau27-pYG255发酵产物代表性HPLC分析图。A：标准品DNR；B：Dau-27；C：突变株Dau27-pYG2553#。
具体实施方式
[0033] 下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。
[0034] 1.dauW双交换臂片段的扩增
[0035] 菌种：天蓝淡红链霉菌Streptomyces coeruleorubidus SIPI-1482，可从上海医药工业研究院取得。
[0036] 培养基：YMB液体培养基，YEME液体培养基(霍普伍德.链霉菌遗传操作实验手册[M]，第一版，长沙：湖南科学技术出版社，1988.)。
[0037] 主要溶液及缓冲液：TSE，TEL(霍普伍德.链霉菌遗传操作实验手册[M]，第一版，长沙：湖南科学技术出版社，1988.)，饱和酚氯仿。
[0038] 方法：
[0039] 首先提取天蓝淡红链霉菌SIPI-1482基因组DNA。将新鲜的斜面孢子接种于装有20ml YMB液体培养基的250ml三角瓶中，在30℃、230r/min下摇床振荡培养约48h。以10％接种量(v/v)将上述液体种子接入装有20ml YEME液体培养基的250ml三角瓶中，在
30℃、220r/min下摇床振荡培养约48h。将培养液转移到50ml的离心管中，离心收集菌丝体(Hitachi CR21G，转子R20A2，10,000r/min，10min)，经过适当体积的无菌水洗涤后离心弃去上清。在离心管中加入5ml含5mg/ml溶菌酶的TSE溶液，旋涡振荡分散菌体后置于37℃水浴保温至溶液变粘稠。加入50μl 20mg/ml的蛋白酶K和250μl10％(wt)SDS到终浓度分别为200μg/ml和0.5％(wt)，在55℃水浴中保温30min，其间每隔10min混合一次。在室温下冷却后加入等体积饱和酚/氯仿(TNE)抽提二次，使得两相界面之间基本无杂质，然后再用氯仿抽提一次。加入等体积的异丙醇，用封嘴的无菌滴管在界面处缓慢搅动，将DNA缠绕在滴管上，并用70％(v/v)冰冷乙醇溶液洗涤，在室温下干燥。用适当体积的TEL溶液溶解DNA。DNA样品分装在Eppendorf管中后在-20℃保存。
30℃、220r/min下摇床振荡培养约48h。将培养液转移到50ml的离心管中，离心收集菌丝体(Hitachi CR21G，转子R20A2，10,000r/min，10min)，经过适当体积的无菌水洗涤后离心弃去上清。在离心管中加入5ml含5mg/ml溶菌酶的TSE溶液，旋涡振荡分散菌体后置于37℃水浴保温至溶液变粘稠。加入50μl 20mg/ml的蛋白酶K和250μl10％(wt)SDS到终浓度分别为200μg/ml和0.5％(wt)，在55℃水浴中保温30min，其间每隔10min混合一次。在室温下冷却后加入等体积饱和酚/氯仿(TNE)抽提二次，使得两相界面之间基本无杂质，然后再用氯仿抽提一次。加入等体积的异丙醇，用封嘴的无菌滴管在界面处缓慢搅动，将DNA缠绕在滴管上，并用70％(v/v)冰冷乙醇溶液洗涤，在室温下干燥。用适当体积的TEL溶液溶解DNA。DNA样品分装在Eppendorf管中后在-20℃保存。
[0040] dauW基因上游有自身抗性基因drrA及drrB基因，下游有dnrX、dpsY基因，PCR克隆dauW基因上下游的基因片段，作为两条足够长的交换臂，通过同源重组双交换来完全阻断dauW基因。
[0041] 表1 扩增drrAdrrB和dnrXdpsY基因的引物序列
[0042]
[0043] 以上述方法提取的SIPI-1482基因组DNA为模板进行PCR，退火温度n＝60℃。
[0044] 结果：
[0045] PCR结果如图1所示，分别得到两条2kb左右的条带，与理论相符。
[0046] 2.dauW完全阻断中间质粒的构建
[0047] 菌种：大肠杆菌DH5α(购自上海生工生物技术有限公司)。
[0048] 质粒：pJTU870，用于完全阻断中间质粒pYG255-1的构建，含有安普霉素抗性和硫链丝菌素抗性，为大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，取自上海交通大学白林泉教授，联系地址：上海市华山路1954号上海交通大学生命学院白林泉教授，邮编：200030，电话：86-21-62932418 E-mail：bailq@sjtu.edu.cn。
[0049] 主要溶液及缓冲液：Solution I，Solution II，Solution III(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M]，第二版，北京：科学出版社，1992.)。
[0050] 方法：
[0051] 采用BIO101公司的GeneClean II试剂盒，回收以上扩增得到的PCR片段。将DNA电泳凝胶置于长波紫外灯下，切出含所需DNA片段的凝胶，装入一个预先称重的Eppendorf离心管，称出凝胶的重量。加入三倍体积的6mol/LNaI(0.1g凝胶加300μl)，45℃水浴保温5min。加入5μl Glassmilk，于旋涡混合器混匀。置于冰浴中保持10min，并每隔1～2min振荡一次离心管，使DNA尽可能被Glassmilk吸附。离心(台式离心机，13,200r/min，
5s)沉淀Glassmilk，弃去上清液。加入200μl冷冻保存(-20℃)的New Wash缓冲液New Wash缓冲液(50mmol/L NaCl，2.5mmol/L(pH7.5)EDTA，10mmol/L(pH7.5)Tris，50％(v/v)乙醇)，于旋涡混合器悬浮Glassmilk，离心(台式离心机，13,200r/min，5s)洗涤。此过程需重复三次，最后一次洗涤应尽可能吸干残余在管底的New Wash缓冲液。加入5～10μl无菌蒸馏水，振荡使Glassmilk悬浮，放置45℃水浴保温5min，使吸附的DNA被解吸，离心(台式离心机，13,200r/min，5s)，将洗脱液移入一个新离心管。此过程需重复三次，合并三次洗脱液。离心(台式离心机，13,200r/min，5s)沉淀可能带入的Glassmilk，将洗脱液移入一个新离心管。
5s)沉淀Glassmilk，弃去上清液。加入200μl冷冻保存(-20℃)的New Wash缓冲液New Wash缓冲液(50mmol/L NaCl，2.5mmol/L(pH7.5)EDTA，10mmol/L(pH7.5)Tris，50％(v/v)乙醇)，于旋涡混合器悬浮Glassmilk，离心(台式离心机，13,200r/min，5s)洗涤。此过程需重复三次，最后一次洗涤应尽可能吸干残余在管底的New Wash缓冲液。加入5～10μl无菌蒸馏水，振荡使Glassmilk悬浮，放置45℃水浴保温5min，使吸附的DNA被解吸，离心(台式离心机，13,200r/min，5s)，将洗脱液移入一个新离心管。此过程需重复三次，合并三次洗脱液。离心(台式离心机，13,200r/min，5s)沉淀可能带入的Glassmilk，将洗脱液移入一个新离心管。
[0052] 将回收得到的drrAdrrB基因片段用EcoR1+Bgl Ⅱ双酶切，质粒pJTU870用EcoRI和BamHI双酶切后，进行片段连接。
[0053] 制备E.coli DH5α感受态细胞，用新鲜生长的平板单菌落或甘油冷冻保存菌液接种2ml LB的液体培养基，于37℃振荡培养过夜。以1％的接种量接种装有20ml LB的液体培养基的250ml三角瓶，于37℃振荡培养1.5h左右，控制OD600在0.3～0.5。将菌液移入50ml的无菌Beckman塑料离心管中，冰浴10min。离心(Hitachi CR21G，转子R20A2，6,000r/min，4℃，10min，下同)回收菌体。弃上清，并将离心管倒置，使最后残留的痕量培养液流尽。将菌体沉淀悬浮于10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液中，菌体经洗涤后离心回收。将菌体重新悬浮于10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液中，冰浴30min。离心，弃上清，并将离心管倒置，使最后残留的溶液流尽。将菌体悬浮于800μl用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液中，置于4℃保存。新鲜制备和4℃冰箱保存48h之内的感受态细胞都可直接用于转化。
[0054] 连接产物转化至E.coli DH5α，将DNA连接产物(体积＝10μl，DNA＝50ng)加入冰预冷的含有100μl E.coli DH5α感受态细胞的Eppendorf离心管中，手指轻叩离心管底部，小心混匀，冰浴30min。将含有转化DNA和感受态细胞的离心管在42℃恒温水浴中热激90s，其间不要摇动离心管。快速将离心管置于冰浴中保持5min。加入800μl LB液体培养基，颠倒混匀，37℃，230rpm振荡温育1h，使细胞繁殖。将转化细胞涂布于含有氨苄青霉素(100mg/ml)和安普霉素(50μg/ml)的LB平板表面。液体被吸收后，于37℃倒置培养(不超过16h)，筛选阳性克隆。
[0055] 将在平板上生长过夜的单菌落接种于含有氨苄青霉素(100μg/ml)和安普霉素(50μg/ml)的2ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。吸取1.5ml菌液于Eppendorf离心管，离心(台式离心机，12,000r/min，1min)，弃上清，真空吸干残余液体。将沉淀重新悬浮于100μl Solution I，于旋涡混合器上振荡使菌体分散，置于冰浴中10min。加入200μl新鲜配制的Solution II，盖紧盖子后，颠倒管子数次使Solution II与菌体充分接触，以便细胞裂解，冰浴3～5min。加入150μl预冷的Solution III，剧烈摇动管子使之充分混和，冰浴3～5min。离心(台式离心机，12,000r/min，10min)，将上清液移至另一离心管，加入0.6倍体积异丙醇，室温放置15min。离心(台式离心机，12,000r/min，10min)弃上清，沉淀用70％冰冷乙醇洗涤后置于真空干燥器中干燥。最后加入20μl TE溶解沉淀，质粒溶液在4℃或-20℃保存。
[0056] 结果：将提取得到的中间质粒进行PCR及酶切电泳鉴定，结果如图2。以质粒稀释100倍为模板PCR扩增，得到与以出发菌SIPI-1482为模板相同的条带，约2kb；EcoRI单酶切得到约9.2kb的单条带，BamHI+EcoRI双酶切得到了约1.75kb的插入片段条带和约
9.6kb的载体条带。酶切结果与理论相符，证明质粒正确，命名为pYG255-1。
9.6kb的载体条带。酶切结果与理论相符，证明质粒正确，命名为pYG255-1。
[0057] 3.dauW完全阻断质粒的构建
[0058] 菌种：大肠杆菌DH5α，购自上海生工生物技术有限公司。
[0059] 质粒：pYG255-1，pYG813(尚珂.2006.柔红霉素产生菌dnmV基因阻断突变株和功能替换研究.上海医药工业研究院博士论文.)，含有完整的安普霉素抗性基因。
[0060] 方法：同上。
[0061] EcoRI+ClaI双酶切pYG813获得完整的apr基因片段，割胶回收片段DNA apr(约1.5kb)，ClaI+HindⅢ双酶切PCR回收得到的dnrXdpsY片段，EcoRI+HindⅢ双酶切中间质粒PYG255-1，将这三个片段进行连接，转化。质粒pYG255的构建示意图见图4。
[0062] 结果：将提取得到的质粒进行PCR及酶切电泳鉴定，结果如图3。以质粒稀释100倍为模板PCR扩增dnrXdpsY基因，得到与以出发菌SIPI-1482为模板相同的条带，约
2.0kb，与理论相符。BglII+EcoRI双酶切得到了大小分别为2.0kb和12.9kb的片段，与理论相符(见图3)。证明质粒正确，命名为pYG255。
2.0kb，与理论相符。BglII+EcoRI双酶切得到了大小分别为2.0kb和12.9kb的片段，与理论相符(见图3)。证明质粒正确，命名为pYG255。
[0063] 4.dauW完全阻断质粒接合转移至链霉菌SIPI-1482
[0064] 菌种：大肠杆菌ET12567(参考文献MacNeil DJ，et al，Gene，1992，111：61)，天蓝淡红链霉菌SIPI-1482(柔红霉素产生菌)。
[0065] 质粒：pYG255。
[0066] 培养基：MS(Kieser T，Bibb M.Practical Streptomyces Genetics[J].Norwich：The John Innes Foundation，2000.)。
[0067] 将以上验证正确的pYG255质粒，转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)，在LB+Apr平板上筛选得转化子ET12567/pYG255。将ET12567/pYG255接种于2ml LB液体培养基(含氯霉素34μg/ml、卡那霉素25μg/ml)，37℃振荡培养过夜。1∶100接种新鲜LB(含氯霉素34μg/ml、卡那霉素25μg/ml)20ml，培养至OD值0.4～0.6为佳。用50ml离心管离心去上清(Hitachi CR21G，转子R20A2，10,000r/min，10min)，10ml新鲜LB洗涤细胞两次，最8
后用0.1倍体积LB培养基(2ml)悬浮。刮取链霉菌孢子制备约10/ml孢子悬液，离心后沉淀换用2×YT培养基悬浮，取500μl于50℃水浴中热激十分钟。取500μl含重组质粒的ET12567(pUZ8002)加入至500μl热激后的孢子悬液中，混合并轻摇。离心去除大部分上清，悬浮残余液体涂布MS平板，28℃倒置培养。16～20h后在平板上铺1ml含有0.5mg的萘啶酮酸及50μg安普霉素的水溶液，液体被吸收后，继续于28℃倒置培养。挑取接合子单菌落于新鲜的MS+Apr+萘啶酮酸平板上富集培养。
后用0.1倍体积LB培养基(2ml)悬浮。刮取链霉菌孢子制备约10/ml孢子悬液，离心后沉淀换用2×YT培养基悬浮，取500μl于50℃水浴中热激十分钟。取500μl含重组质粒的ET12567(pUZ8002)加入至500μl热激后的孢子悬液中，混合并轻摇。离心去除大部分上清，悬浮残余液体涂布MS平板，28℃倒置培养。16～20h后在平板上铺1ml含有0.5mg的萘啶酮酸及50μg安普霉素的水溶液，液体被吸收后，继续于28℃倒置培养。挑取接合子单菌落于新鲜的MS+Apr+萘啶酮酸平板上富集培养。
[0068] 5.dauW完全阻断突变株的筛选及验证
[0069] 方法：
[0070] 选取较快长出孢子的接合子进行温度诱导筛选及传代：收集孢子，制备孢子悬液，以每培养皿约100个孢子涂布于G1+Apr平板(高氏1号培养基，该平板含有50μg/ml培养基的安普霉素)，28℃培养48～72h，观察有小菌落长出后转至39℃进行温度诱导。约9天后发现39℃培养下已长出大量的孢子。由于质粒pYG255含有温度敏感型复制子，在高于34℃即不能独立复制，故在39℃生长的菌落应是质粒进入菌体后通过与同源臂的交换整合入染色体，伴随染色体的复制、转录和表达而使该再生菌落具有抗生素抗性。
[0071] 将温控诱导后获得的发生单交换的转化子SIPI-1482-pYG255(1)继续传代，使其进一步发生双交换，刮取其孢子于新鲜G1+Apr平板28℃传代培养。传至F6代后挑取单菌落涂布G1+Apr平板，筛选发生同源重组双交换的菌株SIPI-1482-pYG255，同源重组双交换的基因型见图5。
[0072] 对于我们所希望获得的dauW完全替换阻断突变株，理论上以单交换突变株SIPI-1482-pYG255(1)基因组为模板能够扩增到533bp的Apr条带，1.9kb的含完整dauW的片段以及Apr替换了dauW基因后的1.7kb片段；而以SIPI-1482-pYG255基因组DNA为模板应扩增到Apr条带，和Apr替换了的dauW片段1.7kb，得若干株dauW阻断突变株，挑选其中两株提取基因组DNA进行PCR验证结果见图6，由图可知，SIPI-1482-pYG255的PCR结果与预测相符，的确为发生了同源重组双交换的菌株。
[0073] 表2 PCR的扩增Apr基因的引物序列和性质
[0074]
[0075] 表3 PCR验证SIPI-1482-pYG255突变株的引物序列和性质
[0076]
[0077] 6.dauW完全阻断突变株SIPI-1482-pYG255的发酵分析
[0078] 菌种：链霉菌SIPI-1482，dauW完全阻断突变株SIPI-1482-pYG255。
[0079] 培养基：种子及发酵培养基(蒋世春，白骅，陶正利.氮离子注入柔红霉素产生菌诱变高产菌株的研究[J].中国抗生素杂志，2000，25(6)：3.)。
[0080] 方法：
[0081] 将新鲜的斜面孢子接种于装有20ml种子培养基的250ml三角瓶中，在28℃、230r/min摇床振荡培养2d。然后将培养好的种子液以10％(v/v)接种量接种于装有20ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28℃、230r/min摇床振荡培养5d。停止发酵后将1ml发酵液用饱和草酸溶液调节pH到1.2～1.5，50℃保温1h，其间摇动几次。加入等体积的丙酮，抽提半小时后离心分离，取上清。用HPLC方法分析发酵产物，同时以相应对照品为对照。进样前样品经偏氟膜过滤。HPLC分析条件为：
[0082] HPLC仪： Waters 2487 DualλAbsoubance Detector
[0083] Waters 1525Binary HPLC pump
[0084] Waters 717plus Autosampler
[0085] 色谱柱： Waters公司Symmetry C18(5μm，4.6×150mm)
[0086] 柱温： 35℃
[0087] 流动相： 甲醇∶水∶乙酸∶三乙胺(56∶44∶2.5∶0.5)，孔径
[0088] 0.22μm的偏氟膜过滤
[0089] 流速： 1.0ml/min
[0090] 检测波长：254nm
[0091] 进样量： 20μl
[0092] 结果：
[0093] SIPI-1482出发菌株和突变株SIPI-1482-pYG255分别在不含抗生素的培养基中发酵，HPLC检测发酵产物，见图7。由图7可以看出，SIPI-1482-pYG255与SIPI-1482相比有很大差别，不能检测到保留时间约41min紫红霉酮峰，并且柔红霉素的产量大大增加，几乎是出发菌SIPI-1482的近8倍。
[0094] 7.遗传稳定性分析
[0095] 将SIPI-1482-pYG255传代后将每一代斜面孢子进行发酵实验。继续传至3代，结果显示F1至F3代柔红霉素产量相差不大，总体没有显著差异，稳定性良好。
[0096] 8.dauW完全阻断质粒接合转移至柔红霉素高产菌Dau27
[0097] 菌种：大肠杆菌ET12567，天蓝淡红链霉菌Dau27(柔红霉素高产菌)，可从上海医药工业研究院取得。
[0098] 质粒：pYG255。
[0099] 培养基：MS(Kieser T，Bibb M.Practical Streptomyces Genetics[J].Norwich：The John Innes Foundation，2000.)。
[0100] 利用大肠杆菌-链霉菌结合转移将pYG-255转入Dau27，方法同4。
[0101] 筛选发生同源重组双交换的突变菌株Dau27-pYG255，方法同5。
[0102] 对于所希望获得的dauW完全替换阻断突变株，以Dau27-pYG255基因组DNA为模板应扩增到apr条带，和用apr替换了的dauW后的约1.7kb片段，而以出发菌株Dau-27基因组DNA为模板，则应扩增得到包含dauW基因的片段约1.9kb，结果见图8。由图可知，Dau27-pYG255的PCR结果与预测相符，的确为发生了同源重组双交换的菌株。
[0103] 9.dauW完全阻断突变株Dau27-pYG255的发酵分析
[0104] 方法：同6。
[0105] 结果：Dau27出发菌株和突变株Dau27-pYG255分别在不含抗生素的培养基中发酵，HPLC检测发酵产物，见图9。由图9可以看出，dauW完全阻断重组菌Dau27-pYG255与出发菌Dau27相比，突变株DNR产量提高明显，其最高产量可以达到出发菌Dau27的7倍。