猪骨骼肌特异性表达基因α-actin启动子的克隆及应用

摘要

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及到猪的骨骼肌特异性表达基因α-actin的不同长度启动子区域的分离鉴定和功能验证。从猪的基因组中克隆了骨骼肌特异表达基因α-actin(GeneBank登录号为100154254)上游八个不同长度的启动子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：9所示；结果表明长度为249bp的区域具有独立的启动活性兼肌肉组织特异性，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：9所示。本发明同时公开了八个不同缺失启动子片段的获得、相应重组表达载体的制备方法及双荧光素酶活性检测系统对启动子活性分析的应用。

权利要求

1.调控猪肌肉组织骨骼肌特异表达基因α-actin的一个肌肉组织特异性表达的启动子，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：9所示。

2.权利要求1所述的启动子在猪的遗传改良中的应用。

说明书

猪骨骼肌特异性表达基因α-actin启动子的克隆及应用

技术领域

[0001] 本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及到猪中骨骼肌特异性表达基因α-actin的不同长度启动子区域的分离鉴定及功能验证。

背景技术

[0002] 高等生物基因的表达受到细胞内外环境的精细调控，因而具有严格的时间及空间有序性。基因的表达调控是一个复杂且有序的过程，由多阶段调控水平共同完成，这主要包括转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平。其中转录水平的调控是最关键的环节。启动子是转录水平上一个重要的调控元件，是位于结构基因5′端上游区的DNA序列，可与众多的转录因子相互作用调控基因的表达(武力，1999)。因此深入研究启动子的结构、功能、作用模式等有利于我们更好的理解相应基因的功能及基因间的互作关系。

[0003] 根据启动子作用方式及功能的不同可将启动子分为3类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。组成型启动子是指在该类启动子的调控下，基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同组织部位表达水平没有明显差异。诱导型启动子是指在某些特定物理或化学信号的刺激下，该种类型启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。组织特异性启动子是指在该类启动子的调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特征。

[0004] 外源基因在机体中能否高效稳定地表达是基因工程研究的关键。在真核细胞中利用基因工程技术构建多种真核表达系统进行外源基因的表达已经是一项常用的技术，但是经常面临的问题是外源基因的表达量较低，且表达往往存在于机体的几乎所有组织中，如现阶段广泛利用的CMV及SV40启动子。两者均可以携带外源基因与几乎所有类型的细胞中高效地表达。这两种高效的启动子存在的问题是显而易见的：不具备调控基因靶向表达于某一特定组织的能力。能够解决此问题的关键乃是具备较高活性的组织特异性启动子的获得。组织特异性启动子通常以特定的组织细胞结构和化学、物理信号为基础，可对外源基因进行靶向定位，将基因固定于某一组织或细胞中表达，减少了机体能量和物质的损耗及对机体代谢活动的影响，同时又能够起到定向改善某一组织特性的效果，这在人类疾病的治疗方面的前景尤其可观。鉴于组织特异性启动具备这样的特质，在基因工程中越来越获得研究者的青睐。

[0005] 利用肌肉特异性启动子，通过构建相应的表达载体，能够开启基因固定于肌肉中表达。通过外源基因的蛋白或RNAs在骨骼肌中的表达可很好的研究肌肉的分化或功能及改善肌肉的质量。例如可利用肌肉特异性的启动子携带目的MicroRNA特异性的静默其靶基因在肌肉中的表达而不影响其他组织此基因的正常表达，有效的获得目的基因对于肌肉组织的作用；同时可以利用肌肉组织特异性的启动子来研究那些通过QTL图谱定位及表达分析获得的可用于提高肌肉量的候选基因。但其肌肉的缺点是表达效率较低，个体间差异较大，所以，提高外源基因在肌肉组织中的表达具有重要的意义。

[0006] 在人类中肌动蛋白家族主要包含六个异构体，他们之间在氨基酸水平上达到90％以上的相似性(Sheterline等，1998；Tondeleir，et al.，2009)。肌动蛋白在细胞中发挥着各种各样的功能：β-actin和γ-actin是细胞内细胞骨架的主要成分，对于细胞形态的维持及细胞的运动性方面发挥着举足轻重的作用(Sheterline等，1998；Tondeleir等，2009；Vandekerckhove and Weber，1978)。其余四种异构体主要存在于平滑肌，心肌及骨骼肌中，维持着肌肉的收缩功能(Tondeleir，et al.，2009)。骨骼肌actin和心肌actin共表达于各种横纹肌中(Ilkovski等，2005；Tondeleir等，2009)。骨骼肌a-actin所编码的蛋白质是成年的机体骨骼肌中肌动蛋白的主要异构体，是肌原纤维节的细肌丝的核心部分，同其他的诸多蛋白发生相互作用，最显著的是同粗肌丝的肌球蛋白发生作用，从而引起肌收缩(Craig and Padrón，2004)。在成年机体的骨骼肌中，骨骼肌actin是主要的蛋白异构体(Sheterline等，1998)。研究表明猪的α-actin定位于14号染色体，DNA为2739bp，cDNA为1474bp，ORF1134bp，编码378个氨基酸。

[0007] 从目前在植物中及动物中获得的启动子分析发现，普遍存在以下几个方面的问题：特异性并不是很高；分离并且获得应用的特异性启动子并不是很多，限制了在基因工程中的应用；活性低。特别是在动物上的研究还比较欠缺。因此，获得特异性较强表达效率较高的启动子成为亟待解决的问题。

[0008] 到目前为止，除申请人之外，仍没见到研究猪肌肉组织骨骼肌基因α-actin的启动子功能的报道。所以申请人对这个基因进行了不同长度启动子功能的研究，以期能够更好地利用该启动子。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于分离克隆猪的骨骼肌特异性表达基因α-actin启动子区域的不同片段，并对其进行功能验证，以期获得此基因的具备较高启动活性并保持肌肉组织特异性的调控区段。克服目前动物基因工程中可利用的组织特异性启动子数目的不足。

[0010] 本发明从大白猪的基因组中分离并鉴定出α-actin基因具有肌肉组织特异性的启动子。以大白猪的血液基因组DNA为模板扩增获得了1758bp、1446bp、1202bp、1145bp、1070bp、896bp、540bp、249bp共8个不同长度的缺失启动子片段，将这些片段融合报告基因萤火虫荧光素酶基因(简称LUC基因)构建pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5、pGL3-basic-Q6、pGL3-basic-Q7、pGL3-basic-Q88个真核表达载体，将这些载体分别转染C2C12、PK及分化的C2C12细胞，通过双荧光素酶报告系统分析报告基因萤火虫荧光素酶的相对活性，从而获得保持肌肉组织特异性的核心启动子区。

[0011] 本发明通过以下技术实现：

[0012] 本发明的技术路线见图1所示。

[0013] 利用BLASTn数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索获得骨骼肌特异性基因α-actin的上游调控序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。利用TESS、TFSEARCH及MethPrimer生物信息学软件预测分析核心启动子区域、顺反式作用元件及CpG岛分布情况。根据预测结果设计8对缺失引物(其核苷酸序列见表1)，利用PCR法从大白猪的基因组中分离获得肌肉组织特异性启动子。构建报告基因LUC融合载体，申请人将其分别命名为pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5、pGL3-basic-Q6、pGL3-basic-Q7、pGL3-basic-Q8。其片段长度分别为1758bp、1446bp、1202bp、1145bp、1070bp、896bp、540bp、249bp，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9所示。瞬时转染C2C12、PK及分化的C2C12细胞，双荧光素酶报告系统检测发现 pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5、pGL3-basic-Q6仅在分化的C2C12细胞中有微弱的表达，在其余两种细胞中的表达量同阴性对照pGL3-basic无显著性差异。pGL3-basic-Q7和pGL3-basic-Q8的活性在C2C12及分化C2C12中有了极大的提高，同上述前六种载体的活性相比而言有极显著的差异，在PK细胞中并无明显变化。结果显示249bp的pGL3-basic-Q8片段具备独立的启动报告基因表达的功能并同时保持着肌肉组织的表达特异性。

[0014] 本发明的具体步骤如下：

[0015] 在前人研究的基础上选择具备骨骼肌特异性的表达基因α-actin，在美国国立生物研究所网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上获得该基因的DNA序列，如SEQ ID NO：10所示，以此序列作为探针序列，利用比较基因组学的方法，将该DNA序列输入NCBI的BLASTn数据库，搜索获得该基因的上游调控序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。利用TESS、TFSEARCH及MethPrimer等生物信息学软件对序列SEQ ID NO：1预测其核心启动子区域、顺反式作用元件及CpG岛分布情况。根据网络预测的结果设计缺失引物，以大白猪基因组DNA为模板，PCR扩增获得8个不同长度的启动子区域，序列分别如序列表SEQ ID NO：2-SEQ ID NO：9所示。将这些启动子候选片段装载到pGL3-basic报告基因LUC上游多克隆位点(载体图及多克隆位点等信息见图2)处，装配成融合表达载体(图3)。通过脂质体介导的转染法将融合表达载体瞬时转入C2C12、PK及分化的C2C12细胞，同时转入海肾荧光素酶报告基因pRL-TK为内参质粒。本发明设置阴性对照pGL3-basic(图2)，阳性对照pGL3-control。转染48h后通过双荧光素酶报告系统对报告基因LUC进行定量分析，进而考察验证该启动子的不同缺失片段在不同来源细胞中的启动功能。检测结果表 明pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5、pGL3-basic-Q6仅在分化的C2C12细胞中有微弱的表达，在其余两种细胞中的表达量同阴性对照pGL3-basic无显著性差异。pGL3-basic-Q7和pGL3-basic-Q8的活性在C2C 12及分化C2C12中有了极大的提高，同上述前六种载体的活性相比而言有极显著的差异，在PK细胞中并无明显变化。结果显示249bp的pGL3-basic-Q8片段具备独立的启动报告基因表达的功能并同时保持着肌肉组织的表达特异性。

[0016] 本发明的优点在于：

[0017] (1)本发明详尽的验证了α-actin启动子的各个区段在不同来源细胞中启动基因表达的能力，为α-actin基因的表达调控带来了更深层次的认知。

[0018] (2)本发明鉴定了肌肉组织特异表达的启动子α-actin的核心区段，为基因工程和分子育种提供了新的特异表达的启动子资源。

[0019] 更详细的技术方案参见《具体实施方式》的内容。

附图说明

[0020] 序列表SEQ IDNO：1，公开了本发明克隆的猪骨骼肌特异表达基因α-actin的上游调控核苷酸序列，长度为2006bp。

[0021] 序列表SEQ ID NO：2是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子pGL3-basic-Q1的核苷酸序列，长度为1758bp。

[0022] 序列表SEQ ID NO：3是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子pGL3-basic-Q2的核苷酸序列，长度为1446bp。

[0023] 序列表SEQ ID NO：4是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子pGL3-basic-Q3的核苷酸序列，长度为1202bp。

[0024] 序列表SEQ ID NO：5是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子pGL3-basic-Q4的核苷酸序列，长度为1145bp。

[0025] 序列表SEQ ID NO：6是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子pGL3-basic-Q5的核苷酸序列，长度为1070bp。

[0026] 序列表SEQ ID NO：7是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子pGL3-basic-Q6的核苷酸序列，长度为896bp。

[0027] 序列表SEQ ID NO：8是从所述的SEQ IDNO：1核苷酸序列克隆得到的一个缺失启动子pGL3-basic-Q7的核苷酸序列，长度为540bp。

[0028] 序列表SEQ ID NO：9是从所述的SEQ ID NO：1核苷酸序列克隆得到一个缺失启动子pGL3-basic-Q8的核苷酸序列，长度为249bp。

[0029] 序列表SEQ ID NO：10是本发明克隆的猪的骨骼肌特异表达基因α-actin的上游调控序列的探针DNA序列(Genebank登录号为100154254)的，长度为2739bp。

[0030] 图1：本发明的技术路线图。

[0031] 图2：表示载体pGL3-basic结构示意图，在多克隆位点的下方包含报告基因luc+。

[0032] 图3：构建好的以pGL3-basic为骨架的融合载体简图。骨骼肌特异表达基因α-actin的启动子系列缺火片段来驱动LUC基因表达，由图中的deleted promoter来表示。Amp为氨苄抗性筛选基因；luc+为报告基因萤火虫荧光素酶；MCS表示多克隆位点；箭头方向表示基因或启动子表达的方向。

[0033] 图 4： 融 合 载 体 pGL3-basic-Q 1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5、pGL3-basic-Q6、pGL3-basic-Q7、pGL3-basic-Q8的KpnI和BglII双酶切鉴定图。M表示DL marker2000，1-8分别表示融合载体pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5、pGL3-basic-Q6、pGL3-basic-Q7、pGL3-basic-Q8的双酶切结果，上面较大的条带为载体条带，下端为缺失启动子条带，条带长度分别为1758bp、1446bp、1202bp、1145bp、1070bp、896bp、540bp、249bp。

[0034] 图5：由骨骼肌特异表达基因α-actin的系列缺失启动子驱动LUC基因在不同来源的细胞中的表达情况。

具体实施方式

[0035] 实施例1：猪的骨骼肌特异性表达基因α-actin的启动子候选片段及相应缺失片段的获得

[0036] 利用报道的猪的α-actin基因的DNA序列(GenBank登录号：100154254)为探针序列，在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提取候选基因ATG前的2006bp的上游序列作为启动子候选片段。通过设计特异性引物(P1F：CCATCTGGAGGAAGCACG；P1R：CCACGATGGACGGGAACA)，以大白猪的血液基因组DNA为模板，PCR扩增此段序列。扩增条件为：94℃5min，35*(94℃，40sec，57.8℃40sec，72℃，1min30sec)；72℃，10min；25℃，
2min。扩增产物用1.5％琼脂糖电泳检测，回收纯化(北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书操作)，做TA克隆，连接体系为：PCR产物5μL；Ligation Solution I 1.5μL；载体pMD18-T Vector(购自宝生物工程大连有限公司)0.3μL。后挑选阳性克隆送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。将测序正确的阳性克隆扩大培养，抽提质粒(根据TIANGEN公司的TIANpreMiniPlasmidKit操作)，命名为TA-2006，置于-20℃备用。

[0037] 利用TESS、TFSEARCH及MethPrimer等生物信息学软件预测此段候选序列的核心启动子区域、顺反式作用元件及CpG岛分布情况。根据网络预测的结果设计缺失引物(引物序列如表1所示；PCR反应参数设置如表2所示)。其中P2F、P3F、P4F、P5F、P6F、P7F依次代表构建的6个5′端缺失载体的前向引物，添加酶切位点Kpn I(GGTACC，以下划线表示)，同时携带保护性碱基GG(阴影表示)；P8R表示公共的后向引物，添加的酶切位点为BglII(AGATCT，以下划线表示)，同时携带保护性碱基GA(以阴影区表示)；P9R、P10R表示构建的2个3′端缺失载体的后向引物，添加酶切位点BglII(以下划线表示)，P4F表示其公用的前向引物，添加酶切位点KpnI(以下划线表示)。PCR扩增模板为测序正确的TA-2006质粒。得到扩增产物之后，后续操作均按构建TA-2006的方法进行，将该载体分别命名为TA-Q1、TA-Q2、TA-Q3、TA-Q4、TA-Q5、TA-Q6、TA-Q7、TA-Q8。

[0038] 表1：启动子缺失载体引物的设计

[0039]

[0040] 表2PCR扩增参数

[0041]

[0042]

[0043] 实施例2：猪的骨骼肌特异性表达基因α-actin的启动子候选片段及相应缺失片段的转染载体构建。

[0044] (1)酶切载体pGL3-basic(载体购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美国Promega公司，载体及多克隆位点等信息见图2)及缺失片段的TA克隆质粒TA-Q1、TA-Q2、TA-Q3、TA-Q4、TA-Q5、TA-Q6、TA-Q7、TA-Q8。用KpnI、BglII双酶切pGL3-basic及TA-Q1、TA-Q2、TA-Q3、TA-Q4、TA-Q5、TA-Q6、TA-Q7、TA-Q8，酶切体系为：

[0045] 10×buffer2 2μL；

[0046] 质粒DNA 5μL；

[0047] 100×牛血清白蛋白(BSA) 0.2μL；

[0048] Kpn I 0.5μL；

[0049] BglII 0.5μL；

[0050] 双蒸水 11.8μL

[0051] 37℃酶切3h后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切的完整性并回收目的片段：pGL3-basic回收较大的片段，TA-Q1、TA-Q2、TA-Q3、TA-Q4、TA-Q5、TA-Q6、TA-Q7、TA-Q8回收相应大小的缺失片段。用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司生产的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收，置于-20℃冰箱保存。

[0052] (2)将酶切回收的缺失片段连接到pGL3-basic载体上(见图3)，连接体系为：

[0053] 10×T4DNA Ligase Buffer 1.0μL

[0054] T4DNA Ligase 0.5μL

[0055] pGL3-basic(己酶切) 1.5μL

[0056] 回收纯化的缺失片段的酶切产物 6μL

[0057] 双蒸水(ddH2O) 1μL

[0058] 16℃水浴连接12h后，将其转入大肠杆菌DH5a中，在含氨苄青霉素(Amp)的LB平板上筛选阳性单克隆，对重组子进行PCR及酶切鉴定，将阳性重组子挑出送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。对于测序正确的阳性克隆按原菌液∶培养基体积比＝1∶100的比例进行扩大培养，37℃摇床摇16h后用OMEGA公司生产的可用于细胞转染的质粒小量抽提试剂盒(D6950-01)抽提质粒，分别命名为pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5、pGL3-basic-Q6、pGL3-basic-Q7、pGL3-basic-Q8。用Kpn I、BglII双酶切鉴定抽提的质粒，酶切体系如上所述，此时质粒只需加1μL酶切结果见图4。用 640核酸-蛋白质浓度测定仪(美国Beckman公司产品)测定质粒的浓度，置于-20℃冰箱备用。

[0059] 实施例3：脂质体介导的细胞转染

[0060] 本发明用24孔细胞培养皿做转染用。为了消除实验的误差，每个重组载体均进行TM三轮独立的试验，每次试验做三个复孔。根据Lipofectamine 2000(invitrogen公司)说明书，每孔按载体的质量∶脂质体的体积＝1μg∶3μL的比例转染。转染的受体为不同来源的细胞，主要包括小鼠肌源细胞系C2C12、猪肾细胞PK及用2％的马血清诱导C2C12细胞分化形成的肌管。重组载体转染入细胞48h后收集细胞裂解液后利用双荧光素酶检测系统对缺失启动子的活性进行分析。本发明的细胞培养、诱导分化、转染的主要步骤及各种溶液的配制如下所述：

[0061] (1)主要溶液的配制

[0062] 1)细胞生长液(10％浓度的胎牛血清培养基FBS)：将胎牛血清(购自GIBCO BRL公司)放置于4℃冰箱融化，待其完全融化后，用50mL的注射器吸取100mL的已过滤的胎牛血清，加入100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素，DMEM/F12培养基(购自invitrogen公司)，定容至1L，分装置于4℃冰箱备用。

[0063] 2)分化培养液(2％浓度的马血清培养液)的配置：将马血清(购自GIBCO BRL公司)放置于4℃冰箱融化，待其完全融化后，用1L的移液器吸取2mL的已过滤的马血清，加入DMEM/F12培养基(购于invitrogen公司)，定容至100mL，置于4℃冰箱备用。

[0064] 3)细胞消化液：胰酶2.5g、Na2HPO41.15g、KCl 0.2g、NaCl 8.0g、KH2PO40.2g，溶于900mL双蒸水中，待完全溶解后，定容至1L，0.22μm滤膜过滤除菌，分装后置于-20℃冰箱中备用。

[0065] 4)平衡盐溶液PBS：2.89g的Na2HPO4、0.2g的KCl、0.2g的K2HPO4、8g NaCl加入800mL双蒸水，充分溶解后定容至1L，高压灭菌后室温放置待用。

[0066] 5)细胞冻存液：分别吸取1.50mL的二甲基亚砜(DMSO)、6.00mL的胎牛血清培养基(FBS)和7.50mL的DMEM(购自invitrogen公司)，充分混匀后，以每管1.50mL的量分装置于-20℃冰箱中备用。

[0067] (2)细胞培养

[0068] 1)根据细胞的生长状况及时更换培养液：当细胞培养液变黄时应更换培养液，吸出旧的培养液，加入新鲜的培养液，一般是24h更换一次。

[0069] 2)细胞生长至80％的汇合度后进行传代，吸管吸出旧的培养基，用1×磷酸缓冲液(PBS)(购自invitrogen公司)冲洗两次。

[0070] 3)预先将0.25％胰蛋白酶置于37℃培养箱温浴几分钟以减少对细胞的伤害。2
50cm 细胞培养瓶加入1mL消化液(购于invitrogen公司)即可，快速的前后旋转细胞瓶以便胰蛋白酶可以覆盖所有细胞，然后置于培养箱中约1min，加速胰蛋白酶的消化。

[0071] 4)待细胞附着松动，快速的向培养瓶中加入新鲜的10％浓度的FBS细胞生长液(购自杭州四季青生物有限公司)终止胰蛋白酶的作用。

[0072] 5)用吸管反复吹打瓶壁细胞，使之瓶完全从壁上脱离形成细胞悬液。

[0073] 6)各吸出1/3的细胞悬液移入新的细胞瓶中，补充新的细胞生长液，使每瓶终体积达到4mL。

[0074] (3)C2C12细胞的诱导分化。

[0075] 1)用胰蛋白酶消化汇合度达到80-90％的C2C12细胞后向细胞瓶内快速的加入1mL的2％的马血清培养液，用吸管反复吹散后，对细胞进行计数。

[0076] 2)根据24孔细胞培养皿共需细胞数，计算出所需1)中制备的细胞悬液，然后补足4
新鲜的2％浓度的马血清培养液(购自GIBCO BRL公司)，使细胞的终密度达到5-10×10/mL。

[0077] 3)用吸管将细胞吹均匀后，以每孔500μL的量分加到24孔细胞培养皿中，然后以前后左右十字交叉的姿势轻轻的将细胞摇匀，后置于37℃，5％CO2培养箱中培养，在细胞贴壁前不要晃动培养皿(6h内)

[0078] 4)每24h更换一次2％浓度的马血清培养液，显微镜下观察细胞的形态及生长状况。

[0079] 3-4天可观察到少量肌管的出现，8-9天可达到高峰后细胞逐渐凋亡。本发明选择诱导分化7天后的细胞进行转染。

[0080] (4)脂质体介导的细胞转染步骤

[0081] 1)转染前一天，取一瓶生长状况良好的细胞用胰蛋白酶消化后，加入2mL新鲜的不含任何抗生素的10％的FBS细胞生长培养液，用吸管将细胞完全吹散形成均匀的细胞悬液后，用细胞计数板对细胞进行计数。计算出24孔细胞培养板共需细胞量(每孔细胞数目5
约为0.5-2×10)，然后吸出共需的悬液，向其内加入额外的新鲜的不含任何抗生素的10％的FBS细胞生长培养液(总体积12mL)，吹打均匀后，每孔分装500μL细胞悬液，轻轻晃动培养板摇匀细胞后置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h。

[0082] 2)对于每孔待转染的细胞：根据待转染质粒的浓度及每孔待转染质粒的量1μg取适量的质粒加入到50μLOPTI-MEM培养液(购自invitrogen公司，按该试剂的说明书操TM作)中，轻轻吹打混合均匀后室温静置5min；以质粒量：Lipofectamine 2000的体积量为TM
1∶2.5的情况下，取2.5μL的Lipofectamine 2000加入到50μLOPTI-MEM培养液中，混合均匀后室温静置5min。

[0083] 3)将步骤2)中的两份混合液在30min内混合均匀，室温静置20min。

[0084] 4)弃原培养液，用1×PBS或OPTI-MEM培养液清洗细胞两次，并将清洗液吸净。

[0085] 5)每孔细胞加入3)中混合液100μL后补足OPTI-MEM培养液至总体积为500μL，以前后左右十字交叉的姿势晃动培养板以混合均匀。

[0086] 6)37℃，5％CO2细胞培养箱培养6h后更换成不含任何抗生素的10％的FBS细胞生长培养液

[0087] 7)对于诱导分化的C2C12细胞，待其加入分化培养液(即2％浓度的马血清培养液)诱导7天有大量的肌管出现的时候，按上述相同的步骤转染。

[0088] 实施例4：骨骼肌特异性表达基因α-actin的启动子候选片段及相应缺失片段的双荧光酶活性的检测

[0089] 本实施例设置阴性对照质粒pGL3-basic，阳性对照质粒pGL3-control，以(海肾荧光素酶报告基因)质粒PRL-TK(该质粒购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，即美TM国Promega公司)做内参质粒(用以校正转染效率)，以Lipofectamine 2000做转染试剂，在24孔的细胞培养皿中按每孔载体的质量∶脂质体的体积＝1μg∶3μL的比例将构建的缺失载体分别瞬时转染小鼠肌源细胞系C2C12、猪肾细胞PK、C2C12诱导分化的肌管，以空转染做对照，转染细胞48h后收集细胞裂解液，利用双荧光素酶报告基因检测试系统对猪骨骼肌特异性表达基因α-actin的启动子不同缺失片段的活性及组织特异性进行分析，确定高活性并具备肌肉组织表达特异性的区段。结果表明(见图5所示)：在三种不同的细胞中，构建的前六种5′端缺失载体pGL3-basic-Q1、pGL3-basic-Q2、pGL3-basic-Q3、pGL3-basic-Q4、pGL3-basic-Q5、pGL3-basic-Q6的活性均较低，其中在PK细胞中的活性同阴性对照pGL3-basic相比并无明显的差异。后两种3′端缺失载体pGL3-basic-Q7和pGL3-basic-Q8的活性在C2C12细胞及分化的肌管中活性有了极其显著性的提高，pGL3-basic-Q8的活性最高。相较而言，肌管中的表达量最高，而在PK细胞中的活性同前六种载体及阴性对照pGL3-basic相比并无明显差异。本发明的结果最终获得249bp的启动子片段(即构建的重组表达载体pGL3-basic-Q8，序列信息见SEQ ID NO：9，具备独立的启动功能兼具肌肉组织特异性。