生物人工肺

摘要

呈现了一种气道器官生物反应器装置及其使用方法，以及使用该方法生成的生物人工气道器官及使用生物人工气道器官治疗受试者的方法。

权利要求

1.一种气道器官生物反应器装置，其包含：器官室，其配置为容纳对之灌注细胞培养基以培养功能性气道器官的器官基质支架；

湿式通风器系统，其配置为对所述气道器官供应湿式通气，其中所述湿式通气向所述气道器官的气道提供流体；

干式通风器系统，其配置为对所述气道器官供应干式通气，其中所述干式通气向所述气道器官的气道提供气体；和控制器，其配置为控制湿式通气的投递或干式通气的投递，所述控制器包含湿式通气和干式通气之间的转换。

2.权利要求1的装置，其进一步包含：连接器，其包含与所述气道器官连接的第一分支、第二分支、和第三分支；和所述连接器的所述第一分支和所述连接器的所述第二分支与所述连接器的所述第三分支连接的第一三通接合，所述三通接合包括开关，其配置为在所述第一分支和所述第二分支间转换；

其中：

所述湿式通风器系统配置为经由所述连接器的所述第一分支对所述器官供应湿式通气；

所述干式通风器系统配置为经由所述连接器的所述第二分支对所述器官供应干式通气；及所述控制器配置为控制所述第一三通接合的所述开关，由此控制湿式通气的投递或干式通气的投递。

3.权利要求1的装置，其进一步包含：贮液系统，其配置为：

通过进入线对所述器官供应细胞培养基；并通过外出线从所述器官排出废培养基，所述外出线包含第一分支、第二分支、和第三分支；和所述外出线的所述第一分支和所述外出线的所述第二分支与所述外出线的所述第三分支连接的第二三通接合。

4.权利要求2的装置，其进一步包含顺应室，其经由所述连接器的所述第一分支与所述器官连接，所述湿式通风器系统与所述顺应室连接。

5.权利要求4的装置，其中经由所述顺应室中湿式气道正压的增加来对所述器官室提供湿式呼气末正压(wPEEP)。

6.权利要求3的装置，其进一步包含：后负荷室，其：

经由所述外出线的所述第二分支与所述器官室连接；并经由外出回流线与所述贮液系统连接。

7.权利要求6的装置，其中所述贮液系统包含：第一贮液器，其经由进入线与所述器官室连接；和第二贮液器，其：

经由器官室引流器与所述器官室连接；并经由所述外出回流线与所述后负荷室连接，其中所述第一贮液器和第二贮液器通过贮液器进料线和贮液器引流管使培养基循环。

8.权利要求2的装置，其中所述干式通风器系统包含：包含喷雾器的干式通气室，其经由所述连接器的所述第二分支与所述器官连接；和第一干式通风器，其配置为对所述器官室提供干式呼气末正压(dPEEP)，并且其经由dPEEP线与所述干式通气室连接。

9.权利要求8的装置，其中所述干式通风器系统进一步包含：第二干式通风器，其经由干式通风器线与所述器官室连接。

10.权利要求8的装置，其进一步包含：气罐，其配置为对所述器官室、所述干式通气室、和贮液系统供应气体介质。

11.权利要求1的装置，其中所述控制器由计算机操作。

12.一种提供生物人工气道器官的方法，该方法包括：提供包含气道和实质血管系统的肺组织基质；

将所述肺组织基质安放在器官室中，用细胞接种所述肺组织基质；

通过所述气道和血管系统给所述肺组织基质提供湿式通气，其持续时间足以发生第一期望程度的器官成熟，以生成湿式成熟器官；并从通过所述气道给所述肺组织基质提供湿式通气转变为通过所述气道给所述湿式成熟器官提供干式通气，其持续时间足以发生第二期望程度的器官成熟，由此提供功能性生物人工肺。

13.权利要求12的方法，其进一步包括：通过所述器官的所述血管系统用内皮细胞接种所述肺组织基质；并通过所述器官的气道用表皮细胞接种所述肺组织基质。

14.权利要求13的方法，其进一步包括通过所述器官的血管系统用干细胞接种所述肺组织基质。

15.权利要求14的方法，其中所述干细胞是骨髓衍生的间充质干细胞或诱导的多能干(iPS)细胞。

16.权利要求14的方法，其中

将所述干细胞以每30cc流体1亿个细胞的浓度在流体中悬浮；

将所述内皮细胞以每10cc流体1亿个细胞的浓度在流体中悬浮；并将所述表皮细胞以每5cc流体1亿个细胞的浓度在流体中悬浮。

17.权利要求13的方法，其进一步包括：监测器官成熟的程度，直至已经发生所述第一期望程度的器官成熟，以生成湿式成熟器官；

对所述气道器官停止所述湿式通气；

对所述气道器官应用人工表面活化剂；并对所述气道器官开始所述干式通气。

18.权利要求12的方法，其中给所述肺组织基质提供湿式通气包括：经由湿式通风器线连接所述气道与湿式通风器；

经由湿式通气线连接所述器官与顺应室；

通过所述湿式通气线提高湿式气道压力；并通过增加所述顺应室中的湿式气道正压对所述器官提供湿式呼气末正压(wPEEP)。

19.权利要求18的方法，其中以生理潮气量提供所述湿式通气。

20.权利要求12的方法，其中给所述湿式成熟器官提供干式通气包括：经由干式通气线连接所述气道与干式通气室；

通过干式呼气末正压(dPEEP)线连接所述干式通气室与第一干式通风器；

通过所述干式通气线提高干式气道压力；

从所述气道断开所述湿式通气线；并经由干式通风器线连接所述器官室与第二干式通风器。

21.权利要求12的方法，其中所述肺组织基质包含去细胞化的人肺组织或人工肺基质。

22.权利要求12的方法，其中所述生物人工肺包含足以提供完整的肺功能或其一部分的细胞数目。

23.通过权利要求12-22中任一项的方法生成的生物人工肺。

24.权利要求23的生物人工肺，其中所述器官是完整的肺或其一部分。

说明书

生物人工肺

[0001] 对相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2009年6月4日提交的美国临时申请No.61/184,170和2009年10月29日提交的美国临时申请No.61/256,281的权益，通过提及而将其内容完整收入本文。

技术领域

[0003] 本文件提供了涉及组织生成的装置和方法。例如，本文件提供了用于生成人或动物受试者中的可移植肺组织的方法。

[0004] 发明背景

[0005] 肺移植物代表许多经历以肺衰竭为典型的状况，例如慢性阻塞性肺疾病(COPD)COPD、囊性纤维化病、肺癌、和先天性肺疾病等的患者的最后希望。肺移植的典型等待时间可以是2年以上，导致等待表上的那些人的30％死亡率。

[0006] 发明概述

[0007] 呈现了气道器官生物反应器装置。该装置具有器官室，其配置为容纳对之(onto)灌注细胞培养基以培养器官的器官基质支架。该装置进一步具有湿式通风器系统，其配置为经由连接器的第一分支对所述器官供应湿式通气。所述装置进一步具有干式通风器系统，其配置为经由连接器的第一分支对所述器官供应干式通气。所述装置进一步具有控制器，其配置为控制湿式通气的投递或干式通气的投递。

[0008] 所述装置可以进一步包含连接器，其包含与所述器官连接的第一分支、第二分支、和第三分支。所述装置进一步具有所述连接器的所述第一分支和所述连接器的所述第二分支与所述连接器的所述第三分支连接的第一三通接合(three-way junction)。所述三通接合包括开关，其可以配置为在所述第一分支和所述第二分支间转换。所述装置进一步具有湿式通风器系统，其配置为经由所述连接器的所述第一分支对所述器官供应湿式通气。所述装置进一步具有干式通风器系统，其配置为经由所述连接器的所述第二分支对所述器官供应干式通气。所述装置进一步具有控制器，其配置为控制所述第一三通接合的所述开关，由此控制湿式通气的投递或干式通气的投递。

[0009] 所述装置可以进一步包含贮液系统(reservoir system)，其配置为通过进入线(ingress line)对所述器官供应细胞培养基；并通过外出线(egress line)从所述器官排出废培养基，所述外出线包含第一分支、第二分支、和第三分支；和所述外出线的所述第一分支和所述外出线的所述第二分支与所述外出线的所述第三分支连接的第二三通接合。湿式通风器系统可以包含经由湿式通气线与所述器官室连接的湿式通风器；和经由所述连接器的所述第一分支与所述器官连接的顺应室(compliance chamber)。可以经由所述顺应室的提高对所述器官室提供湿式呼气末正压(wet positive and expiratory pressure，wPEEP)。所述装置可以进一步包含后负荷室，其经由所述外出线的所述第二分支与器官室连接；并经由外出回流线(egress return line)与贮液系统连接。贮液系统可以包含经由进入线与所述器官室连接的第一贮液器；和第二贮液器，其经由器官室引流器与器官室连接；并经由所述外出回流线与后负荷室连接，其中所述第一贮液器和第二贮液器通过贮液器进料线和贮液器引流管使培养基循环。干式通风器系统可以包含含有喷雾器的干式通气室，其经由所述连接器的所述第二分支与所述器官连接；和第一干式通风器，其配置为对所述器官室提供干式呼气末正压(dry positive and expiratory pressure，dPEEP)，并且其经由dPEEP线与所述干式通气室连接。干式通风器系统可以进一步包含第二干式通风器，其经由干式通风器线与所述器官室连接。所述装置可以进一步包含气罐，其配置为对所述器官室、所述干式通气室、和所述贮液系统供应气体介质。控制器可以由计算机操作。

[0010] 在另一方面，本文件的特征在于一种提供生物人工气道器官的方法。该方法可以包括提供包含肺组织基质(lung  tissue  matrix)和实质血管系统(substantial vasculature)的肺组织基质；用细胞接种所述肺组织基质；给组织提供湿式通气，其持续时间足以发生第一期望程度的器官成熟；并给所述湿式成熟器官提供干式通气，其持续时间足以发生第二期望程度的器官成熟，由此提供生物人工肺。该方法可以进一步包括通过所述器官的所述血管系统用内皮细胞接种所述肺组织基质；并通过所述器官的气道用表皮细胞接种气道肺组织基质。该方法可以进一步包括通过所述器官的血管系统用干细胞接种所述肺组织基质。所述干细胞可以是骨髓衍生的间充质干细胞或诱导的多能干(iPS)细胞。可以将所述干细胞以每30cc流体约1亿个细胞的浓度在流体中悬浮。可以将所述内皮细胞以每10cc流体约1亿个细胞的浓度在流体中悬浮。可以将所述表皮细胞以每5cc流体约1亿个细胞的浓度在流体中悬浮。所述方法可以进一步包括监测器官成熟的程度，直至已经发生第一期望程度的器官成熟；对所述器官停止所述湿式通气；对所述器官应用人工表面活化剂；并对所述器官开始所述干式通气。给所述肺组织基质提供湿式通气可以包括经由湿式通风器线连接所述气道与湿式通风器；经由湿式通气线连接所述器官与顺应室；通过所述湿式通气线提高湿式气道压力；并通过提高所述顺应室对所述器官提供湿式呼气末正压(wPEEP)。以生理潮气量提供所述湿式通气。给所述湿式成熟器官提供干式通气可以包括经由干式通气线连接所述气道与干式通气室；通过干式呼气末正压(dPEEP)线连接所述干式通气室与第一干式通风器；通过所述干式通气线提高干式气道压力；断开所述湿式通气线；并经由干式通风器线连接所述器官与第二干式通风器。所述肺组织基质可以包含去细胞化的人肺组织或人工肺基质。生物人工肺可以包含足以提供完整的肺功能或其一部分的细胞数目。

[0011] 在另一方面，本文件的特征在于通过本文中提供的方法生成的生物人工肺。生物人工肺可以是完整的肺或其一部分。

[0012] 在又一方面，本文件的特征在于一种治疗具有受损的或降低的肺容量的受试者的方法。该方法可以包括将生物人工肺移植入所述受试者中。

[0013] 除非另有定义，本文中所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然可以使用与本文中所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料来实施本发明，但是下文描述了合适的方法和材料。通过提及而完整收录本文中所提及的所有出版物、专利申请、专利、和其它参考文献。在冲突的情况中，应当以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法、和例子仅是例示性的，而并不意图为限制性的。

[0014] 在附图和下文描述中列出了本发明的一个或多个实施方案的详情。从描述和附图及从权利要求书看，本发明的其它特征、目的、和优点会是显而易见的。

[0015] 附图简述

[0016] 图1是例示性肺生物反应器的示意图。

[0017] 图2A、2B、2C、和2D是用于在肺生物反应器中培养肺组织的例示性方法的流程图。

[0018] 图3是例示性的肺去细胞化单元的示意图。

[0019] 图4是细胞接种模式的例示性肺生物反应器的示意图。

[0020] 图5是灌注模式的例示性肺生物反应器的示意图。

[0021] 图6是例示性肺生物反应器的示意图。

[0022] 发明详述

[0023] 本文件涉及牵涉器官生成的方法和材料。本发明至少部分基于配置为生成功能性肺组织的生物反应器的发现，所述生物反应器可以用于为准备好移植入人和其它动物中的功能性气道器官生长提供更实际的环境。通过给定的基质，例如人工的或去细胞化的肺组织基质生成肺组织。

[0024] 如本文中所使用的，“功能性”肺组织执行正常的健康肺的大多数或所有功能，例如容许将氧从空气运输到血流中，及将二氧化碳从血流释放到空气中。它湿润吸入的空气，生成表面活性剂以降低肺泡中的表面张力，而且生成并转运粘液以将吸入的微粒物质从远端移动到近端气道。

[0025] 如本文中所使用的，术语“去细胞化的”和“无细胞的”可互换使用，并且定义为使用标准的组织学染色方法在组织切片中完全或几乎完全没有可检出的胞内、内皮细胞、表皮细胞、和细胞核。优选地，但不必要地，还已经自去细胞化的器官或组织除去残留的细胞碎片。

[0026] 去细胞化的组织/器官基质

[0027] 用于制备去细胞化的肺组织基质的方法和材料是本领域中已知的。可以使用任何合适的材料来制备此类基质。在一个优选的实施方案中，组织基质可以是自去细胞化的肺组织形成的无细胞组织支架。例如，可以通过合适的方法来使诸如人肺等组织或其一部分去细胞化，以在维持组织或组织部分的形态学完整性和血管系统并保留胞外基质(ECM)蛋白的情况中自组织除去天然的细胞。在一些情况中，可以使用尸体的肺或其一部分。去细胞化方法可以包括使用液氮将组织(例如肺组织)进行重复冷冻-融化循环。在其它情况中，可以使组织受到阴离子或离子细胞破坏介质诸如十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇(PEG)、或TritonX-100处理。还可以用核酸酶溶液(例如，核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶)处理组织，并将其在无菌磷酸盐缓冲盐水中在温和搅动的情况中清洗。在一些情况中，可以使用本领域中已知的方法和材料通过将导管插入器官或组织的血管、导管、和/或腔来实施去细胞化。在插管步骤后，可以经由插管用如上文所描述的细胞破坏介质灌注器官或组织。灌注通过组织可以是顺行的或逆行的，并且可以交替方向以改善灌注效率。根据器官或组织的大小和重量和特定阴离子或离子去污剂及阴离子或离子去污剂在细胞破坏介质中的浓度，一般用细胞破坏介质对组织灌注约2至约12小时/克组织。包括清洗，可以对组织灌注多至约12至约72小时/克组织。一般针对生理状况调节灌注，包括流速和压力。

[0028] 去细胞化的组织可以基本上由组织的所有或大多数区域的胞外基质(ECM)组分，包括血管树的ECM组分组成。ECM组分可以包括下列任一或所有项：纤连蛋白、肌原纤蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、胶原家族成员(例如，胶原I、III、和IV)、糖胺聚糖、基质、网状纤维和血小板反应蛋白，其仍可以组织为限定的结构诸如基膜。在一个优选的实施方案中，去细胞化的肺组织基质保留基本上完整的血管系统。保留基本上完整的血管系统实现移植后组织基质与受试者血管系统的连接。另外，可以用例如照射(例如，UV、gamma)进一步处理去细胞化的组织基质以降低或消除保留于去细胞化的组织基质之上或之中的任何类型的微生物的存在。

[0029] 使用物理、化学、和酶手段来获得去细胞化的组织基质的方法是本领域中已知的，参见例如Liao等，Biomaterials 29(8)：1065-74(2008)；Gilbert等，Biomaterials 27(9)：3675-83(2006)；Teebken等，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.19：381-86(2000)。还可参见美国专利公开文本No.2009/0142836；2005/0256588；2007/0244568；及2003/0087428。

[0030] 人工器官基质

[0031] 用于制备人工器官基质的方法和材料是本领域中已知的。可以使用任何合适的材料来制备此类基质。在一个优选的实施方案中，人工器官基质可以是自多孔材料诸如例如聚乙醇酸、Pluronic F-127(PF-127)、Gelfoam海绵、胶原-糖胺聚糖(GAG)、血纤蛋白原-纤连蛋白-玻连蛋白水凝胶(FFVH)、和弹性蛋白开发的支架。参见例如Ingenito等，J Tissue Eng Regen Med.2009年12月17日；Hoganson等，Pediatric Research，2008年5月，63(5)：520-526；Chen等，Tissue Eng.2005年9月-10月；11(9-10)：1436-48。在一些情况中，人工器官基质可以具有与肺泡单元相似的多孔结构。参见Andrade等，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.2007年2月；292(2)：L510-8。在一些情况中，植入的人工器官基质可以表达器官特异性标志物(例如，克拉拉细胞、肺细胞、和呼吸上皮的肺特异性标志物)。在一些情况中，植入的人工器官基质可以组织成可鉴定的结构(例如，人工肺基质中与肺泡和末端支气管相似的结构)。例如，使用FFVH生成的植入的人工肺基质可以在体外促进细胞附着、扩散和胞外基质表达及在体内促进表观嫁接(apparent engraftment)，对周围组织具有营养效应的证据。参见Ingenito等，见上文。还可参见美国专利No.7,662,409和6,087,552；美国专利公开文本No.2010/0034791；2009/0075282；2009/0035855；2008/0292677；2008/
0131473；2007/0059293；2005/0196423；2003/0166274；2003/0129751；2002/0182261；
2002/0182241；及2002/0172705。

[0032] 细胞接种

[0033] 在本文中所描述的方法中，用细胞，例如分化的或再生的细胞接种肺组织基质，例如去细胞化的肺组织基质或人工肺基质。

[0034] 可以使用任何合适的再生细胞类型，诸如未处理的或未分化的细胞类型来接种肺组织基质。如本文中所使用的，再生细胞可以包括但不限于祖细胞、前体细胞、和“成人”衍生的干细胞(包括脐带细胞(例如，人脐静脉内皮细胞))和胎儿干细胞。再生细胞还可以包括分化的或定型的细胞类型。适合于本文中所提供的方法和材料的干细胞可以包括人诱导的多能干细胞(iPSC)、间充质干细胞、人脐静脉内皮细胞、多能成人祖细胞(MAPC)、或胚胎干细胞。在一些情况中，还可以使用源自其它组织的再生细胞。例如，可以使用源自皮肤、骨、肌肉、骨髓、滑膜、或脂肪组织的再生细胞来形成干细胞接种的组织基质。

[0035] 在一些情况中，可以用分化的细胞类型诸如人表皮细胞和内皮细胞来进一步接种本文中所提供的肺组织基质。例如，可以经由血管系统用内皮细胞，及经由灌注接种用表皮和间充质细胞以及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种肺基质。

[0036] 可以使用任何适用于分离并收集供接种用的细胞的方法。例如，诱导的多能干细胞一般可以自通过转录因子诸如Oct4、Sox2、Klf4、c-MYC、Nanog、和Lin28的异位表达“重编程”为多能状态的体细胞获得。参见Takahashi等，Cell 131：861-72(2007)；Park等，Nature 451：141-146(2008)；Yu等，Science318：1917-20(2007)。脐带血干细胞可以自新鲜的或冷冻的脐带血分离。间充质干细胞可以自例如粗制的未纯化的骨髓或经Ficoll纯化的骨髓分离。可以依照本领域中已知的方法从活的或尸体的供体，例如从会接受生物人工肺的受试者分离并收集表皮和内皮细胞。例如，表皮细胞可以自皮肤组织样品获得，而内皮细胞可以自血管组织样品获得。在一些实施方案中，经由放在血管系统中的导管将蛋白水解酶灌注到组织样品中。可以将经酶处理的组织的一部分进行进一步的酶和机械破坏。可以分离以此方式获得的细胞混合物以纯化表皮和内皮细胞。在一些情况中，基于特定细胞表面标志物的存在或缺乏，可以使用基于流式细胞术的方法(例如，荧光激活的细胞分选)来分选细胞。在使用非自体细胞的情况中，应当考虑选择免疫类型匹配的细胞，使得在植入受试者中时不会排除器官或组织。

[0037] 可以将分离的细胞在缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水)中漂洗，并在细胞培养基中重悬。可以使用标准的细胞培养方法来培养并扩充细胞群。一旦获得，可以使细胞与组织基质接触以接种基质。例如，可以以任何合适细胞密度在体外用至少一种细胞类型接种组3
织基质。例如，用于接种基质的细胞密度可以是至少1x10个细胞/克基质。可以使用范围可以为约1x105至约1x1010个细胞/克基质(例如，至少100,000、1,000,000、10,000,000、100,
000,000、1,000,000,000、或10,000,000,000个细胞/克基质)的细胞密度。

[0038] 在一些情况中，可以通过灌注接种以上文所描述的细胞类型和细胞密度接种如本文中所提供的去细胞化的或人工的肺组织基质。例如，经由保留于组织基质中的血管系统，可以使用流动灌注系统来接种去细胞化的肺组织基质。在一些情况中，可以在合适的条件下使用自动化流动灌注系统。此类灌注接种方法可以改善接种效率，并且在整个组成中提供更一致分布的细胞。可以使用定量生物化学和图像分析技术来评估静态或灌注接种方法后的接种细胞的分布。

[0039] 在一些情况中，可以给组织基质注入一种或多种生长因子以刺激接种的再生细胞的分化。例如，可以给组织基质注入适合于本文中所提供的方法和材料的生长因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)、TGF-β生长因子、骨形态发生蛋白(例如，BMP-1、BMP-4)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)，例如FGF-10、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、或生长分化因子-5(GDF-5)。参见例如Desai和Cardoso，Respir.Res.3：2(2002)。

[0040] 可以将接种的组织基质在接种后温育一段时间(例如从几小时至约14天或更多)以改善细胞在组织基质中的固定和渗透。可以在如下的条件下维持接种的组织基质，其中至少一些再生细胞可以在无细胞组织基质之内和之上增殖和/或分化。此类条件可以包括但不限于合适的温度和/或压力、电和/或机械活动(例如，通风)、力、合适量的O2和/或CO2、合适量的湿度、和无菌或接近无菌的条件。此类条件还可以包括湿式通气、湿式至干式通气和干式通气。在一些情况中，可以将营养补充物(例如，营养物和/或碳源诸如葡萄糖)、外源激素、或生长因子添加到接种的组织基质。可以实施组织学和细胞染色以测定接种细胞增殖。可以实施任何合适的方法来测定接种细胞分化。一般而言，本文中所描述的方法会在例如如本文中所描述的气道器官生物反应器装置中实施。

[0041] 如此，可以使用本文中所描述的方法来生成可移植的生物人工肺组织，例如用于对人受试者移植。如本文中所描述的，可移植的组织会优选地保留足够完整的血管系统，其可以与患者的血管系统连接。

[0042] 本文中所描述的生物人工肺组织可以与包装材料组合以生成制造商品或试剂盒。用于生产制造商品的组分和方法是公知的。在生物人工组织外，制造商品或试剂盒可以进一步包括例如一种或多种抗粘合剂、无菌水、药用载体、缓冲液、和/或用于促进体外和/或移植后功能性肺组织形成的其它试剂。另外，此类制造商品中可以包含描述可如何使用其中含有的组合物的印刷指令。制造商品或试剂盒中的组分可以在多种合适的容器中包装。

[0043] 使用生物人工肺的方法

[0044] 本文件还提供了使用生物人工肺组织及在一些情况中促进肺功能的方法和材料。在一些实施方案中，可以使用本文中所提供的方法来恢复损害或降低肺容量的疾病(例如，囊性纤维化病、COPD、肺气肿、肺癌、哮喘、肺创伤、或其它遗传性或先天性肺异常，例如支气管源性囊肿、肺发育不全和低常增生(pulmonary agenesis and hypoplasia)、多肺泡叶、肺泡毛细管发育异常、隔离，包括动静脉畸形(AVM)和弯刀综合征(scimitar syndrome)、肺淋巴管扩张(pulmonary lymphangiectasis)、先天性肺叶性肺气肿(CLE)、和囊性腺瘤样畸形(CAM)和其它肺囊肿)患者中的一些肺功能。本文中所提供的方法还包括如下那些，其中受试者鉴定为需要特定的规定治疗，例如，升高的肺功能、或增加或改善的肺容量。

[0045] 可以依照本文中所提供的方法来生成生物人工肺组织(例如，整个器官或其一部分)。在一些实施方案中，该方法包括对有此需要的受试者(例如，人患者)移植如本文中所提供的生物人工肺组织。在一些实施方案中，对患病或损伤组织部位移植生物人工肺组织。例如，可以将生物人工肺组织移植入受试者的胸腔中，替换不发挥功能或发挥功能不良的肺(或与其一起)；用于实施肺移植的方法是本领域中已知的，参见例如Boasquevisque等，Surgical Techniques：Lung Transplant and Lung Volume Reduction，Proceedings of the American Thoracic Society 6：66-78(2009)；Camargo等，Surgical maneuvers for the management of bronchial complications in lung transplantation，Eur J Cardiothorac Surg 2008；34：1206-1209(2008)；Yoshida等，“Surgical Technique of Experimental Lung Transplantation in Rabbits，”Ann Thorac Cardiovasc Surg.11(1)：7-11(2005)；Venuta等，Evolving Techniques and Perspectives in Lung Transplantation，Transplantation Proceedings 37(6)：2682-2683(2005)；Yang和Conte，Transplantation Proceedings 32(7)：1521-1522(2000)；Gaissert和Patterson，Surgical Techniques of Single and Bilateral Lung Transplantation in The Transplantation and Replacement of Thoracic Organs，第2版Springer Netherlands(1996)。

[0046] 所述方法可以包括在部分或完全除去受试者的肺的手术方法过程中和/或肺切除过程中移植如本文中所提供的生物人工肺或其一部分。在一些情况中，可以使用本文中所提供的方法来替换或补充受试者，例如人或动物受试者中的肺组织和功能。

[0047] 可以实施任何合适的方法来测定移植之前或之后的肺功能。例如，可以实施方法来评估组织愈合、评估功能性、及评估细胞向内生长(in-growth)。在一些情况中，可以将组织的一部分收集，并用固定剂诸如例如中性缓冲福尔马林处理。可以将此类组织的一部分脱水，在石蜡中包埋，并用切片机切片以进行组织学分析。可以将切片用苏木精和曙红(H&E)染色，然后安放于玻璃载玻片上以用显微镜评估形态学和细胞性。例如，可以实施组织学和细胞染色来检测接种的细胞增殖。测定法可以包括移植的组织基质的功能性评估或成像技术(例如，计算机断层摄影术(CT)、超声、或磁共振成像(例如，造影剂增强的MRI))。测定法可以进一步包括在静息和生理应激下的功能性测试(例如，身体体积描记术(body pletysmography)、肺功能测试)。可以使用本领域中已知的方法，例如组织学、电子显微术、和机械测试(例如体积和顺从性的)来测定用细胞接种的基质的功能性。气体交换可以作为另一种功能性测定法测量。为了测定细胞增殖，可以例如通过检测胸苷掺入来测量胸苷激酶活性。在一些情况中，基于血液中的氧水平，可以实施血液测试来评估肺功能。

[0048] 在一些情况中，可以使用分子生物学技术诸如RT-PCR来量化代谢和分化标志物的表达。可以使用任何合适的RT-PCR方案。简言之，可以如下收集总RNA，即将生物学样品(例如腱样品)均质化，实施氯仿提取，并使用旋转柱(例如， 微量旋转柱(QIAGEN，Valencia，CA))或其它核酸结合基质来提取总RNA。在其它情况中，可以使用抗体和标准的免疫测定法来检测与肺细胞类型和不同分化阶段有关的标志物。

[0049] 气道器官生物反应器装置

[0050] 图1中呈现了例示性的气道器官生物反应器装置。贯穿整个说明书，肺会作为气道器官的例子提供。其它例子可以包括例如气管。

[0051] 参考图1，生物反应器的组分包括肺室102、气道连接器、和控制器(未显示)，所述气道连接器包含气管线124、湿式通气线150、和干式通气线134、湿式通风器系统120、干式通风器系统116和118、气管线124、湿式通气线150、与干式通气线134间接合处的三通连接器148。控制器是计算机操作的，而且也是手工操作的。生物反应器还可以包含肺动脉线122、肺静脉线126、贮液系统104和106、滚子泵(roller pump)114、气罐122及伴随的气体线、后负荷室110、肺静脉回流线136、和肺室压力线128。生物反应器进一步包含顺应室109和顺应室引流管146。另外或取而代之，生物反应器可以进一步包含膜式氧合器以提供灌注培养基溶液的氧合和碳化(未显示)。

[0052] 肺室102容纳去细胞化的肺基质支架。肺室102是闭合的以提供无菌肺培养环境。肺基质的肺动脉与肺动脉线122连接，并且肺基质的肺静脉与肺动脉血管126连接，其各经由血管插管连接。肺基质的气管经由气管线124与气道连接器连接。

[0053] 在肺室102内，用细胞培养基顺行灌注细胞基质以容许接种细胞，从而培养肺。通过肺动脉线122对肺动脉发生灌注。从那里起，培养基流过肺血管系统，并且流出到贮液系统(104和106)。

[0054] 贮液系统包括第一贮液器104和第二贮液器106，及贮液器补料线140和贮液器引流管(140)。细胞培养基经由贮液器补料线138和贮液器引流管140在贮液器104和106间循环。任选地，可以将微滤器放置于进料线140中以进行无菌过滤。细胞培养基还在贮液器104和106中氧合。对于灌注，经由滚子泵114或经由重力将细胞培养基从贮液器104经由肺动脉线122对肺动脉补料。

[0055] 经由肺室引流管(4)从肺室102直接吸出流出到贮液器106的培养基以维持肺室102内的恒定流体水平。经由第三连接器126流出肺的培养基经由重力排到后负荷室110，并且经由后负荷室引流管136吸到贮液器106。后负荷室110经由肺室压力线130与肺室102并且经由肺静脉回流线136与贮液器106连接。肺室压力线平衡肺室102和后负荷室110中的压力。后负荷室110还经由气管与肺室102并经由三通接合156与湿式通气线连接。

[0056] 将细胞再导入基质中的一种例示性方法如下。在肺基质的灌注过程中，开始基质的细胞化。经由肺动脉线122接种悬浮于约30cc培养基中的约1亿个间充质细胞。间充质细胞是骨髓衍生的胚胎干细胞，但是也可以是例如iPS或造血细胞，如记载于U.S.S.N.12/233,017，“Generation of Inner Ear Cells”的，通过提及而将其内容完整收录。在一些实施方案中，在完成接种后，停止灌注，例如持续约60分钟，以容许细胞附着。在灌注停止期间，从气管和肺静脉排出细胞培养基；然后，排出的细胞培养基流到贮液器106。在60分钟停止后，继续仅用培养基灌注，例如持续约24小时。为了维持顺应室109中恒定的培养基水平，可以经由别的线将其与贮液器104连接(未显示)。

[0057] 接着，建立用于接种内皮细胞的条件。气管线124经由三通接合148及其控制器与湿式通气线150连接。三通接合156使用其控制器来转动，以连接湿式通气线150与顺应室109。顺应室109提供湿式气道正压(wAP)以限制净培养基流过间质空间和气管，同时将气道压力限于生理范围。经由室109的调节来调节wAP。因此，细胞培养基的一部分经由肺静脉线(3)排出到贮液器106，而细胞培养基的更小部分经由淋巴系统经由肺室引流线128排出到贮液器106。

[0058] 经由约10分钟的重力补料经由肺动脉线122接种悬浮于约15cc培养基中的约1亿个内皮细胞。在完成接种后，停止灌注，例如持续60分钟以容许细胞附着。停止后，继续灌注，例如持续约3-5天以容许内皮细胞单层的形成。

[0059] 在已经将内皮细胞接种，并已经形成内皮细胞单层后，内皮细胞准备好接种。对于内皮细胞的接种，三通接合156使用其控制器来转动以堵塞湿式通气线150。经由气管线124将悬浮于约15cc培养基中的约2亿个内皮细胞接种入气管中。在一些实施方案中，内皮细胞是肺细胞。在完成接种后，停止经由肺动脉的灌注，例如持续约60分钟。

[0060] 此外，一旦已经完成肺的细胞接种，需要湿式通气以将细胞悬浮液推进到外周气道中。湿式通风器系统120通过湿式通气线150对肺提供湿式通气。

[0061] 三通接合156使用其控制器来转动以连接湿式通气线150与顺应室109。提高wAP以对间质空间提供小的流动，并且提高细胞附着。对肺提供湿式通气达约5分钟，保持约60分钟，然后再对肺提供约5分钟，然后保持约24小时。以生理潮气量(对于人而言为约500mL)而以降低的速率提供湿式通气以将湿式的峰吸气和呼气压力保持较低。经由提高顺应室109提供湿式呼气末正压。

[0062] 一旦恢复灌注，提供顺行灌注和湿式通气达一段约5天的时间以实现组织形成。

[0063] 在约5天期间后或在测定肺已经达到足够成熟的监测(未显示)后进行从湿式向干式通气的转换。经由气管线124施用人工表面活性剂。然后，三通接合148使用其控制器来转动，从而气管线124与干式通气线150和干式通气系统(116和118)连接。干式通气系统包括具有用于提供湿润空气的喷雾器(未显示)的干式通气室112、第一干式通风器116、和第二干式通风器118。干式通气室112经由干PEEP线144与第一干式通风器116并经由干式通气线150与气管线连接。因此，使肺通风以用气体而不是流体缓慢充满其空间。所使用的气体是经由气体线通过气罐122供应的碳合气(carbogen)。干式通风器116配置为对干式通气室
112提供dPEEP，随后实现肺室102中的流体排出。

[0064] 接着，分离湿式通气系统120，并对肺室打开干式通风器118以将通风速率提高至生理速率，对肺室102排空流体，并在肺室102内使肺围绕湿润的空气。组织成熟的约3天后，实施灌注气体分析以确认功能性组织的形成，及可以自生物反应器取出肺。

[0065] 在湿式通气与干式通气间的转换中，肺在模拟肺天然形成条件的条件下形成。已经确定了此环境是肺形成必需的，并且如所描述的生物反应器提供了生成供移植用的组织工程化改造肺需要的系统和方法。

[0066] 图2A中显示了使肺基质细胞化的例示性方法。将肺基质放置210入肺室中。然后，通过肺动脉线用细胞培养基灌注220肺基质。然后，给肺基质提供230湿式通气。最后，给肺基质提供干式通气240。

[0067] 在肺基质的灌注220期间，如图2B中所例示的，通过肺的血管系统用间充质细胞或其它干细胞接种222肺基质。然后，通过肺血管系统用内皮细胞接种224肺基质。然后，通过肺气道用表皮细胞接种226肺基质。

[0068] 为了提供湿式通气，如图2C中所显示的，肺气道通过湿式通风器线与湿式通风器连接231。然后，肺经由湿式通气线与顺应室连接232。通过调节顺应室内的流体高度，然后通过湿式通气线提高233湿式气道压力。此外，通过提高顺应室，然后提供234湿式PEEP(wPEEP)。监测235肺基质上生长的肺的成熟程度。如果成熟程度测定236为可接受，那么开始237转变成干式通气。

[0069] 为了提供干式通气，如图2D中所显示的，经由气管应用241人工表面活性剂。然后，气管经由干式通气线与干式通气室连接242。干式通气室通过dPEEP线与第一干式通风器连接243。然后，通过干式通气线提高244干气道压力。分离湿式通气线245，并且肺室与第二干式通风器连接246。

[0070] 完整的大鼠肺可能需要总共约2亿-4亿个细胞。外推到人提供了对于完整的肺而言约2百亿-约4百亿个细胞的估计值。生成此类数目的细胞可能比患者可具有数目多需要几倍。需要某一肺功能百分比，比如说20％的患者仅会需要此数目的约20％，并且会必须为新的肺等待少得成比例的时间。

[0071] 图3中呈现了器官去细胞化中使用的例示性气道器官生物反应器装置。如上文所描述的，肺会作为气道器官的例子提供。参考图3，生物反应器的组分包括肺室302、密封的重力贮液器304、和大贮液器306，其中贮液器304和306含有用于灌注入肺室302中的肺中的去细胞化溶液。去细胞化溶液经由贮液器补料线314在贮液器304和306间循环。肺基质的肺动脉与肺动脉线308连接，经由所述肺动脉线308，去细胞化溶液经由重力流从贮液器304灌注到肺组织中。在去细胞化后，自肺室302除去废物。在一些情况中，经由补料入贮液器306中的泵312再循环来自肺室302的溶液。

[0072] 图4中呈现了细胞接种中使用的例示性气道器官生物反应器装置。参考图4，生物反应器的组分包括肺室402、密封的重力贮液器404、和大贮液器406，其中贮液器404和406含有用于灌注入肺室302中的肺中的细胞培养基。细胞培养基经由贮液器进料线408在贮液器404和406间循环。肺基质的肺动脉与肺动脉线410连接，并且肺基质的肺静脉与肺静脉线412连接，其各经由血管插管连接。对于细胞接种，经由泵或经由重力将细胞培养基从贮液器404经由肺动脉线410对肺动脉供应细胞培养基。经由第三连接器412流出肺的培养基(静脉流出物)经由重力排到后负荷顺应室420，并且经由后负荷室引流管吸到贮液器406。后负荷室420经由肺室压力线与肺室402并经由肺静脉回流线412与贮液器406连接。肺室压力线平衡肺室402和后负荷室420中的压力。后负荷室420还经由气管与肺室402并经由三通接合
414与湿式通气线连接。

[0073] 气管线经由三通接合414及其控制器与湿式通气线连接。三通接合414使用其控制器转动以连接湿式通气线与顺应室420。顺应室420提供湿式气道正压力(wAP)以限制净培养基流过间质空间和气管，同时将气道压力限制于生理范围。经由室420的调节来调节wAP。因此，细胞培养基的一部分经由肺静脉线412排出到贮液器406，而细胞培养基的更小部分经由淋巴系统经由肺室引流线排出到贮液器406。

[0074] 图5中呈现了基质灌注中使用的例示性气道器官生物反应器装置。参考图5，生物反应器的组分包括肺室502、密封的重力贮液器504、和大贮液器506，其中贮液器504和506含有用于灌注入肺室502中的肺中的溶液(例如，血液)。细胞培养基经由贮液器进料线508在贮液器504和506间循环。肺基质的肺动脉与肺动脉线510连接，并且肺基质的肺静脉与肺动脉血管512连接，其各经由血管插管连接。在细胞接种后，需要湿式通气以将细胞悬浮液推进到外周气道中。湿式通风器系统518通过湿式通气线对肺提供湿式通气。然后，三通接合514使用其控制器转动，从而气管线与干式通气线和干式通气系统516连接。

[0075] 图6中呈现了例示性的气道器官生物反应器装置。参考图6，生物反应器的组分包括肺室602、密封的重力贮液器616、和大贮液器606，其中贮液器616和606含有用于灌注入肺室602中的肺中的灌注溶液。溶液经由贮液器进料线在贮液器616和606间循环。肺基质的肺动脉与肺动脉线626连接，并且肺基质的肺静脉与肺动脉血管628连接，其各经由血管插管连接。对于细胞接种，经由泵或经由重力将培养基从贮液器616经由肺动脉线626对肺动脉供应培养基。经由第三连接器628流出肺的培养基(静脉流出物)经由重力排到后负荷顺应室604，并且经由后负荷室引流管吸到贮液器606。为了维持顺应室604中恒定的培养基水平，可以经由别的线将其与贮液器606连接(未显示)。湿式通风器系统624通过湿式通气线对肺提供湿式通气。三通接合620使用其控制器来转动，以连接湿式通气线与顺应室604。

[0076] 在约5天期间后或在测定肺已经达到足够成熟的监测(未显示)后进行从湿式向干式通气的转换。经由气管线630施用人工表面活性剂。然后，三通接合620使用其控制器来转动，从而气管线630与干式通气线和干式通气系统622连接。使肺通风以用气体而不是流体缓慢充满其空间。

[0077] 本发明会在以下实施例中进一步描述，所述实施例并不限制权利要求书中所描述的本发明的范围。实施例

[0078] 基于灌注去细胞化基质支架的肺再生

[0079] 自肝素化的成年SD大鼠(n＝20)分离肺，并使用去污剂灌注来使其去细胞化。使用组织学、电子显微术和机械测试来分析所得的胞外基质(ECM)支架。将支架安放在生物反应器中，并用人脐带内皮细胞(HUVEC，n＝4)、HUVEC和人肺泡基底表皮细胞(H-A549，n＝4)、和HUVEC和大鼠胎儿肺细胞(H-FLC，n＝2)接种。将培养物维持多达7天。使用血液灌注和通气在分离的肺装置中分析肺功能，正常的肺充当对照(n＝4)。

[0080] 尸体肺的灌注去细胞化产生具有完整气道和血管结构的无细胞肺ECM支架。肺支架可以再殖入(repopulate)内皮和表皮细胞，并且在生物反应器中维持。与正常的肺(465.8mmHg)相比，气体交换(PaO2/FiO2率)在H-A549构建体中较低(103.6mmHg)，并且在H-FLC构建体中相等(455.1mmHg)。顺从性在去细胞化的肺中降低(0.27ml/cmH2O/s)，但是在H-FLC构建体(0.67ml/cmH2O/s)和正常的肺(0.69ml/cmH2O/s)中相等。

[0081] 尸体肺的灌注去细胞化产生完整的全肺ECM支架，其可以用表皮和内皮细胞接种以形成与正常的肺具有相当的通气、灌注和气体交换的生物人工肺。

[0082] 其它实施方案

[0083] 应当理解，虽然本发明已经结合其详细的说明书进行描述，但是前述说明书意图例示而非限制本发明的范围，其由所附权利要求书的范围限制。其它方面、优点、和修饰在所附权利要求书的范围内。