酶法精制中药提取物的方法

摘要

本发明涉及一种酶法精制中药提取物的方法，该方法包括以下步骤：1)获取中药材的水或醇提取物，浓缩成为中药浓缩提取液；2)将步骤1)获得的中药浓缩提取液中加入至反应器中，然后向反应器中按每100重量份所述中药浓缩提取液加入0.01-5重量份的量加入一种或多种选自下列的酶：纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、中性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶，形成混合物并将得到的混合物在反应器中搅拌以形成均匀的混合物；3)将步骤2)中获得的均匀的混合物在40～60℃下，在pH 3-5的条件下反应2-3小时，获得中药提取物澄清液。所述方法可以根据需要重复多次。

权利要求

1.一种酶法精制栀子提取物的方法，该方法包括以下步骤：

1)获取栀子的水提取物，浓缩成为在25℃相对密度为1.036的栀子浓缩提取液；

2)将步骤1)获得的栀子浓缩提取液加入至反应器中，然后向反应器中按每100重量份所述栀子浓缩提取液0.5-1重量份的量加入纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、β-葡聚糖酶和复合酶，形成混合物，并将得到的混合物在反应器中搅拌以形成均匀的混合物；

3)将步骤2)中获得的均匀的混合物在50℃，pH 3-5的条件下反应2-3小时，获得栀子提取物澄清液，其中所用的纤维素酶的效价为4000IU/g，果胶酶的效价大于500U/mg，木聚糖酶的效价为100万/g，中性蛋白酶的效价为100万/g，木瓜蛋白酶的效价为100万/g，β-葡聚糖酶的效价为1∶3000，所述复合酶由纤维素酶和果胶酶以按重量计1∶1的配比组成。

2.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括：4)将步骤3)获得的栀子提取物澄清液经大孔吸附树脂吸附，并收集洗脱液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤4)中使用的大孔吸附树脂选自非极性至弱极性大孔树脂中的任一种。

说明书

酶法精制中药提取物的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种中药提取物的精制方法，即涉及一种采用酶法精制中药提取物的方法。

背景技术

[0002] 近年来酶工程在食品加工中的应用非常广泛，所用的酶种类越来越多，数量也越来越大，人类已开发出应用于果蔬、啤酒、饮料中的多种酶类如果胶酶、果胶酯酶、纤维素酶、鼠李糖苷酶、中性蛋白酶、半乳甘露聚糖酶、液化葡萄糖苷酶等，其中使用最多的是果胶酶和纤维素酶。

[0003] 国外于20世纪30年代已工业化使用酶类。而国内的研究则始于上世纪60年代，80年代末才开始工业化生产。在天然产物生产过程中，果胶酶可以快速彻底地脱除果胶，降低果汁黏度，利于果汁过滤澄清滤液且澄清度稳定。

[0004] 果胶酶(pectolytic enzyme或pectinase)是指普遍存在于细菌、真菌和植物中是分解果胶类物质的多种酶的总称。在果蔬加工、饲料、纺织和造纸工业中应用非常广泛。

[0005] 在果蔬汁生产中，果胶酶是最重要的酶制剂之一，已被广泛应用于果蔬汁的提取和澄清、改善果蔬汁的可过滤性，以及植物组织的浸渍和提取。目前在果蔬汁加工业中，已广泛采用果胶酶降解果蔬细胞壁以改善压榨性能、降低黏度、增加出汁率和进步营养成分。使用果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶可促进细胞分离，细胞壁变软，这特别适于水果和蔬菜[1]。果胶酶作用于果胶质中D-半乳糖醛酸残基之间的糖苷键，使高分子的聚半乳糖醛酸降为小分子物质。可以较大幅度地进步果蔬品种的出汁率，改善其过滤速度和保证产品贮存稳定性[2]。

[0006] 果胶酶除降低黏度外，还可产生絮凝作用，使果蔬汁澄清。澄清机理的实质包括果胶的酶促水解和非酶的静电絮凝两部分。果汁中有很多物质如纤维素、蛋白质、淀粉、果胶物质等影响澄清且果胶物质是造成果汁混浊的主要因素。在樱桃汁的加工过程中添加果胶酶，使果胶水解，从而使樱桃汁黏度降低，过滤阻力减小，过滤速度加快；同时由于樱桃汁中的悬浮果粒失去高分子果胶的保护，很容易发生沉降，而使上层汁液清亮在以后的澄清过程中明胶澄清剂的用量便可大大减少，甚至免加澄清剂[3]。

[0007] 中药材中，尤其是根类药材中常常含有许多粘性物质，一般而言，这些粘性物质通常包括蛋白质，淀粉，鞣质，果胶，粘液质等。这些物质的存在会影响中药提取液的黏度和澄清度，因而会影响中药有效部位的进一步纯化。为此，此类药材的提取物在提取之后常常需要澄清步骤，依据杂质的类型，常用的澄清方法如水提取醇沉淀法，醇提取水沉淀法等。尽管上述方法有一定效果，但对于高纯中药的生产远远达不到要求，尤其含有果胶酶较多的药材，不仅导致产率下降，还消耗较多的能量并使处理成本增加。

[0008] 目前，生物酶在中药提取方面的工业化应用也已进入初级开发阶段。部分中药材的细胞壁是由纤维素构成的，植物的有效成分往往包裹在细胞壁内。纤维素是β-D-葡萄糖以1，4-β葡糖苷链连接的，用纤维素可破坏β-D-葡萄糖键，进而有利于有效成分的提取。根据这原理，国内有人将其用于黄柏提取小檗碱中的预处理，并与未加酶的提取进行对比实验，收率提高。有人将木瓜蛋白酶用于补骨脂煎提前的预处理，补骨脂系豆科植物补骨脂的种子，含有丰富的蛋白质，蛋白质在煎煮过程中，遇热凝固，影响其他有效成分的煎出。因此可在煎提前用木瓜蛋白酶对补骨脂粉进行预处理，将蛋白质水解成肽及氨基酸类，遇热不再凝固，从而促进各种有效成分煎出量的增加。

[0009] 国内有一些企业和科研机构研发了一批纤维素酶应用于中药制药的技术与产品，并获得了国内专利，但为数不多。在这些专利中，除了仅采用纤维素酶的外，还有采用纤维素酶与另一种或几种酶组成复合酶类酶解提取中药，但没有用于澄清和降低黏度。

[0010] 由此可见，目前上述酶精制方法在食品加工中应用很广泛，而在中药行业应用仅限于中药提取中，目的为了增加提取率，并未在提取液精制处理中使用。因此需要一种工艺简单、操作方便、快捷，大大降低水、电、澄清剂(或者乙醇)消耗的中药材提取液精制处理的工艺，用于对澄清度要求较高的产品的处理中。

发明内容

[0011] 为此，本发明提供了一种酶法精制中药提取物的方法(以下称“本发明的方法”)，该方法包括以下步骤：

[0012] 1)获取中药材的水或醇提取物，浓缩成为中药浓缩提取液；

[0013] 2)将步骤1)获得的中药浓缩提取液中加入至反应器中，然后向反应器中按每100重量份所述中药浓缩提取液加入0.01-5重量份的量加入一种或多种选自下列的酶：纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、中性蛋白酶、木聚糖酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶，形成混合物并将得到的混合物在反应器中搅拌以形成均匀的混合物；

[0014] 3)将步骤2)中获得的均匀的混合物在40～60℃下，在pH 3-5的条件下反应2-3小时，获得中药提取物澄清液。

[0015] 在本发明的方法的一个实施方案中，其中所述的中药材是含粘性物质的药材。

[0016] 在本发明的方法的另一个实施方案中，其中步骤1中所述酶的用量为按每100重量份所述中药浓缩提取液加入0.01-5重量份，优选0.05-1重量份。

[0017] 在本发明的方法的一个实施方案中，其中步骤2)中使用的酶为纤维素酶或果胶酶。

[0018] 在本发明的方法的一个实施方案中，其中步骤2)中使用的酶为两种酶组成的复合酶，优选纤维素酶和果胶酶的组合，所述两种酶的配比为按重量计1∶1。

[0019] 在本发明的方法的一个实施方案中，该方法还包括：检测步骤3)中获得的中药提取物澄清液的黏度，若该黏度与步骤1)中获得的中药浓缩提取物的黏度相比减小约5％以下，则采用不同于上一次所使用的酶或酶的组合重复步骤1)-3)。

[0020] 在本发明的方法中，步骤3)中获得的中药提取物澄清液的黏度与步骤1)中获得的中药浓缩提取液的黏度相比减小5-95％，更优选减小10-95％和最优选减小20-95％。

[0021] 在本发明的方法的一个实施方案中，该方法还包括：

[0022] 4)将步骤3)获得的中药提取物澄清液经大孔吸附树脂吸附，并收集洗脱液。

[0023] 在本发明的方法的一个优选实施方案中，其中步骤4)中的大孔吸附树脂选自非极性至弱极性大孔树脂中的任一种。

[0024] 本发明通过加入果胶酶、纤维素酶、混合酶分解中药提取物中的果胶、纤维素等，降低了特性粘数，取代了醇沉法去除果胶、纤维素、多糖等，减少了水、电、乙醇等沉淀剂的大量消耗，有利于进一步分离、纯化中药有效部位成分(注：本发明受国家自然科学基金30772755，30830118；国家科技重大专项2009ZX09103-317资助)。

具体实施方式

[0025] 本发明的方法是一种酶法精制中药提取物的方法，该方法包括以下步骤：

[0026] 1)获取中药材的水或醇提取物，浓缩成为中药浓缩提取液；

[0027] 2)将步骤1)获得的中药浓缩提取液中加入至反应器中，然后向反应器中按每100重量份所述中药浓缩提取液加入0.01-5重量份的量加入一种或多种选自下列的酶：纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、中性蛋白酶、木聚糖酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶，形成混合物并将得到的混合物在反应器中搅拌以形成均匀的混合物；

[0028] 3)将步骤2)中获得的均匀的混合物在40～60℃下，在pH 3-5的条件下反应2-3小时，获得中药提取物澄清液。

[0029] 在本发明的方法的一个实施方案中，其中所述的中药材是含粘性物质的药材，包括动物和植物药材。对于植物药材，含有粘性物质的部位包括不同用药部位，例如根类、根茎类、皮类、花、果实、种子等。这样的药材的例子包括，但不限于，熟地黄、枸杞、桂圆、山茱萸、黄精、玉竹、蒲黄、天门冬、麦冬、白术、川木香、车前子、胖大海、大黄、知母、石斛、款冬花、茯苓、龙骨、葶苈子等。

[0030] 在本发明的方法中，中药材的提取可以使用水或有机溶剂例如醇来提取，所述醇可以是浓度为30-100％的甲醇、乙醇等，优选使用50～95％的乙醇。中药提取方法可以参照常规的中药提取方法，一般步骤为：将药材粉碎，每次加入适量水或有机溶剂(例如，药材重量的6～10倍)，加热煮沸保持1～2小时/次，提取2-5次，优选2-3次，将所得提取液合并。

[0031] 在本发明的方法中的一个实施方案中，在进行酶精制之前，步骤1)中获得的的中药提取液可以被浓缩到到相对密度1.05～1.30(60℃热测)以尽量减少酶用量。

[0032] 在本发明的方法中，在加入至反应器之前，步骤1)中获得的中药浓缩提取液可以预先冷却至室温，然后再加入至反应器中。

[0033] 在本发明的方法的另一个实施方案中，其中步骤1)中所述酶的用量为按每100重量份所述中药浓缩提取液加入0.01-5重量份，优选0.05-1重量份。所述酶可以在称取适当重量后直接加入至中药浓缩提取液中，也可以用少量的蒸馏水或用于提取中药的有机溶剂稍加溶解和稀释后加入。例如，如酶在水中的溶解性小时，可以称量后加入少量蒸馏水或中药提取液(浸透为准，大约2g/ml)后调成糊状，然后加入至中药浓缩提取液中以便于分散。本领域技术人员可以根据所用药材、浓缩中药提取物的黏度、所用酶或酶的组合等来综合确定酶的用量。

[0034] 在本发明的方法的一个实施方案中，其中步骤2)中使用的酶优选纤维素酶或果胶酶，因为中药材大多为植物，其中纤维素和果胶含量较为丰富。

[0035] 在本发明的方法的一个实施方案中，其中步骤2)中使用的酶为两种酶组成的复合酶，优选纤维素酶和果胶酶的组合，所述两种酶的配比为按重量计1∶1。如果采用其他酶的组合，也可以按照1∶1的重量配比来使用。

[0036] 在本发明的方法中所使用的酶不受限制，可以是市售的，也可以是根据本领域所公知的常规方法制备的。

[0037] 在本发明的方法中，反应器的选择不受限制，只要能够进行中药材的提取，可以根据提取规模使用容器反应釜、蒸发罐等。在本发明的方法中，在反应器中混合酶和中药浓缩提取液的方法不受限制，可以根据反应器的规模和类型采用本领域中公知的方法，如搅拌棒、搅拌器、混合器等。在混合时优选控制反应混合物的温度，使得反应器内的温度不超过所使用的酶的变性温度或反应温度，例如，通常不超过60℃。

[0038] 通过上述方法，根据本发明的方法获得的中药提取物澄清液与用酶处理之前的中药浓缩提取液的黏度(如特性黏度)相比可以减少至少约5％、优选至少10％、优选至少15％、优选至少20％、优选至少30％、优选至少40％、优选至少50％、优选至少60％、优选至少70％、优选至少80％、更优选至少85％和最优选至少90％；例如，可以减少5-95％，10-
90％，20-90％，30-90％，10-80％，20-80％，30-80％，10-70％，20-70％，30-70％，10-60％，
20-60％，30-60％，更优选20-95％和最优选30-95％。

[0039] 如果所采用的中药无法预先确定其粘性的可能来源，并且在采用一种酶或酶的组合处理后，中药浓缩提取液的黏度降低的程度小于约5％，则可以采取上面所述的酶中的其他种类或组合来重复上述本发明的方法步骤，直至黏度减少至少5％以上。这样的重复步骤也包括在本发明的范围内，即在本发明的方法的另一个实施方案中，该方法还包括：检测步骤3)中获得的中药提取物澄清液的黏度，若该黏度与步骤1)中获得的中药浓缩提取物的黏度相比减小约5％以下(即为后者的约95％以上)，则采用不同于上一次所使用的酶或酶的组合重复步骤1)-3)。根据需要，该重复步骤可以进行2-4次。

[0040] 在本发明的方法的一个实施方案中，该方法还包括：

[0041] 4)将步骤3)获得的中药提取物澄清液经大孔吸附树脂吸附，并收集洗脱液。

[0042] 在本发明的方法的一个优选实施方案中，其中步骤4)中的大孔吸附树脂选自非极性至弱极性大孔树脂中的任一种。此类树脂可以使用市售的树脂，包括AB-8，D101型，ADS-9型，HP-20型等，上述树脂的孔径一般为100-1000nm。本发明的树脂吸附步骤可以采用本领域技术人员公知的方法和步骤，一般在环境温度下进行，例如在常温(约25℃)下进行，吸附速度一般为1～2柱床体积/小时，并用合适的溶剂，例如水或者10％～70％的乙醇梯度洗脱。

[0043] 根据本发明的方法获得的洗脱液可以根据需要进一步进行萃取和纯化。

[0044] 下面将通过具体的实施例来描述本发明，为简便起见，实施例中与上面的描述重复之处不再赘述。另外，要说明的是，下面的实施例仅代表本发明的某些优选实施方式，尽管有些实施方式没有取得特别显著的有益效果，但这并不意味着限制本发明的范围或其实施。相反，根据本发明的教导，本领域技术人员可以根据本发明的原理，根据所使用的中药材的种类、中药提取物的黏度、反应温度、反应器等因素来选择合适的生物酶进行中药提取物的澄清处理。

[0045] 实施例

[0046] 实施例1

[0047] 取栀子制成水提液并浓缩至相对密度1.036(25℃)，分别加入水提液的0.5-1重量％的纤维素酶(北京逸轩生物技术有限公司提供，效价4000IU/g)、果胶酶(上海楷洋生物技术有限公司提供，效价＞500U/mg)、木聚糖酶(北京逸轩生物技术有限公司提供，效价100万/g)、中性蛋白酶(北京索来宝生物技术有限公司提供，效价100万/g)、木瓜蛋白酶(北京逸轩生物技术有限公司提供，效价100万/g)、β-葡聚糖酶(北京逸轩生物技术有限公司提供，效价1∶3000)、复合酶(果胶酶∶纤维素酶＝1∶1)，在PH值＝3-5，温度50℃的条件下酶解2-3小时。使用乌式黏度计测定酶解后水提液的特性黏度，结果显示在表1中。

[0048] 表1栀子水提取液中加入不同的酶后的结果

[0049]

[0050] 从表1中，可见利用酶法处理后，能显著降低中药提取液的黏度，其中纤维素酶、果胶酶以及复合酶的作用最佳。

[0051] 实施例2

[0052] 分别取天门冬、杜仲、款冬花、枸杞、黄精5种药材，制成水提液并浓缩至相对密度1.026(25℃)以上，分别向各种水提液中以水提液的1重量％加入复合酶(果胶酶∶纤维素酶＝1∶1)，在PH＝3～5，温度50℃的条件下酶解2～3小时。使用乌式黏度计测定酶解后水提液澄清液的黏度。

[0053] 表2不同药材的水提取液加酶处理前后黏度变化

[0054]

[0055] 可见利用酶法处理后，复合酶能显著降低多种中药提取液的黏度。

[0056] 参考文献