作为丙型肝炎病毒抑制剂的双苯并咪唑衍生物

摘要

式(I)的HCV复制抑制剂，包括其立体化学异构体形式和盐、水合物、溶剂合物，其中R和R’具有说明书限定的含义。本发明还涉及制备所述化合物的方法、含有它们的药用组合物，及其单独或与其它HCV抑制剂组合在HCV疗法中的用途。

权利要求

1.一种式I化合物

I包括其任何可能的立体异构体，其中：

R和R’独立选自-CR1R2R3、被1或2个选自卤素和甲基的取代基任选取代的芳基，其中R1选自被甲氧基或二甲氨基任选取代的C1-4烷基；被1、2或3个独立选自卤素、C1-4烷氧基、三氟甲氧基的取代基任选取代的苯基或被2个在相邻环原子上的取代基任选取代形成1,3-二氧杂环戊烷基团的苯基；被卤素或甲氧基任选取代的苄基；杂芳基；和杂芳基甲基；

R2选自氢、羟基、氨基、单-或二-C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基氨基、C1-4烷基氧基羰基氨基、C1-4烷基氨基羰基氨基、哌啶-1-基和咪唑-1-基；和R3是氢，或

CR2R3一起形成羰基；或

CR1R3形成环丙基；；

或其药学上可接受的盐；

其中“芳基”指任选包含1或2个选自N、O和S的杂原子的具有5或6个环原子的芳环结构；

“杂芳基”指如对术语“芳基”限定的芳环结构，其包含至少1个选自N、O和S的杂原子，前提是:

(a)当R和R’相同且代表-CR1R2R3，其中(a-1) R2是C1-4烷基氧基羰基氨基和R3是氢时，则R1不同于未被取代的C1-4烷基或者被甲氧基取代的乙基；或者其中(a-2) R2是甲基氧基羰基氨基和R3是氢时，则R1不同于未被取代的苯基；和(b)当R和R’不同且各自独立代表-CR1R2R3，其中在一个-CR1R2R3基团中R1是苯基或

2-丙基、R2是二甲基氨基和R3是氢时，则另一个-CR1R2R3基团不能采用R1是2-丙基和R2是甲基氧基羰基氨基和R3是氢的含义。

2. 权利要求1的化合物，其中：

R和R’独立选自-CR1R2R3。

3. 权利要求1或2的化合物，其中R2是羟基、氨基、单-或二-C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基氨基或C1-4烷基氧基羰基氨基。

4. 权利要求1或2的化合物，其中R2是C1-4烷基羰基氨基或C1-4烷基氧基羰基氨基。

5. 权利要求1或2的化合物，其中R1选自C1-4烷基、被1或2个独立选自卤素、甲氧基的取代基任选取代的苯基或被2个在相邻环原子上的取代基任选取代形成1,3-二氧杂环戊烷基团的苯基；和杂芳基。

6. 权利要求1或2的化合物，其中：R1选自支链C3-4烷基、任选地被1个选自卤素的取代基取代的苯基；和杂芳基。

7. 权利要求1或2的化合物，其中：R1选自支链C3-4烷基、任选地被1个选自卤素的取代基取代的苯基。

8. 权利要求1或2的化合物，其中化合物是式Ia化合物Ia。

9. 一种下式化合物：

。

10. 一种下式化合物：

。

11. 一种药用组合物，其包含权利要求1-10中任一项的化合物和药学上可接受的载体。

12. 权利要求1-10中任一项的化合物或权利要求11的药用组合物在制备用于预防或治疗哺乳动物的HCV感染的药物中的用途。

说明书

作为丙型肝炎病毒抑制剂的双苯并咪唑衍生物

技术领域

[0001] 本发明涉及为丙型肝炎病毒(HCV)的抑制剂的双苯并咪唑衍生物，其合成及其单独或与其它HCV抑制剂组合在HCV治疗或预防中的用途。

背景技术

[0002] HCV是属于丙型肝炎病毒属病毒中黄病毒科的单链、正义RNA病毒。病毒基因组翻译为编码多个结构和非结构蛋白的单个开放读码框。

[0003] 在初始急性感染后，大多数受感染个体形成慢性肝炎，因为HCV优先在肝细胞中复制而不是直接致细胞病变。特别是，强烈的T-淋巴细胞反应的缺乏和病毒突变的高度倾向似乎促成高的慢性感染率。慢性肝炎可进展为肝纤维化，导致肝硬化、末期肝病和HCC(肝细胞癌)，使其成为肝移植的主要原因。

[0004] 有6种主要的HCV基因型和超过50种亚型，它们在地理学上不同地分布。在欧洲和美国HCV基因型1是优势基因型。HCV广泛的遗传异质性具有重要的诊断和临床意义，可能解释疫苗研制的困难和对目前疗法的反应的缺乏。

[0005] HCV的传播可通过接触被污染的血液或血制品，例如在输血或静脉内使用药物后发生。引入用于血液筛查的诊断试验已导致输注后HCV发病率呈下降趋势。但是，由于缓慢进展为末期肝病，所以现有感染在几十年内将持续呈现严重的医疗和经济负担。

[0006] 目前的HCV疗法基于(聚乙二醇化，pegylated)干扰素-α(IFN-α)与利巴韦林组合。这种组合疗法在40％感染基因型1HCV的患者和约80％感染基因型2和3的患者中产生持续的病毒学反应。除了对HCV基因型1的功效有限以外，这种组合疗法具有明显副作用，包括流感样症状、血液学异常情况和神经精神症状。因此需要更有效、更方便和更好耐受的治疗。

[0007] 使用HIV药物、特别是HIV蛋白酶抑制剂的经验，已教导次优药动学和复合给药方案迅速引起疏忽的依从性失败。这转而意味着对一天的大部分时间在HIV方案中各药物的24小时谷浓度(最小血浆浓度)经常跌至IC90或ED90阈值以下。考虑至少是IC50、更实际地是IC90或ED90的24小时谷水平是减慢药物退出突变体的发展所必需的。实现允许此类谷水平必需的药动学和药物代谢速率对药物设计提供了迫切挑战。

[0008] HCV的NS5A蛋白位于NS4B蛋白的下游和NS5B蛋白的上游。在由病毒丝氨酸蛋白酶NS3/4A进行翻译后裂解后，NS5A成熟为含锌的三结构域磷蛋白，其作为低度磷酸化(56-kDa，p56)或高度磷酸化物种(58-kDa，p58)存在。HCV的NS5A参与病毒生命周期的多个方面，包括病毒复制和传染性粒子组装以及调节其宿主细胞的环境。虽然尚未把酶功能归于该蛋白，但据报道其与多种病毒和细胞因子相互作用。

[0009] 许多专利和专利申请公开具有HCV抑制活性、特别是靶向NS5A的化合物。WO2006/133326公开均二苯乙烯衍生物，而WO2008/021927和WO2008/021928公开具有NS5A HCV抑制活性的联苯衍生物。WO2008/048589公开4-(苯基乙炔基)-1H-吡唑衍生物及其抗病毒用途。WO2008/070447公开包括苯并咪唑部分的广泛HCV抑制化合物。WO2010/017401和WO2010/065681都公开HCV NS5A的双咪唑抑制剂。

[0010] 需要可克服目前HCV疗法的缺点比如副作用、功效有限、出现耐药和依从性失败以及改善持续的病毒负载反应的HCV抑制剂。

[0011] 本发明涉及一组HCV抑制双苯并咪唑衍生物，其具有关于下列一种或多种参数的有用特性：抗病毒功效、耐药性发展的有利分布、毒性和遗传毒性减小或缺乏、有利的药动学和药效学、容易配制和给药，和与其它药品特别是其它抗HCV剂的药物-药物相互作用有限或缺乏。

[0012] 因为它们缺乏抗其它病毒、特别是抗HIV的活性这一事实，本发明的化合物还可具有吸引力。HIV感染患者经常同时感染比如HCV。用还抑制HIV的HCV抑制剂治疗此类患者可导致出现HIV耐药株。

[0013] 发明描述

[0014] 一方面，本发明提供可用式I代表的化合物：

[0015]

[0016] 包括其任何可能的立体异构体，其中：

[0017] R和R’独立选自-CR1R2R3、被1或2个选自卤素和甲基的取代基任选取代的芳基，和杂C4-7环烷基，其中

[0018] R1选自被甲氧基、羟基或二甲氨基任选取代的C1-4烷基；C3-6环烷基；四氢吡喃基；被1、2或3个独立选自卤素、C1-4烷氧基、三氟甲氧基的取代基任选取代的苯基或被2个在相邻环原子上的取代基任选取代形成1，3-二氧杂环戊烷基团的苯基；被卤素或甲氧基任选取代的苄基；杂芳基；和杂芳基甲基；

[0019] R2选自氢、羟基、氨基、单-和二-C1-4烷基氨基、(C3-6环烷基)(C1-4烷基)氨基、C1-4烷基羰基氨基、苯基氨基、C1-4烷基氧基羰基氨基、(C1-4烷基氧基羰基)(C1-4烷基)氨基、C1-4烷基氨基羰基氨基、四氢-2-氧代-1(2H)-嘧啶基、吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、3，3-二氟哌啶-1-基、吗啉-1-基、7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基和咪唑-1-基；和

[0020] R3是氢或C1-4烷基，或

[0021] CR2R3一起形成羰基；或

[0022] CR1R3形成环丙基；

[0023] 及其药学上可接受的盐和溶剂合物。

[0024] 又一方面，本发明涉及式I化合物或其亚群(如本文指定)用于抑制HCV的用途。或者，提供所述化合物用于制造抑制HCV的药物的用途。

[0025] 本发明的实施方案涉及式(I)化合物，或其如本文限定的任何亚群，其中采用如本文指定对R、R’、R1、R2和R3定义的一种或多种。

[0026] 式I化合物的亚群是如本文限定的那些式I化合物或式I化合物亚群，其中R和R’独立是-CR1R2R3或芳基，其中芳基是5-元杂芳基；特别是，其中R和R’独立是-CR1R2R3；更特别是，其中R和R’是-CR1R2R3且相同。

[0027] 式I化合物的亚群是如本文限定的那些式I化合物或式I化合物亚群，其中R2是羟基、氨基、单-或二-C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基氨基、C1-4烷基氧基羰基氨基；特别是，R2是C1-4烷基羰基氨基或C1-4烷基氧基羰基氨基。

[0028] 式I化合物的亚群是如本文限定的那些式I化合物或式I化合物亚群，其中R1选自C1-4烷基；被1或2个独立选自卤素、甲基、甲氧基的取代基任选取代的苯基或被2个在相邻环原子上的取代基任选取代形成1，3-二氧杂环戊烷基团的苯基；和杂芳基。特别是，R1选自分枝的C3-4烷基；被1个选自卤素和甲基的取代基任选取代的苯基；和杂芳基。更特别是，R1选自分枝的C3-4烷基；被1个选自卤素的取代基任选取代的苯基。

[0029] 在第一个实施方案中，

[0030] R和R’独立选自-CR1R2R3、被1或2个选自卤素和甲基的取代基任选取代的芳基，和杂C4-7环烷基，其中

[0031] R1选自被甲氧基或二甲氨基任选取代的C1-4烷基；被1、2或3个独立选自卤素、C1-4烷氧基、三氟甲氧基的取代基任选取代的苯基或被2个在相邻环原子上的取代基任选取代形成1，3-二氧杂环戊烷基团的苯基；被卤素或甲氧基任选取代的苄基；杂芳基；和杂芳基甲基；

[0032] R2选自氢、羟基、氨基、单-和二-C1-4烷基氨基、C1-4烷基羰基氨基、C1-4烷基氧基羰基氨基、C1-4烷基氨基羰基氨基、哌啶-1-基和咪唑-1-基；和

[0033] R3是氢，或者R1和R3一起形成氧代基或环丙基；或其药学上可接受的盐和/或溶剂合物。

[0034] 在第二个实施方案中，R和R’独立选自-CR1R2R3、被1或2个选自卤素和甲基的取代基任选取代的芳基，和杂C4-7环烷基，其中

[0035] R1选自被甲氧基、羟基或二甲氨基任选取代的C1-4烷基；C3-6环烷基；被1、2或3个独立选自卤素、C1-4烷氧基、三氟甲氧基的取代基任选取代的苯基或被2个在相邻环原子上的取代基任选取代形成1，3-二氧杂环戊烷基团的苯基；被卤素或甲氧基任选取代的苄基；杂芳基；和杂芳基甲基；

[0036] R2选自氢、羟基、氨基、单-和二-C1-4烷基氨基、(C3-6环烷基)(C1-4烷基)氨基、C1-4烷基羰基氨基、苯基氨基、C1-4烷基氧基羰基氨基、(C1-4烷基氧基羰基)(C1-4烷基)氨基、C1-4烷基氨基羰基氨基、四氢-2-氧代-1(2H)-嘧啶基、吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、3，3-二氟哌啶-1-基、吗啉-1-基、7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基和咪唑-1-基；和

[0037] R3是氢或C1-4烷基，或

[0038] CR2R3一起形成羰基；或

[0039] CR1R3形成环丙基；

[0040] 及其药学上可接受的盐和溶剂合物；

[0041] 前提是(a)当R和R’相同且代表-CR1R2R3，其中

[0042] (a-1)R2是C1-4烷基氧基羰基氨基和R3是氢时，则R1不同于未被取代的C1-4烷基或者被羟基或甲氧基取代的乙基；或者其中

[0043] (a-2)R2是甲基氧基羰基氨基和R3是氢时，则R1不同于未被取代的苯基；和[0044] (b)当R和R’不同且各自独立代表-CR1R2R3，其中在一个-CR1R2R3基团中R1是苯基或2-丙基、R2是二甲基胺和R3是氢时，则另一个-CR1R2R3基团不能采用R1是2-丙基和R2是甲基氧基羰基氨基和R3是氢的含义。

[0045] 在第三个实施方案中，R和R’独立选自-CR1R2R3，其中R1选自被1、2或3个独立选自卤素、C1-4烷氧基、三氟甲氧基的取代基任选取代的苯基或被2个在相邻环原子上的取代基任选取代形成1，3-二氧杂环戊烷基团的苯基；

[0046] R2选自羟基、单-或二-C2-4烷基氨基、(C3-6环烷基)(C1-4烷基)氨基、C1-4烷基羰基氨基、(C1-4烷基氧基羰基)(C1-4烷基)氨基、C1-4烷基氨基羰基氨基、四氢-2-氧代-1(2H)-嘧啶基、吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、3，3-二氟哌啶-1-基、吗啉-1-基、7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基和咪唑-1-基；和

[0047] R3是氢或C1-4烷基，或

[0048] CR2R3一起形成羰基；或

[0049] CR1R3形成环丙基；

[0050] 及其药学上可接受的盐和溶剂合物。

[0051] 在第四个实施方案中，R1选自杂芳基；和杂芳基甲基；

[0052] R2选自氢、单-或二-C1-4烷基氨基、(C3-6环烷基)(C1-4烷基)氨基、C1-4烷基羰基氨基、C1-4烷基氧基羰基氨基、(C1-4烷基氧基羰基)(C1-4烷基)氨基、C1-4烷基氨基羰基氨基、四氢-2-氧代-1(2H)-嘧啶基、吡咯烷-1-基、哌啶-1-基、3，3-二氟哌啶-1-基、吗啉-1-基、7-氮杂双环[2.2.1]庚-7-基和咪唑-1-基；和

[0053] R3是氢；

[0054] 及其药学上可接受的盐和溶剂合物。

[0055] 在第五个实施方案中，

[0056] R1是C1-4烷基；

[0057] R2选自C1-4烷基氨基羰基氨基，或四氢-2-氧代-1(2H)-嘧啶基；和

[0058] R3是氢或C1-4烷基；

[0059] 及其药学上可接受的盐和溶剂合物。

[0060] 在第六个实施方案中，

[0061] R1是C3-6环烷基；

[0062] R2是氢

[0063] 和R3是氢；

[0064] 及其药学上可接受的盐和溶剂合物。

[0065] 又一方面，本发明提供式I化合物或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂合物，用于治疗或预防(或制造用于治疗或预防的药物)HCV感染。在本发明治疗或预防的上下文中代表性的HCV基因型包括但不限于基因型1b(在欧洲流行)和1a(在北美流行)。本发明还提供用于治疗或预防HCV、特别是基因型1a或1b感染的方法，包含给予需要其的受试者治疗有效量的如前文限定的化合物。

[0066] 将如本文提及的化合物和中间体的纯立体异构形式限定为基本不含所述化合物或中间体的相同基础分子结构的其它对映体或非对映体形式的异构体。特别是，术语“立体异构体纯”涉及具有至少80％立体异构体过量(即最小90％一种异构体且最多10％其它可能的异构体)直至100％立体异构体过量(即100％一种异构体且无其它异构体)的化合物或中间体，更特别是具有90％直至100％立体异构体过量、甚至更特别是具有94％直至100％立体异构体过量且最特别是具有97％直至100％立体异构体过量的化合物或中间体。术语“对映体纯”和“非对映体纯”应以类似的方式理解，但关注的分别是所述混合物的对映体过量和非对映体过量。

[0067] 本发明化合物和中间体的纯立体异构体形式或立体异构体可通过应用本领域已知的程序获得。例如，可将对映体通过它们与旋光性酸或碱的非对映体盐的选择性结晶而相互分离。旋光性酸或碱的实例是酒石酸、二苯甲酰基酒石酸、二甲苯酰基酒石酸和樟脑磺酸。或者，可将对映体通过层析技术用手性静止相分离。所述纯的立体化学异构体形式还可用适当原料对应的纯立体异构体形式衍生，前提是发生立体特异性反应。如果希望特定的立体异构体，优选所述化合物是通过立体特异性制备方法合成。这些方法将有利地采用对映体纯的原料。

[0068] 式I化合物的非对映体外消旋物可通过常规方法单独获得。可有利地采用适当的物理分离方法例如选择性结晶和层析，如柱层析或超临界流体层析。

[0069] 式I化合物具有几个手性中心。感兴趣的是在吡咯烷环2-碳原子上的立体中心(Stereogenic Center)。该位置的构型可对应于L-脯氨酸，即

[0070]

[0071] 或者对应于D-脯氨酸，即

[0072]

[0073] 特别感兴趣的是式Ia的如本文限定的式I化合物或其亚群。

[0074]

[0075] 还感兴趣的是基团-CR1R2R3的构型：当R1选自被甲氧基、羟基或二甲氨基任选取代的C1-4烷基；C3-6环烷基；和四氢吡喃基时，则优选S-构型；当R1选自被1、2或3个独立选自卤素、C1-4烷氧基、三氟甲氧基的取代基任选取代的苯基或被2个在相邻环原子上的取代基任选取代形成1，3-二氧杂环戊烷基团的苯基；和杂芳基时，则优选R-构型。

[0076] 药学上可接受的加成盐包含式(I)化合物或其亚群的治疗活性非毒性酸和碱加成盐形式。感兴趣的是式I化合物或本文指定式I化合物任何亚群的游离形式即非盐形式。

[0077] 药学上可接受的酸加成盐可方便地通过用此类适当的酸处理碱形式而获得。适当的酸包含例如，无机酸比如氢卤酸(如盐酸或氢溴酸)、硫酸、硝酸、磷酸等酸；或者有机酸比如乙酸、丙酸、羟乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸(即乙二酸)、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸(即羟基丁二酸)、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环拉酸、水杨酸、对氨基水杨酸、扑酸等酸。反过来可将所述盐形式通过用适当的碱处理转化为游离碱形式。

[0078] 还可将含有酸性质子的式(I)化合物通过用适当的有机和无机碱处理，转化为其碱加成盐，特别是金属或胺加成盐形式。适当的碱盐形式包含，例如铵盐、碱和碱土金属盐，如锂、钠、钾、镁、钙盐等，与有机碱的盐，如苄星、N-甲基-D-葡萄糖胺、海巴明盐，和与氨基酸例如精氨酸、赖氨酸等的盐。

[0079] 术语“溶剂合物”涵盖式I化合物及其盐能够形成的任何药学上可接受的溶剂合物。此类溶剂合物是例如水合物、醇化物，如乙醇化物、丙醇化物等。

[0080] 一些式I化合物还可存在互变异构体形式。例如，酰胺基(-C(＝O)-NH-)的互变异构体形式是亚氨基醇(-C(OH)＝N-)。虽然在本文表示的结构式中没有明确指示互变异构体形式，但打算将其包括在本发明范围内。

[0081] 如用于本文，“C1-4烷基”作为基团或基团一部分，限定为具有1-4个碳原子的饱和直链或支链烃基，例如甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-丁基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基。用于本发明的目的，其中感兴趣的C1-4烷基是C3-4烷基，即具有3或4个碳原子的直链或支链烃基，比如1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-丁基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基。特别感兴趣的可能是分枝的C3-4烷基比如2-丙基、2-丁基、2-甲基-1-丙基、
2-甲基-2-丙基。

[0082] 术语“C3-6环烷基”作为基团或其一部分，限定为具有一起形成环状结构的3-6个碳原子的饱和环状烃基。C3-6环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。

[0083] “C1-4烷氧基”作为基团或基团一部分，指式-O-C1-4烷基的基团，其中C1-4烷基如上文限定。C1-4烷氧基的实例是甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基。

[0084] 术语“卤素”泛指氟、氯、溴和碘。

[0085] 如用于本文，术语“(＝O)”或“氧代基”与碳原子连接时形成羰基部分。应注意只有当原子的化合价允许这样时，原子才可被氧代基取代。

[0086] 如用于本文限定“芳基”作为基团或其一部分的目的，指任选包含1或2个选自N、O和S、特别是选自N和O的杂原子的芳环结构。所述芳环结构可具有5或6个环原子。

[0087] 如用于本文，在基团定义中的前缀“杂-”指该基团包含至少1个选自N、O和S、特别是N和O的杂原子。例如，术语“杂芳基”指如对术语“芳基”限定的芳环结构，其包含至少1个选自N、O和S、特别是N和O的杂原子，例如呋喃基、噁唑基、吡啶基。或者，术语“杂C4-7环烷基”指包含至少1个选自N、O和S、特别是N和O的杂原子的饱和环状烃基，例如四氢呋喃基、四氢吡喃基、哌啶基。

[0088] 当不指定基团在分子部分上的位置(例如在苯基上的取代基)或者用浮动键表示时，此类基团可位于此类部分的任何原子上，只要所得结构在化学上稳定。当任何变量多于一次出现在分子中时，每次定义是独立的。

[0089] 在本文无论何时使用，术语“式I化合物”或“本化合物”或类似术语，意味着包括式I化合物，包括其可能的立体异构体形式和药学上可接受的盐和溶剂合物。

[0090] 通用合成方法

[0091] 流程1

[0092]

[0093] 其中R和R’相同的式I化合物，可用上文流程1说明的合成途径获得。将N-(叔丁氧基羰基)-L-脯氨醛(prolinal)用4-溴苯-1，2-二胺氧化成环，得到苯并咪唑衍生物II，将其在Pd催化条件在双(频那醇合)二硼的存在下转化为亚硼酸(boronic)酯III。接着，通过与1，4-二碘苯偶联，使用Suzuki-Miyaura条件，将亚硼酸酯III转化为化合物IV。或者，可用1，4-二溴苯代替1，4-二碘苯。合适的Pd催化剂是((双-二苯基膦)二茂铁基)二氯化钯(II)(Pd(dppf)Cl2)。在酸性条件下，例如用异丙醇中的HCl脱除吡咯烷氮的叔丁氧基羰基(Boc)保护基而获得化合物V。然后可将所得化合物V通过用式R-C(＝O)-OH的适当的酸酰化而转化为式I化合物，其中R具有如对式I化合物或其任何亚群限定的R和R’的含义。

[0094] 所述酰化可通过在偶联剂的存在下使原料反应或者通过将羧基官能团转化为活性形式比如活性酯、混合酐或羧酸氯化物或溴化物进行。此类偶联反应和其中所用试剂的一般说明可见于关于肽化学的普通教科书，例如M.Bodanszky，“Peptide Chemistry(肽化学)”，再版第2版，Springer-Verlag，Berlin，Germany，(1993)。

[0095] 用于氨基酰化或酰胺键形成的偶联反应实例包括叠氮化物法、混合碳酸-羧酸酐(氯甲酸异丁酯)法、碳二亚胺(二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺或水溶性碳二亚胺比如N-乙基-N′-[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺)法、活性酯法(如对硝基苯基、对氯苯基、三氯苯基、五氯苯基、五氟苯基、N-羟基琥珀酰亚氨基等酯)、Woodward试剂K-法、1，1-羰二咪唑(CDI或N，N’-羰基-二咪唑)法、磷试剂或氧化-还原法。这些方法中有些可通过加入合适的催化剂增强，例如在碳二亚胺法中可通过加入1-羟基苯并三唑或4-DMAP。
其它偶联剂是(苯并三唑-1-基氧基)-三-(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐，其本身或在1-羟基-苯并三唑或4-DMAP的存在下；或者2-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)，或O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)。这些偶联反应可在溶液(液相)或固相进行。用于本发明的目的，优选酰化方法采用HATU进行。

[0096] 偶联反应优选在惰性溶剂中进行，比如卤代烃如二氯甲烷、氯仿，偶极非质子溶剂比如乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、DMSO、HMPT，或者醚比如四氢呋喃(THF)。

[0097] 在许多情况下偶联反应是在合适的碱，比如叔胺如三乙胺、二异丙基乙胺(DIPEA)、N-甲基-吗啉、N-甲基吡咯烷、4-DMAP或1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯(DBU)的存在下进行。反应温度可为0℃-50℃，反应时间可为15分钟-24小时。

[0098] 流程2

[0099]

[0100] 或者，其中R和R’不同的式I化合物，即式XIII化合物，可用流程2说明的合成途径获得。在与将III转化为IV(流程1)可相比的条件下，除了1，4-二碘苯与亚硼酸酯III的比值为约1∶1、可能更高以外，使用标准Suzuki-Miyaura条件，可使亚硼酸酯III和1，4-二碘苯偶联，以获得一碘化物VII。或者，可用1，4-二溴苯代替1，4-二碘苯。然后可使VII与亚硼酸酯VIII偶联。应理解应当这样选择亚硼酸酯VIII中吡咯烷氮上的氨基保护基团PG，以便在不影响分子中另一个氮上Boc-基团或R-C(＝O)-基团的条件下可将其脱除。还应理解PG也可以是合成的最终式I化合物的R’-C(＝O)-基团。可用标准Suzuki-Miyaura条件再次进行VII与VIII的偶联，得到化合物IX。然后可将化合物IX用适合脱除Boc保护基团的条件选择性脱保护为化合物X。例如，在PG是苄氧基羰基或苄基的情况下，可将Boc保护基团在标准Boc-脱保护条件即酸处理下选择性脱除。

[0101] 而且，在PG是苄氧基羰基或苄基的情况下，可将PG在还原性处理下选择性脱除，留下完整R-C(＝O)-基团在化合物XI中。其它合适的保护基团PG和伴随的选择性脱保护条件可来自Greene’s“Protective groups in organic synthesis(有机合成中的保护基团)”，Peter G.M.Wuts著，第4版，第7章：‘Protection for the amino group(对氨基的保护)’。接着可将化合物X用式R-C(＝O)-OH的适当的酸酰化，其中R具有如关于式I化合物或其任何亚群限定的R的含义。获得化合物XI。

[0102] 对于化合物XI，在PG代表-(C＝O)-R’的情况下，化合物XI等于化合物XIII。在PG代表氨基保护基团的情况下，可将PG在与-(C＝O)-R相容的条件下脱除，例如当PG是苄基或苄氧基羰基时氢化，或者在PG是芴基甲氧基羰基的情况下在碱性条件如二乙胺下脱除，得到化合物XII。其它选择性脱保护可来自Greene’s参考书。

[0103] 在-(C＝O)-R与PG脱保护条件不相容的情况下，可使用在流程5描述的途径，其中选择保护基团PG使其与Boc基团相容。

[0104] 可将化合物XII转换为化合物XIII，通过类似于XIV转化为XV、V转化为I和X转化为XI的酰化，如流程1中将V转化为I的详细描述。

[0105] 流程3

[0106]

[0107] 流程4

[0108]

[0109] 亚硼酸酯VIII可通过至少2种如流程3和4说明的不同途径获得。在PG代表保护基团如苄氧基羰基、芴基甲氧基羰基、苄基或者如描述于Greene’s参考书的另一种合适保护基团PG的情况下，化合物可通过用于合成中间体化合物II和IIa(见实施例2)和亚硼酸酯III的方法合成，从相应被保护的吡咯烷衍生物开始。在PG代表-(C＝O)-R’的情况下，化合物可用中间体II制备，如流程4显示，通过在酸性条件下比如在例如iPrOH或三氟乙酸中用HCl处理而将脯氨酸氮脱保护，得到化合物XIV，接着在标准酰化条件如在碱如DIPEA的存在下使用HATU偶联。然后，可将获得的溴化物XV转换为亚硼酸VIII(其中PG代表-(C＝O)-R’)，如同例如从II至III的转换。

[0110] 流程5

[0111]

[0112] 或者，如流程5显示，可将化合物IX在与Boc保护基团相容的条件下脱保护，例如当PG是苄基或苄氧基羰基时氢化，或者在PG是芴基甲氧基羰基的情况下在碱性条件如二乙胺下脱保护，得到化合物XVI。其它选择性脱保护可来自Greene’s参考书。在这种情况下，化合物XVI等于化合物X，PG是Boc。在这种情况下，从XI脱保护为XII可在类似于将II转化为XIV和将IV转化为V的条件下实现。

[0113] 上文流程1-5中描述的合成程序还可用外消旋脯氨酸衍生物或D-脯氨酸衍生物代替L-脯氨酸进行。因此，可获得具有备选立体化学的式I化合物。

[0114] 又一方面，本发明涉及包含治疗有效量的如本文指定的式I化合物和药学上可接受的载体的药用组合物。在上下文中治疗有效量是在被感染受试者中足以稳定或减小HCV感染的量，或者在面临感染危险的受试者中足以预防HCV感染的量。又一方面，本发明涉及制备如本文指定的药用组合物的方法，其包含将药学上可接受的载体与治疗有效量的如本文指定的式I化合物紧密混合。

[0115] 因此，可将本发明化合物或其任何亚群配制成各种药用形式用于给药目的。作为适当的组合物，可引用通常用于全身给药的药物的所有组合物。为了制备本发明的药用组合物，将有效量的特定化合物，任选采用加成盐形式或金属复合物，作为活性成分与药学上可接受的载体合并在紧密的混合物中，其载体根据要求的给药制剂形式可采用多种形式。理想的是这些药用组合物采用适合(特别是)口服、直肠、经皮或通过胃肠外注射给药的单位剂型。例如，在制备口服剂型的组合物时，可采用任何常用的药用介质，例如在口服液体制剂比如混悬液、糖浆剂、酏剂、乳液或溶液的情况下为水、二醇、油、醇等；或者在粉剂、丸剂、胶囊和片剂的情况下为固体载体比如淀粉、糖、高岭土、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。因为易于给药，所以片剂和胶囊代表最有利的口服剂量单位形式，在这种情况下显然采用固体药用载体。对于胃肠外组合物，载体将通常包含无菌水，至少为大部分，但可包括其它成分例如用于帮助溶解性。例如，可制备可注射的溶液，其中载体包含盐水溶液、葡萄糖溶液或盐水和葡萄糖溶液的混合物。还可制备可注射的混悬液，在这种情况下可采用适当的液体载体、悬浮剂等。还包括打算在使用前不久转化为液体形式制剂的固体形式制剂。在适合经皮给药的组合物中，载体任选包含渗透增强剂和/或合适的湿润剂，任选以较小比例与任何性质的合适添加剂组合，所述添加剂对皮肤不引起明显的有害作用。本发明的化合物还可采用溶液、混悬液或干粉形式用任何本领域已知的递药系统经口吸入或吹入给药。

[0116] 为了便于给药和剂量的均匀性，尤其有利的是配制单位剂型的上述药用组合物。本文所用单位剂型指适合作为单一剂量的物理上分离的单位，各单位含有与所需药用载体联合、经计算可产生要求的治疗作用的预定量活性成分。此类单位剂型的实例是片剂(包括压痕片或包衣片)、胶囊、丸剂、栓剂、粉末包(powder packets)、糯米纸囊剂(wafer)、可注射的溶液或混悬液等，及其分开的多倍物(multiple)。

[0117] 式I化合物显示抗HCV活性，可用于治疗和预防HCV感染或与HCV关联的疾病。后者包括进行性肝纤维化、导致肝硬化的炎症和坏死、末期肝病和肝细胞癌。而且许多本发明化合物已知可有效对抗HCV突变株。另外，本发明化合物在生物利用度方面可具有吸引人的特性，显示有利的药代动力学分布，包括可接受的半衰期、AUC(曲线下面积)、峰和谷值，没有不利现象比如不够迅速起效或组织保留。

[0118] 可在细胞HCV复制子系统中测试式I化合物抗HCV的体外抗病毒活性，基于Lohmann等(1999)Science 285：110-113，进一步的修改描述于Krieger等(2001)Journal ofVirology 75：4614-4624(通过引用结合到本文中)，将其进一步在实施例部分举例。这种模型，虽然并非HCV的完全感染模型，但被广泛公认是目前可用最稳健和有效的自发性HCV RNA复制模型。应理解，重要的是区分特异性干扰HCV功能的化合物与在HCV复制子模型中发挥细胞毒性作用或细胞抑制作用、结果引起HCV RNA或连锁报道酶浓度下降的化合物。在本领域已知用于评价细胞的细胞毒性的测定，基于例如线粒体酶的活性使用发荧光的氧化还原染料比如刃天青。而且，存在细胞反向筛选(counter screen)用于评价连锁报道基因活性的非选择性抑制，比如荧火虫荧光素酶。可通过用荧光素酶报道基因稳定转染装备适当的细胞类型，所述基因的表达取决于组成性活性的基因启动子，此类细胞可作为反向筛选用于排除非选择性抑制剂。

[0119] 由于其抗-HCV特性，式I化合物或其亚群，如本文指定，可用于抑制HCV复制，特别是治疗被HCV感染的温血动物、特别是人，和用于预防温血动物、特别是人的HCV感染。本发明还涉及治疗被HCV感染或正在面临HCV感染危险的温血动物、特别是人的方法。所述方法包含给予治疗或预防有效量的式I化合物，如前文限定。

[0120] 如本文指定的式I化合物因此可用作药物，特别是用作抗-HCV药物。所述作为药物或治疗方法的用途包含将有效于缓解或预防与HCV感染关联的症状和疾病的量全身给予HCV感染受试者或对HCV感染敏感的受试者。

[0121] 本发明还涉及本化合物在制造用于治疗或预防HCV感染的药物中的用途。

[0122] 一般预期有效的抗病毒每日量将为约0.01-约50mg/kg或约0.02-约30mg/kg体重。可适当地在一天内以适当间隔将需要的剂量作为2、3、4或更多亚剂量给药。可将所述亚剂量配制为单位剂型，例如每单位剂型含有约1-约1000mg或约1-约500mg或约1-约100mg或约2-约50mg活性成分。

[0123] 组合疗法

[0124] 本发明还涉及式I化合物、其药学上可接受的盐或溶剂合物与另一种抗病毒化合物、特别是另一种抗-HCV化合物的组合。术语“组合”指含有(a)式I化合物，如上文限定，和(b)另一种抗-HCV抑制剂的产品，作为组合制剂同时、单独或按顺序用于治疗HCV感染。

[0125] 本发明的组合可用作药物。因此，本发明涉及如上文限定的式(I)化合物或其任何亚群用于制造药物的用途，所述药物可用于在被HCV病毒感染的哺乳动物中抑制HCV活性，其中所述药物用于组合疗法，所述组合疗法特别包含式(I)化合物和至少一种其它抗-HCV剂，如IFN-α、聚乙二醇化IFN-α、利巴韦林、albuferon、taribavirin、硝噻醋柳胺(nitazoxanide)Debio025或其组合。

[0126] 可与本发明化合物组合的其它剂包括，例如HCV聚合酶的核苷和非核苷抑制剂、蛋白酶抑制剂、螺旋酶抑制剂、NS4B抑制剂和在功能上抑制内部核糖体进入位点(IRES)的剂，和抑制HCV细胞附着或病毒进入、HCV RNA翻译、HCV RNA转录、复制或HCV成熟、组装或病毒释放的其它剂。这些种类的具体化合物包括HCV蛋白酶抑制剂比如替拉瑞韦(telaprevir)(VX-950)、波普瑞韦(boceprevir)(SCH-503034)、narlaprevir(SCH-900518)、ITMN-191(R-7227)、TMC435350(TMC435)、MK-7009、BI-201335、BI-2061(西鲁瑞韦，ciluprevir)、BMS-650032、ACH-1625、ACH-1095、GS 9256、VX-985、IDX-375(HCVNS4A蛋白酶辅因子抑制剂)、VX-500、VX-813、PHX-1766、PHX2054、IDX-136、IDX-316、ABT-450、EP-013420(和同源物)和VBY-376；可用于本发明的核苷HCV聚合酶抑制剂包括R7128、PSI-7851、PSI 7977、IDX-189、IDX-184、IDX-102、R1479、UNX-08189、PSI-6130、PSI-938和PSI-879和各种其它核苷和核苷酸类似物和HCV抑制剂，包括衍生为2′-C-甲基修饰核苷、4′-氮杂修饰核苷和7′-脱氮杂修饰核苷的那些，如4-氨基-1-[5-叠氮基-4-羟基-5-羟基甲基-3-甲基四氢呋喃-2-基]嘧啶-2(1H)-酮(参考1)及其双-2-甲基丙酸酯(参考2)。可用于本发明的非核苷HCV聚合酶抑制剂包括HCV-796、HCV-371、VCH-759、VCH-916、VCH-222、ANA-598、MK-3281、ABT-333、ABT-072、PF-00868554、BI-207127、GS-9190、A-837093、JKT-109、GL-59728、GL-60667、ABT-072、AZD-2795和13-环己基-3-甲氧基-17，23-二甲基-7H-10，6-(桥亚甲基亚氨基硫代亚氨基桥亚乙基氧基桥亚乙基亚氨基桥亚甲基)吲哚并[2，1-a][2]苯并氮杂卓-14，24-二酮16，16-二氧化物(参考3)。

[0127] 下列实施例用于说明本发明，其不应解释为限制本发明的范围。实施例

[0128] 实施例1-化合物V的合成

[0129] 1.1中间体II的制备

[0130]

[0131] 在25℃向4-溴苯-1，2-二胺(170g，0.91mol)在乙醇(2L)中的溶液内加入(S)-2-甲酰基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(258g，1.3mol)，将混合物加热至60℃24小时，TLC显示反应完成。浓缩溶液，将粗产物用柱层析(石油醚∶乙酸乙酯10∶1至2∶1)纯化以得到215g II，为黄色固体。

[0132] 1H NMR：CDCl3400MHz

[0133] δ7.95-7.4(m，3H)，5.35-5.25(m，1H)，3.85-3.70(m，1H)，3.6-3.45(m，1H)，2.6-2.45(m，1H)，2.20-1.95(m，3H)，1.48-1.38(m，5H)，1.2-1.1(m，4H)[0134] 1.2中间体III的制备

[0135]

[0136] 在氮气下向II(200g，546mmol)、乙酸钾(160.8g，1.64mol)和4，4，4′，4′，5，5，5′，5′-八甲基-2，2′-联(1，3，2-二氧杂环戊硼烷)(416g，1.64mol)在DMF(3L)中的混合物内加入Pd(dppf)Cl2(20g)。将反应混合物在85℃搅拌15小时。将混合物用乙酸乙酯稀释，用水和盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤除去固体，减压除去滤液的溶剂。将残留物用硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯10∶1至2∶1)纯化以得到呈白色固体的125gIII(含有15％亚硼酸)。

[0137] 1.3中间体IV的制备

[0138]

[0139] 在氮气下向1，4-二碘苯(1.7g，5.15mmol)、III(6g，14.4mmol)和K2CO3(2.14g，15.5mmol)在二噁烷-H2O(50mL，5∶1)中的溶液内加入Pd(dppf)Cl2(300mg)。将混合物加热至85℃15小时。将混合物冷却至室温，浓缩，加入水，将混合物用乙酸乙酯提取，用硫酸镁干燥，过滤除去固体，减压除去滤液的溶剂。将粗产物用反相HPLC纯化以得到2g，96％(IV)。
1

[0140] H NMR ：d-甲醇400MHz

[0141] δ7.84-7.70(m，6H)，7.67-7.52(m，4H)，5.15-4.99(m，2H)，3.70-3.83(m，2H)，3.62-3.52(m，2H)，2.54-2.35(m，2H)，2.19-1.93(m，6H)，1.44-1.54(m，6H)，1.12-1.25(m，
12H)

[0142] 1.4中间体V的制备

[0143]

[0144] 向20mL管瓶内放入IV(500mg)、二氯甲烷(3mL)和HCl的异丙醇溶液(3mL 5-6M溶液，Acros)。将该混合物在室温下搅拌4小时，LCMS确认完全转化为V。与甲苯和甲醇减压共沸除去溶剂以得到褐色固体，将其就这样用于下一步。

[0145] 实施例2-苄基保护的中间体IIA的制备

[0146]

[0147] 在40℃搅拌10g L-脯氨酸和KOH(10g)在120mL异丙醇中的溶液，滴加苄基氯(13.5mL)。将反应混合物再搅拌6小时，然后用浓HCl中和至pH为5-6。用CH2Cl2(3×70mL)提取反应混合物，将合并的有机层用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤除去固体，减压除去滤液的溶剂。将残留物用丙酮处理以得到N-苄基脯氨酸(15g)。

[0148] 使N-苄基脯氨酸(10.2g，50mmol)和三乙胺(50mmol)溶于THF(250mL)中，冷却至0℃。用15分钟向该溶液内滴加氯甲酸乙酯(ClCOOEt，50mmol)，再搅拌30分钟。用15分钟向该溶液内加入4-溴苯-1，2-二胺(75mmol)。将反应混合物在0℃搅拌1小时，然后让其达到室温，搅拌16小时，然后回流3小时。在该反应完成后，将混合物冷却至室温，用乙酸乙酯(3×70mL)稀释。将有机层合并，干燥(硫酸镁)，过滤除去固体，减压蒸发滤液的溶剂。将残留物用柱层析(己烷/乙酸乙酯：7/3)纯化以得到11g中间体。

[0149] 在20℃使11g中间体溶于乙酸(50mL)中，搅拌15小时。减压除去溶剂，然后加入NaHCO3(饱和，水性，200mL)。将所得混合物用乙酸乙酯(3×80mL)提取。浓缩合并的有机层，将残留物用柱层析纯化以得到3g IIA。

[0150] 实施例3-式I化合物的合成

[0151] 3.1.化合物1号的制备

[0152]

[0153] 向V(400mg，0.77mmol)在DMF(10mL)中的溶液内加入DIPEA(0.5mL，3mmol)、HATU(0.73g，1.9mmol)和苯基乙酸(2.2eq，230mg，1.7mmol)。将混合物在室温下搅拌2小时，然后经固相提取(Waters PoraPak CX 60cc，在使用前用3体积甲醇洗涤)纯化。将粗反应混合物负载，用甲醇(4体积)漂洗，然后用7M氨水的甲醇溶液(来自Aldrich的溶液，4体积)洗脱。将洗脱液减压蒸发以得到褐色泡沫。为了获得精细固体，加入HCl(3mL，5-6M在异丙醇中，Acros)，接着与甲苯共沸除去溶剂以得到褐色固体。

[0154] 对于具有式C44H40N6O2的VI的LCMS(M+H)m/z＝685

[0155] 或者，反应物的纯化和处理可如下进行：加入CH2Cl2，用饱和NaHCO3洗涤，用Na2SO4干燥有机相，过滤和真空浓缩。然后将残留物用硅胶层析(0-10％MeOH在CH2Cl2中)或用制备型HPLC纯化。

[0156] 3.2化合物2-62的制备

[0157] 表1列出的化合物2-62采用对化合物1描述于实施例3.1的程序用适当的式R-C(＝O)-OH的羧酸合成。

[0158] 所有化合物都用LC/MS表征。使用下列LC/MS方法：

[0159] 方法A：配备PDA检测器(范围210-400nm)的Waters Acquity UPLC和具有双模式离子源ES+/-的Waters SQD。使用的柱是Halo C18，2.7μ，2.1×50mm，保持在50℃。1.5分钟内梯度从95％水性甲酸(0.1％)/5％乙腈倾斜至100％乙腈，保持0.6分钟，然后用0.5分钟恢复至100％水性甲酸(0.1％)。流速是0.6mL/min。

[0160] 方 法 B：液 相 层 析：Waters Alliance 2695，UV 检 测 器：Waters 996PDA，范围：210-400nm；质量检测器：Waters ZQ，离子源：ES+，ES-，使用的柱：SunFire C183.5μ4.6×100mm，流动相A：10mM NH4OOCH+0.1％HCOOH在H2O中；流动相B：CH3OH；柱温：50℃；流速：1.5mL/min；梯度时间(min)[％A/％B]0[65/35]至7[5/95]至9.6[5/95]至9.8[65/35]至12[65/35]。

[0161] 方法C：配备PDA检测器(范围210-400nm)的Waters Acquity UPLC和具有双模式离子源ES+/-的Waters SQD。使用的柱是XS Strategy 1.7μ，2.1×20mm，保持在50℃。1.5分钟内梯度从100％水性甲酸(0.1％)倾斜至100％乙腈，保持0.6分钟，然后用0.5分钟恢复至100％水性甲酸(0.1％)。流速是0.6mL/min。

[0162] 方法D：XTerra MS C182.5μ4.6×50mm；流动相A：10mM NH4OOCH+0.1％HCOOH在H2O中；流动相B：CH3OH；柱温：50℃；流速：1.5ml/min；梯度时间(min)[％A/％B]0[65/35]至3.8[5/95]至5.5[5/95]至5.6[65/35]至7[65/35]。

[0163] 一些化合物是用1H NMR表征

[0164] 化合物2：1H NMR(400MHz，DMSO-d6，描述主要异构体)：12.14-12.30(2H，m)，7.70-7.85(6H，m)，7.44-7.62(4H，m)，7.24(2H，d，J ＝ 8.0Hz)，5.15-5.28(2H，m)，
4.26-4.38(2H，m)，3.81-3.98(4H，m)，3.56(6H，s)，3.47-3.54(2H，m)，3.20(6H，s)，
2.15-2.32(4H，m)，2.15-2.32(4H，m)，1.09(6H，d，J＝6.0Hz).

[0165] 化合物30：1H NMR(400MHz，DMSO-d6，描述主要异构体)：12.13-12.77(2H，m)，7.73-7.80(6H，m)，7.47-7.60(4H，m)，7.32(2H，d，J ＝ 8.6Hz)，5.17-5.24(2H，m)，4.05-4.15(2H，m)，3.80-3.91(4H，m)，3.55(6H，s)，2.18-2.31(4H，m)，1.87-2.13(6H，m)，
0.80-0.92(12H，m).

[0166] 化合物40：1H NMR(400MHz，DMSO-d6，描述主要异构体)：12.13-12.25(2H，m)，7.42-7.87(12H，m)，5.12-5.26(2H，m)，3.97-4.07(2H，m)，3.69-3.89(4H，m)，3.55(6H，s)，
2.15-2.31(4H，m)，1.89-2.14(4H，m)，1.05-1.19(2H，m)0.31-0.50(8H，m).[0167] 表1-式I化合物

[0168]

[0169]

[0170]

[0171]

[0172]

[0173]

[0174]

[0175]

[0176]

[0177] 生物学实施例-式I化合物的抗-HCV活性

[0178] 复制子测定

[0179] 检验式(I)化合物在HCV复制子中的抑制活性。这种细胞测定基于如描述于Lohmann等(1999)Science第285卷，第110-113页的双顺反子表达构件，其修饰描述于Krieger等(2001)Journal of Virology 75：4614-4624，采用多靶筛选策略。

[0180] 基本上，该方法如下：

[0181] 该测定利用稳定转染的细胞系Huh-7luc/neo(下文称为Huh-Luc)。该细胞系隐藏着编码双顺反子表达构件的RNA，该构件包含从来自脑炎心肌炎病毒(EMCV)的内部核糖体进入位点(IRES)翻译的1b型HCV的野生型NS3-NS5B区，前面有报道部分(FfL-荧光素R酶)和可选择的标记部分(neo，新霉素磷酸转移酶)。该构件两侧是来自1b型HCV的5’R
和3’NTR(非翻译区)。在G418(neo)的存在下复制子细胞的继续培养取决于HCV RNA的复制。将表达HCV RNA的稳定转染的复制子细胞用于筛选抗病毒化合物，所述HCV RNA自发复制并达到高水平，编码荧光素酶等。

[0182] 在存在以各种浓度加入的测试和对照化合物的情况下将复制子细胞在384孔板中平板培养。培养3天后，通过测定荧光素酶活性(使用标准荧光素酶测定底物和试剂和TMPerkin Elmer ViewLux ultraHTS微量板成像仪)测量HCV复制。在缺乏任何抑制剂时在对照培养物中的复制子细胞具有高荧光素酶表达。在Huh-Luc细胞上监测化合物对荧光素酶活性的抑制活性，产生每种测试化合物的剂量-效应曲线。然后计算EC50值，其表示使被测荧光素酶活性水平下降50％或者更具体来讲使遗传上连锁的HCV复制子RNA复制能力下降所需要的化合物量。

[0183] 结果

[0184] 表2显示上文给定实施例化合物获得的复制子结果。

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[0201] 抑制剂组合研究

[0202] 在优选实施方案中，本文所述化合物与另一种改变HCV病毒复制的剂的组合可协同或拮抗作用。可通过多种机械和实验方法分析化合物的相互作用。

[0203] 一种分析此类组合的方法是通过三维图和由MacSynergyTM II产生的协同容量计算值，基于Bliss独立(Bliss Independency)模型(Dr.Mark Pritchard，University of Alabama，Tuscaloosa，AL)。这样，当以nM2％(协同容量)表示的值为25-50nM2％(较小但显著量协同)、50-100nM2％(中度协同)或超过100nM2％(强烈协同)时，本文所述化合物与另一种改变HCV病毒复制的剂组合称为起协同作用或具有协同效应。

[0204] 在某些实施方案中，化合物2与抑制丙型肝炎病毒复制的化合物组合。此类化合物的实例包括蛋白酶抑制剂(TMC435350)，或聚合酶抑制剂(基于核苷的抑制剂：参考1；非基于核苷的抑制剂：参考3)。将实验设定为“棋盘”基序，在含有稳定转染的1b型HCV复制子的Huh-Luc细胞上水平滴定一种药物而另一种则垂直滴定。每种双向组合都重复进行四份，用MacSynergyTM II软件分析以获得协同/拮抗容量百分数(以nM2％表示)。

[0205] 在MacSynergyTM II中，从每种个别化合物的剂量效应曲线导出累加相互作用的