显示出缩短的生物学活性的神经毒素

摘要

本发明涉及制药领域。具体地，预期编码神经毒素多肽的多核苷酸，所述多肽在受试者中显示出生物学效应减少的持续时间，其中所述多肽在轻链中包含至少一个降解信号，以及包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞，由此编码的多肽，和特异性地与所述多肽结合的抗体。此外，本发明涉及包含所述多核苷酸和多肽的药物以及该药物特定的治疗应用。此外，本发明预期用于所述多肽和药物生产的方法。

权利要求

1.编码神经毒素多肽的多核苷酸，所述多肽在受试者中显示出生物学效应缩短的持续时间，其中所述多肽在轻链中包含至少一个降解信号，其中所述降解信号选自：a)至少一个内部或末端引入的PEST基序；

b)至少一个内部或末端引入的E3连接酶识别基序。

2.权利要求1的多核苷酸，其中所述生物学效应在受试者中引起肌肉麻痹。

3.权利要求1的多核苷酸，其中所述缩短的持续时间持续少于4、3或者2周。

4.权利要求1至3任一项的多核苷酸，其中所述多肽的轻链通过修饰下述轻链得到，所述轻链由包含选自以下核酸序列的多核苷酸编码：a)具有SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13或者15中显示的核苷酸序列的核酸序列；和b)与a)的核酸序列有至少98％同一性的核酸序列。

5.载体，其包含权利要求1至4任一项的多核苷酸。

6.宿主细胞，其包含权利要求1至4任一项的多核苷酸或者权利要求5的载体。

7.权利要求6的宿主细胞，其中所述细胞是大肠杆菌细胞或者梭菌属或者芽孢杆菌属细胞。

8.权利要求1至4任一项的多核苷酸编码的多肽。

9.根据权利要求1至4任一项的多核苷酸，其用作药物。

10.根据权利要求8的多肽，其用作药物。

11.权利要求1至4任一项的多核苷酸或者权利要求8的多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗伤口愈合、骨的固定和腱断裂治疗、外科手术后固定，痔切除术、牙移植物的引入或者髋关节置换术、膝关节置换术、眼科手术、痤疮或者肠易激惹疾病。

12.制备权利要求1至4任一项的多核苷酸编码的神经毒素多肽的方法，其包括以下步骤：a)在允许权利要求1至4任一项的多核苷酸编码的神经毒素多肽表达的条件下培养权利要求6的宿主细胞，并且b)从a)的细菌培养物中得到权利要求1至4任一项的多核苷酸编码的神经毒素多肽。

13.制备药物的方法，其包括权利要求12的方法的步骤和将权利要求1至4任一项的多核苷酸编码的神经毒素多肽配制为药物的进一步步骤。

说明书

显示出缩短的生物学活性的神经毒素

[0001] 本发明涉及制药领域。具体地，预期编码神经毒素多肽的多核苷酸，所述多肽在受试者中显示出生物学效应减少的持续时间，其中所述多肽在轻链中包含至少一个降解信号，以及包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞，由此编码的多肽，和特异性地与所述多肽结合的抗体。此外，本发明涉及包含所述多核苷酸和多肽的药物以及该药物特定的治疗应用。此外，本发明预期用于所述多肽和药物生产的方法。

[0002] 肉毒杆菌和破伤风梭菌产生高效的神经毒素，即分别为肉毒毒素(BoNTs)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素(CNTs)与神经元细胞特异性地结合并且干扰神经递质释放。每种毒素被合成为无活性的未加工的约150kDa的单链蛋白。翻译后加工涉及二硫键的形成和细菌蛋白酶的有限蛋白酶解(切割)。活性的神经毒素由两条链组成，它们是通过二硫键连接的约50kDa的N端轻链和约100kDa的重链。CNTs由三个结构域组成，即催化轻链，包括易位结构域(N端的一半)的重链和受体结合结构域(C端的一半)，见Krieglstein1990，Eur J Biochem 188，39；Krieglstein1991，Eur J Biochem 202，41；Krieglstein
1994，J Protein Chem 13，49。肉毒杆菌神经毒素以分子复合体形式合成，其包含150kDa的神经毒素蛋白和相关的无毒性的复合蛋白。基于梭菌菌株和不同的神经毒素血清型，复合体的大小在300kDa至900kDa的范围内变化。在这些复合体中的复合蛋白稳定神经毒素并且保护其免于降解，见Chen 1998，Infect Immun 66(6)：2420-2425。

[0003] 肉毒杆菌分泌七种抗原性不同的血清型，其被称作肉毒杆菌神经毒素(BoNT)的2+
A至G型。全部血清型和破伤风梭菌分泌的相关破伤风神经毒素(TeNT)是Zn 内切蛋白
2+
酶，所述Zn 内切蛋白酶通过裂解SNARE蛋白封闭突触的胞吐作用，见Couesnon，2006，Microbiology，152，759。CNTs在肉毒中毒中引起可见的弛缓性肌肉麻痹，见Fischer
2007，PNAS 104，10447。

[0004] 尽管它具有毒性作用，肉毒杆菌毒素已经用于很多疾病或病症的治疗剂。在1989年肉毒杆菌毒素血清型A在美国被批准用于人的斜视、睑痉挛和其他的病症的治疗。它可作为肉毒杆菌毒素A蛋白复合体通过商业途径得到，例如以商品名BOTOX(Allergan Inc)或者商品名DYSPORT(Ipsen Ltd)获得。为了治疗应用，直接将复合体注射入待治疗的肌肉中。在生理pH下，毒素从蛋白复合体中释放出来，并且产生了所期望的药理学效应。一种改进的非复合体的神经毒素A多肽制剂以商品名XEOMIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)获得。肉毒杆菌毒素的效应只是暂时的，这是需要肉毒杆菌毒素的重复施用以维持治疗效果的原因。

[0005] 梭菌神经毒素减弱随意肌强度并且是斜视、包括颈肌张力障碍的灶性张力障碍，以及良性自发性睑痉挛的有效的治疗剂。已经进一步地显示梭菌神经毒素减轻单侧面部痉挛和局限性痉挛，并且，此外，其对多种其他的适应症如胃肠病症、多汗以及美容除皱是有效的，见Jost 2007，Drugs 67，669。

[0006] 然而，对于医学状况或疾病如伤口愈合、骨的固定和腱断裂治疗、外科手术后固定，特别用于痔切除术、牙植入物的引入或者髋关节置换术(内假体)、膝关节形成术、眼科手术、痤疮或者易激肠疾病，减弱肌肉强度和收缩也是所希望的。神经毒素通常在一段时间内显示它们的生物学效应，所述一段时间比所述疾病或状况的有效治疗实际需要的时间长。然而，在所述医学状况或疾病的治疗中延长的肌肉麻痹是有害的或者至少不是优选的。然而，只在所希望的时间段内显示它们的生物学效应的神经毒素还不能得到。

[0007] 因此，本发明的技术问题可以看作是提供满足前述需要的手段和方法。通过权利要求和下文表征的实施方案解决了该技术问题。

[0008] 因此，本发明涉及编码神经毒素多肽的多核苷酸，所述多肽在受试者中显示生物学效应减少的持续时间，其中所述多肽在轻链中包含至少一个降解信号。

[0009] 本文使用的术语“多核苷酸”指的是单链或双链DNA分子以及RNA分子。所述术语包括基因组DNA、cDNA、hnRNA、mRNA以及这些分子种类所有的天然出现的或者人工修饰的衍生物。一方面，该多核苷酸可以是线性或者环形分子。此外，除了编码前述神经毒素多肽的核酸序列，本发明的多核苷酸可以包含正确的转录和/或翻译需要的其他的序列，如5′或3′UTR序列。本发明的多核苷酸编码经修饰的神经毒素多肽，所述神经毒素多肽来源于肉毒杆菌神经毒素的抗原性不同的血清型之一，即BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或者破伤风神经毒素(TeNT)。在本发明的一方面，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO：1(BoNT/A)、SEQ ID NO：3(BoNT/B)、SEQ ID NO：5(BoNT/C1)、SEQ ID NO：7(BoNT/D)、SEQ ID NO：9(BoNT/E)、SEQ ID NO：11(BoNT/F)、SEQ ID NO：13(BoNT/G)或者SEQ ID NO：15(TeNT)中所示的核酸序列。此外，在一方面包括多核苷酸序列，其包含核酸序列，所述核酸序列编码显示为SEQ ID NO：2(BoNT/A)、SEQ ID NO：4(BoNT/B)、SEQ ID NO：6(BoNT/C1)、SEQ ID NO：8(BoNT/D)、SEQ ID NO：10(BoNT/E)、SEQ ID NO：12(BoNT/F)、SEQ ID NO：14(BoNT/G)或SEQ ID NO：16(TeNT)中的任一个的氨基酸序列。另一方面，所述多核苷酸是前述多核苷酸的变体，其包含一个或者多个核苷酸取代、缺失和/或添加，在另一方面该变体仍可导致其编码的氨基酸具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失和/或添加。此外，在另一方面，本发明的变体多核苷酸包含核酸序列变体，其与SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13或者15的任一个中所示的核酸序列有至少40％，至少50％，至少60％，至少
70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或者至少99％的同一性，或者这样的核酸序列变体，该核酸序列变体编码的氨基酸序列与SEQ ID NOs：2，4，6，
8，10，12，14，或者16中的任一个显示的氨基酸序列有至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或者至少99％的同一性。此处使用的术语“同一性”指的是序列同一性，其如下表征：确定两种核酸序列或者氨基酸序列之间相同的氨基酸数目，其中所述序列被比对以取得最高阶匹配。使用计算机程序中编码的公开的技术或方法例如BLASTP，BLASTN或FASTA(Altschul 1990，J Mol Biol215，403)可以计算序列同一性。一方面，在完整氨基酸序列上计算百分比同一性值。技术人员可得到用于比较不同序列的基于多种算法的一系列程序。在本上下文中，Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman的算法提供特别可信的结果。可以使用程序PileUp(Higgins 1989，CABIOS5，151)或者程序Gap和BestFit(Needleman 1970，J Mol Biol 48；443；Smith 1981，Adv Appl Math 2，482)进行序列比对，所述程序是GCG软件包(Genetics Computer Group 1991，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)的一部分。在本发明的另一方面，在完整序列区使用程序GAP确定上文所述的序列同一性值(以百分比(％)表示)，使用以下设定：空位权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000和平均错配：0.000，除非另外特别指出，该设定将一直用作序列比对的标准设定。

[0010] 一方面，每个前述变体多核苷酸编码保留各自神经毒素多肽的一种或者多种或者全部生物学性质的多肽，所述各自神经毒素多肽即BoNT/A，BoNT/B，BoNT/C1，BoNT/D，BoNT/E，BoNT/F，BoNT/G或者破伤风神经毒素(TeNT)。尽管可以想到未加工的前体可以行使一些生物功能或者有部分活性，本领域技术人员将理解其只有在蛋白水解激活后才能保持全部生物学活性。此处使用的“生物学活性”指的是(a)受体结合，(b)内化，(c)穿过内体膜进入胞质的易位，和/或(d)涉及突触囊泡膜融合的蛋白质的内切蛋白酶解切割。用于评估生物学活性的体内测定包括Pearce等人(Pearce 1994，Toxicol Appl Pharmacol128：69-77)和Dressler等人(Dressler 2005，Mov Disord 20：1617-1619，Keller 2006，Neuroscience 139：629-637)描述的小鼠LD50测定和离体小鼠半隔膜测定。生物学活性通常用小鼠单位(MU)表示。此处使用的1MU是经腹膜内注射后杀死50％的特定小鼠群体的神经毒素组分的量，即小鼠i.p.LD50。另一方面，变体多核苷酸可以编码具有改进的或者改变的生物学性质的神经毒素，如它们可以包含切割位点，其改进酶的识别或者可以改进受体的结合或者上文提到的任何其他性质。

[0011] 此外，一方面包括融合多肽，其进一步地包含可检测的标记肽或者标记。一方面，适合的标记是FLAG-标记，Myc-标记或者His-标记，所述标记也允许带标记的多肽的更有效的纯化。一方面，可检测的标记肽包括荧光蛋白如GFP，BFP等等。另一方面，变体多核苷酸应该编码融合神经毒素多肽，其包含不同血清型的至少两种神经毒素多肽的一部分，例如包含BoNT/A的重链和BoNT/E的轻链的融合神经毒素。

[0012] 本发明的多核苷酸编码的神经毒素多肽在它的轻链上进一步地包含至少一个降解信号。在本发明的一个方面，本发明的多核苷酸编码的神经毒素多肽的所述轻链通过轻链的修饰得到，被修饰的轻链由包含前述特定的核酸序列或者上文描述的它们的变体中的任一个的多核苷酸编码。前体多肽(单链多肽)的蛋白水解切割产生神经毒素多肽的轻链。该轻链是前体多肽的N端部分，所述N端部分由蛋白水解切割得到。一方面，可以从下表指出的切割位点推导上文涉及的神经毒素多肽轻链的氨基酸序列。

[0013]

[0014]

[0015] 本文使用的术语“降解信号”指的是神经毒素多肽轻链的修饰，其导致已经应用该神经毒素的生物中存在的内源降解途径对该神经毒素多肽的增加的降解。一方面，降解途径将是蛋白酶体降解途径或者溶酶体降解途径。另一方面，例如通过一个或者多个蛋白水解切割步骤，降解途径可以只是导致神经毒素多肽的部分降解。可将所述降解信号引入到轻链中(即在轻链内定位(内部的))或者将其与N-或者C-端连接。本领域技术人员非常了解合适的降解信号以及如何将它们引入或者连接至神经多肽的轻链。此外，通过应用重组分子生物学技术或者化学修饰，技术人员可以产生多核苷酸，其编码具有至少一个降解信号的这种神经多肽。例如，可以使用定点诱变来引入下文提到的降解信号。备选地，可以设计多核苷酸的核酸序列并且随后化学合成完整的多核苷酸，所述核酸序列包含神经毒素多肽和设想的降解信号的编码序列。

[0016] 一方面，所述降解信号选自：

[0017] a)至少一个内部或末端引入的PEST基序；

[0018] b)至少一个内部或末端引入的E3连接酶识别基序；

[0019] c)N-端寡赖氨酸残基；

[0020] d)N-端连接的泛素；

[0021] e)N-端脯氨酸用碱性氨基酸取代；

[0022] f)表面展示的氨基酸残基用赖氨酸取代；并且

[0023] g)N-端脯氨酸用碱性氨基酸取代与表面展示的氨基酸残基用赖氨酸取代相组合。

[0024] 一方面，E3连接酶识别基序具有下表中显示的共有序列(其中“X”可以代表任一个天然存在的氨基酸)：

[0025]

[0026] PEST基序作为降解信号在本领域是众所周知的(Rogers 1986，Science234：364-368，Rechsteiner 1996，TIBS 21：267-271，Belizario 2008，Science9：210-220)。一方面，PEST基序具有在Rechsteiner 1996，TIBS 21：267-271，表1(在此并入作为参考)中公开的序列，其用于以下蛋白质的任一个：GCN4， Fos，鸟氨酸脱羧酶，Cactus，CLN2，CLN 3或者NIMA。

[0027] 与未修饰的神经毒素多肽相比，本发明的多核苷酸编码的经修饰的神经毒素多肽施用时在受试者中显示生物学效应缩短的持续时间。一方面，在受试者中观察到的所述生物学效应引起肌肉麻痹，即肌肉收缩能力的(可逆的)失活。一方面，用所谓的小鼠跑步测定(Keller 2006，Neuroscience 139：629-637)可以测试该效应。本领域的技术人员可以不费周折地决定该生物学效应。一方面，生物学效应缩短的持续时间指统计上的显著缩短的持续时间。本领域的技术人员通过应用标准统计测试，例如置信区间的确定、p-值的确定、斯氏t检验、曼-惠特尼检验等可以确定效应的持续时间是否是统计学上显著减少。优选的置信区间是至少90％，至少95％，至少97％，至少98％或者至少99％。优选的p-值是0.1，0.05，0.01，0.005或者0.0001。优选地，本发明预想的概率允许对于至少60％，至少
70％，至少80％或者至少90％的给定群组或者群体的受试者，诊断将是正确的。一方面，所述缩短的持续时间保持少于75％，少于70％，少于65％，少于60％，少于55％，少于50％，少于45％，少于40％，少于30％或者少于20％的正常持续时间，即，为未修饰的神经毒素多肽观察到的持续时间。一方面，在BoNT/A的情况下正常持续时间持续约4个月，在BoNT/B的情况下为2个月，在BoNT/C的情况下为约3至4个月，或者在BoNT/E的情况下为约4周(Foran，J Biol.Chem.278(2)：1363-1371，Eleopra 1998，Neurosci Lett.13，256(3)：
135-138，Eleopra 1997，Neurosci Lett.14，224(2)：91-94，Sloop 1997，Neurology
49(1)：189-194，Washbourne 1998，J Physiol Paris 92(2)：135-139)。可以理解效应的持续时间取决于受试者中个体的影响如遗传背景、年龄、生活方式等。因此，此处指的近似的持续时间指上文指出的每种神经毒素多肽的持续时间(例如对于BoNT/A为4个月，或者对于BoNT/E为4周)，其具有25％或者更少，20％或者更少，15％或者更少，10％或者更少，
5％或者更少的标准差。

[0028] 有利地，根据本发明已经发现可以修饰神经毒素多肽以使其在被施用的受试者中显示缩短的生物学效应。原则上，将降解信号引入到所述神经毒素多肽轻链中或者与该轻链连接可以实现该目的，因为发现轻链的持久性与生物学效应的持续时间相关。对于需要失活神经活动，例如肌肉麻痹以促进伤口愈合的多种治疗应用，神经毒素多肽引起的生物学效应缩短的持续时间是有益的。

[0029] 本发明预期包含本发明的多核苷酸的载体。

[0030] 术语“载体”优选地包括噬菌体、质粒、病毒或者逆转录病毒载体以及人工染色体，如细菌或者酵母人工染色体。此外，该术语也涉及靶向构建体，其允许靶向构建体随机或者位点定向地整合进基因组DNA。优选地，这种靶标构建体包含下文详述的用于同源或者异源重组的足够长度的DNA。一方面，包含本发明的多核苷酸的载体进一步包含用于在宿主中增殖和/或选择的选择标记。可通过本领域已知的多种技术将载体掺入到宿主细胞中。例如，可以将质粒载体引入至沉淀如磷酸钙沉淀或氯化铷沉淀中，或者引入至具有带电的脂类的复合体中，或者引入至基于碳的聚集物如富勒烯中。备选地，可通过热激或者电穿孔技术引入质粒载体。如果载体是病毒，应用到宿主细胞之前，使用适当的包装细胞系在体外包装病毒。逆转录病毒载体可以是有复制能力的或者复制缺陷的。在后一情况下，病毒的增殖一般只在互补的宿主/细胞中发生。此外，在本发明的一方面，多核苷酸与表达控制序列有效地连接，允许所述载体在原核或真核宿主细胞或其分离的级分中表达。多核苷酸的表达包括多核苷酸转录形成可翻译的mRNA。宿主细胞中确保表达的调节元件在本领域是众所周知的。一方面，它们包含确保转录起始的调节序列和/或确保转录终止和转录物稳定的多聚-A信号。其他的调节元件可以包括转录及翻译增强子。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调节元件包括，例如大肠杆菌中的lac-，trp-或tac-启动子，并且允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的实例是酵母中的AOX1-或GAL1-启动子或者是哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-，SV40-，RSV-启动子(劳斯肉瘤病毒)，CMV-增强子，SV40-增强子或者珠蛋白内含子。此外，本发明包括的表达载体中可以使用诱导型表达控制序列。这些诱导型载体可以包含tet或lac操纵基因序列或者通过热激或其他环境因素诱导的序列。适合的表达控制序列在本领域是众所周知的。除了负责转录起始的元件，此类调节元件也可以包含位于多核苷酸下游的转录终止信号，如SV40-多聚-A位点或者tk-多聚-A位点。在本上下文中，合适的表达载体在本领域是已知的，如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)，pBluescript(Stratagene)，pCDM8，pRc/CMV，pcDNA1，pcDNA3(Invitrogen)或者pSPORT1(Invitrogen)。优选地，所述载体是表达载体并且是基因转移或靶向载体。来源于病毒如逆转录病毒、痘苗病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于将本发明的多核苷酸或者载体递送到靶向细胞群中。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建重组病毒载体，见例如Sambrook，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates 和 Wiley Interscience，N.Y.(1994)中描述的技术。

[0031] 此外，本发明涉及包含本发明的多核苷酸或者载体的宿主细胞。

[0032] 此处使用的术语“宿主细胞”包括原核和真核宿主细胞。一方面，宿主细胞是细菌细胞并且，另一方面是厚壁菌门细菌细胞。一方面，所述细菌细胞是大肠杆菌宿主细胞。另一方面，它是梭菌属宿主细胞。另一方面，所述梭菌属宿主细胞是肉毒杆菌宿主细胞，甚至另一方面，是前面提到的肉毒杆菌的七种不同血清型中的一种细胞。另一方面，细菌宿主细胞是破伤风梭菌宿主细胞。再一方面，宿主细胞是芽孢杆菌属宿主细胞并且特别是巨大芽孢杆菌宿主细胞。一方面，真核宿主细胞是适合产生有毒蛋白的动物细胞系的细胞或者真菌宿主细胞如酵母宿主细胞。

[0033] 本发明也包括本发明的多核苷酸编码的多肽。

[0034] 此处使用的术语“多肽”包括分离的或者基本纯化的多肽，其基本不含其他多肽，包括宿主细胞的复合蛋白(HA70，HA17，HA33，或者NTNH(NBP)或者包含额外的其他蛋白的多肽制剂。此外，该术语包括化学修饰的多肽。这些修饰可以是人工修饰或者天然发生的修饰。如上文提到的，本发明的多肽应该具有上文提到的神经毒素多肽的生物学性质。此外，它将在施用时在受试者中显示生物学效应缩短的持续时间。一方面，可以通过其他地方更详细描述的生产多肽的方法来生产本发明的多肽。在本发明的一方面，也预期多肽制剂，其包含神经毒素多肽和它的复合蛋白组成的复合体。

[0035] 此外，本发明涉及与本发明的多肽特异地结合的抗体。

[0036] 使用根据本发明纯化的多肽或者来源于它的合适片段作为抗原，通过众所周知的方法可以制备针对本发明多肽的抗体。通过本领域众所周知的抗原性决定算法可以鉴定适合作为抗原的片段。这些片段可以通过蛋白水解消化本发明的多肽得到或者可以是合成肽。一方面，本发明的抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、人或人源化抗体、或者是其灵长类源化的抗体、嵌合抗体或者片段。本发明包含的抗体也是双特异性抗体、合成抗体、抗体片段如Fab，Fv或scFv片段等，或者这些抗体任一种的化学修饰的衍生物。本发明的抗体应该与本发明的多肽特异地结合(即不与其他的多肽或者肽发生交叉反应)。具体地，抗体也不应该与未修饰的神经毒素多肽发生交叉反应。用多种众所周知的技术可以测试特异性结合。使用如Harlow和Lane″Antibodies，A Laboratory Manual″，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988中描述的方法，可以得到抗体或者它的片段。使用bei 等人( 1975，Nature 256(1975)，495)或Galfré(Galfré1981，Meth.
Enzymol.73(1981))最初描述的技术可以制备单克隆抗体，所述技术包括小鼠骨髓瘤细胞与来源于哺乳动物的脾细胞的融合物，该哺乳动物已经被抗原，即本发明的多肽或者它的免疫原性片段免疫过。抗体可以用于，例如本发明多肽的免疫沉淀和免疫定位，以及例如在重组生物中监测所述多肽的存在，并且用于与根据本发明的蛋白质相互作用的化合物的鉴定。例如，在BIAcore系统中使用的表面等离振子共振可以用于增加噬菌体抗体的效率，所述噬菌体抗体与本发明的蛋白质表位结合(Schier1996，Human Antibodies Hybridomas
7，97-105；Malmborg 1995，J.Immunol.Methods 183，7-13)。

[0037] 本发明的多核苷酸或者多肽一般可用作药物。

[0038] 一方面，本文使用的术语“药物”指的是药物组合物，其包含生物学活性的神经毒素多肽或者编码该多肽的多核甘酸作为药物活性化合物。所述药物可以以治疗有效剂量用于人或动物多种疾病或者病症的治疗。可以用多种技术配制该药物，所述技术取决于期望的应用目的。在下文具体指出根据本发明药物的不同方面。

[0039] 一方面，药物包含本发明的生物学活性的神经毒素多肽和一种或多种可药用的载体作为药物组合物。在与制剂的其他成分相容的意义上，可药用的载体必须是可接受的并且对所述制剂的接受者无害。使用的药用载体可以包括固体、凝胶或者液体。固体载体的实例是乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸等等。液体载体的实例是甘油、磷酸缓冲盐水溶液、水、乳剂、多种润湿剂等等。合适的载体包含上文提到的那些和本领域众所周知的其他载体，例如，见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。特别地，如果药物的活性成分是本发明的多核苷酸，可以理解载体也可以是适合基因治疗的病毒或者逆转录病毒。

[0040] 一方面，药物在施用之前先溶于稀释剂。也选择稀释剂从而不影响组合的生物学活性。这种稀释剂的实例是蒸馏水或者生理盐水。此外，药物组合物或者制剂也可以包括其他的载体或者无毒性的非治疗的非免疫原性的稳定剂等等。因此，一方面，本发明的神经毒素多肽可以以液体或者冻干的形式存在。一方面，它可以与甘油、蛋白稳定剂(HAS)或者非蛋白稳定剂如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、透明质酸或者游离氨基酸一起存在。一方面，在WO2005/007185或者WO 2006/020208中公开了适合的非蛋白质稳定剂。

[0041] 另一方面，将以包含神经毒素多肽的溶液形式提供药物。此外，溶液也可以包含上文提到的载体或者稳定剂。一方面，如US 7,211,261公开的，可以提供神经毒素多肽稳定的液体制剂。

[0042] 一方面，可局部施用药物组合物。通常经肌肉内或者皮下(靠近腺体)施用药物，施用方式取决于所预期的医学适应症。然而，取决于化合物性质和作用方式，也可以通过其他的途径施用药物组合物。

[0043] 治疗有效剂量指的是预防、改善或者治疗本说明书中涉及的状况或者疾病伴随的症状的本发明的神经毒素多肽或者多核苷酸的量。在细胞培养物或者实验动物中通过标准药物方案，例如ED50(50％群体治疗有效剂量)和LD50(50％群体致死剂量)可以确定化合物的治疗功效和毒性。治疗效果和毒性效果之间的剂量比是治疗指数，并且它可以用比例LD50/ED50表示。一方面，本发明的药物将包含在开处方者或者使用者的说明书中的推荐剂量以便依据个体受试者预期剂量调整。

[0044] 开发了至少施用一次的本文涉及的药物以便治疗或者改善或者预防本说明书中列举的疾病或者状况。然而，可以不止一次地施用所述药物。

[0045] 本发明的另一方面，除了生物学活性的神经毒素多肽，根据本发明的药物可以包含药品，其在药物配制的过程中加入到药物组合物中。

[0046] 此外，本发明涉及本发明的多核苷酸或者多肽制备药物的用途，所述药物用于治疗伤口愈合、骨的固定和腱断裂治疗、外科手术后固定，特别用于痔切除术、牙移植物的引入或者髋关节置换术(内假体)、膝关节置换术、眼科手术、痤疮或者易激肠疾病。

[0047] 前面提到的医学状况或者疾病相关的症状是本领域技术人员众所周知的，并且在医学的标准课本如Stedman或Pschyrembl中描述。

[0048] 此外，本发明也涉及本发明的多核苷酸或者多肽制备诊断药物的用途，所述诊断药物用于确定受试者是否对神经毒素治疗敏感。

[0049] 上文提到的诊断药物是上文提到的神经毒素多肽药物。然而，可以在一段时间内并且以一种剂量方案来应用药物，所述剂量方案允许仅确定受试者是否对神经毒素多肽应答或者确定适合的剂量方案。因为上文的神经毒素多肽-尽管也具有治疗的潜能-在这方面主要用于诊断目的而非治疗或者改善目的，所以将包含它的药物称作“诊断药物”。因此，这种用本发明的经修饰的神经毒素多肽进行的时间限制的预筛选将帮助筛选对使用未修饰的神经毒素治疗敏感的受试者和确定适合的剂量。因为本发明经修饰的神经毒素引起的生物学效应的持续时间缩短，可以减少基于未经修饰的神经毒素治疗的潜在的副作用，所述未经修饰的神经毒素一般持续更长时间。

[0050] 本发明包括制备本发明的多核苷酸编码的神经毒素多肽的方法，其包括以下步骤：

[0051] a)在允许本发明的多核苷酸编码的神经毒素多肽表达的条件下培养本发明的宿主细胞，并且

[0052] b)从a)的宿主细胞培养物中得到本发明的多核苷酸编码的神经毒素多肽。

[0053] 一方面，可以通过所有常规的纯化技术从培养物中得到多肽，所述常规的纯化技术包括亲和层析、大小排阻层析、高压液相层析(HPLC)以及沉淀技术，包括抗体沉淀。此外，一方面，用本发明的方法得到的神经毒素多肽可以不含复合蛋白。另一方面，可以得到复合体形式的神经毒素多肽，所述复合体还包含神经毒素多肽复合蛋白。此外，一方面，如本文使用的得到包括神经毒素多肽的激活。这可以通过(单链)神经毒素多肽前体的蛋白水解切割实现，所述蛋白水解切割可通过内源的或者外源的(如重组表达的)蛋白酶在细