具有强心作用的内酰亚胺类新化合物及其制备方法和用途

摘要

本发明公开了具有强心作用的内酰亚胺类化合物及其制备方法和用途。本发明式I所示的内酰亚胺类化合物从食用真菌松茸(Tricholoma Matsutake Sing)的乙酸乙酯萃取物中获得，鉴定为3，5二甲基-1-氮二环[5，2，1]癸烷-2，10-二酮。哺乳动物实验表明，本发明化合物具有不同程度的强心作用，能明显改善心衰动物的心脏功能，抑制心肌代偿性肥大。在离体心脏中具有明显的增加心肌收缩力的作用，而对心率没有影响，且不增加心脏的基础耗氧量。整体动物实验表明，本发明公式的内酰亚胺类化合物能够治疗手术及化学药物诱导的急、慢性心力衰竭，并对由心衰引起的心脏功能和病理变化有明显的改善作用。

权利要求

1.具有增强心肌收缩活性的内酰亚胺类化合物，其结构式为式I所示：

2.一种制备权利要求1所述的内酰亚胺类化合物的方法，包括以下步骤：（1）将松茸用水或体积比为0～70%乙醇-水溶液浸泡，得到水提取物或乙醇提取物；（2）将松茸的水或乙醇提取物经乙酸乙酯萃取，减压回收得乙酸乙酯层浸膏；（3）将乙酸乙酯层浸膏进行分离纯化，即得。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的分离纯化方式包括：将乙酸乙酯层经硅胶柱色谱，分别以环己烷-乙酸乙酯和氯仿-甲醇进行梯度洗脱，得到Fr.1～Fr.8共8个馏分；将Fr.8经ODS柱色谱以体积比为10%～80%的甲醇-水为洗脱剂进行梯度洗脱，其中Fr.8-2经制备型HPLC色谱进行分离，以甲醇-水为流动相进行洗脱，得到式I化合物。

4.一种治疗心力衰竭或心力衰竭相关并发症的组合物,其特征在于：由治疗上有效量的权利要求1所述的内酰亚胺类化合物和药学上可接受的载体或稀释剂组成。

5.权利要求1所述的内酰亚胺类化合物在制备治疗心力衰竭或心力衰竭相关并发症的药物中的用途。

6.权利要求1所述的内酰亚胺类化合物在制备用作构建哺乳动物心力衰竭模型的工具药中的用途。

7.按照权利要求6所述的用途，其特征在于：所述哺乳动物包括啮齿类实验动物。

8.权利要求1所述的内酰亚胺类化合物在制备辅助治疗心力衰竭或心力衰竭相关并发症的保健食品中的用途。

说明书

具有强心作用的内酰亚胺类新化合物及其制备方法和用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一个新的内酰亚胺类化合物，尤其涉及具有强心作用的内酰亚胺类化合物及其制备方法，本发明还涉及该化合物在制备治疗心力衰竭及相关并发症的药物上的用途。

背景技术

[0002] 松茸(Tricholoma Matsutake Sing)，又名松菌、松覃、松口蘑。松茸属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，口蘑科，口蘑属。宋代《经史证类务急本草》有过记载。松茸是亚洲地区的特有种，主要分布在日本、朝鲜半岛以及中国东北、西南和台湾省。松茸有很高的营养价值与药用价值。目前中国大部分松茸均出口日本，在中国的应用与研究较少。据文献记载，松茸具有多种活性成分，如多糖、氨基酸、蛋白质、多肽、甾类、萜类、挥发油、油脂以及多种酶，能预防与治疗多种疾病，如抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗真菌、抗糖尿病、抗炎等，也有报道称其具有治疗心血管疾病的作用，但是未见其在此方面的系统研究。研究较多的是松茸中的多糖是抗癌的主要活性物质、蛋白具有免疫调节作用，但对其他类成分的研究很少。松茸的美味与药效引起了人们的广泛关注，但是到目前为止尚不能对其进行人工栽培，这也限制了它的应用价值。

[0003] 心力衰竭(心衰)又称心功能不全，是指有适量静脉回流的情况下，由于心脏长期负荷过重或心肌收缩力下降，心脏不能排出足够血液满足组织代谢需要以致周围组织灌注不足和肺循环或体循环淤血，从而出现的一系列临床症状和特征，主要表现为呼吸困难、乏力、液体潴留、射血分数降低、运动耐量的减退等。近年来，尽管心血管疾病的治疗取得了很大的进展，但心衰的发病率仍在增加，尤其是随着年龄的老年化更为明显，在人群中发病率约为1.5～2.0％，但65岁以上人群可达6～10％。2003年对中国具有代表性的10个省市35～74岁15518人流行病学的调查结果表明，心衰的患病率为0.9％，随着年龄的增高，发病率也增加，65岁以上为1.3％。在美国据估计约有500万慢性心衰患者，同时每年有50万新被诊断的病例。心衰的防治已成为众所关注的最重要的心血管疾病，是21世纪重要的公共卫生问题。

[0004] 心衰是各种严重心脏疾病晚期表现出的一种复杂综合症，各种原因引起的心肌损伤及心脏结构变化和功能的降低均可出现心衰。20世纪90年代中后期，研究表明心衰发生、发展的根本原因是与神经内分泌长期激活所导致的心室重构有关。心室重构是心衰不断进展的病理生理基础，是心衰持续发展的一个重要环节。它通过细胞及分子机制导致心肌结构、功能和表型变化，其微观变化表现为心肌细胞的肥大、凋亡，胚胎基因、蛋白质再表达，心肌细胞外基质数量、质量和组成的变化；宏观上表现为心肌重量增加，心室容量增大，心脏几何形状的变化，形成不断进展的恶性循环。

[0005] 心衰治疗的根本目标不仅仅在于改善症状和提高生活质量，更重要的是针对心肌重构的机制，防止和延缓心肌重构的进展，从而降低心衰的死亡率和住院率。目前心衰的标准药物治疗主要包括针对神经内分泌激活的具有生物学修复性的治疗，包括血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、β-受体阻断剂、血管紧张素受体拮抗剂(ARB)、醛固酮拮抗剂等。另外传统利尿剂、正性肌力药以及血管扩张药物依然作为心衰治疗的基本药物。传统的正性肌力药物(包括洋地黄制剂和环腺苷酸(cAMP)依赖性正性肌力药)能够改善心衰患者的症状和提高生活质量，但该类药物能够增加心肌耗氧量和钙负载，具有潜在的风险。因此，传统正性肌力药物的地位有所降低，目前只是作为短期治疗措施来应用。尽管如此，该类药物在心衰的治疗中仍然是一种不可或缺的基本药物。因此，寻找毒副作用小的正性肌力药物对于心衰的治疗具有重要意义。

发明内容

[0006] 本发明目的之一是提供一种具有增强心肌收缩力活性的新的内酰亚胺类化合物。

[0007] 本发明目的之二是提供一种制备上述具有增强心肌收缩力活性的内酰亚胺类化合物的方法；

[0008] 本发明目的之三是将上述内酰亚胺类化合物应用于治疗心力衰竭及相关并发症。

[0009] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

[0010] 一种具有增强心肌收缩力活性的内酰亚胺类化合物，其结构式为式I所示：

[0011] 式I

[0012] 本发明式I所示的化合物是从食用真菌松茸(Tricholoma Matsutake Sing)的乙酸乙酯萃取物中获得，鉴定为3，5二甲基-1-氮二环[5，2，1]癸烷-2，10-二酮(3，5-dimethyl-1-azabicyclo[5，2，1]decane-2，10-diketone)，为一新化合物。

[0013] 本发明的另一目的是提供一种制备上述式I所示的内酰亚胺类化合物的方法，包括以下步骤：(1)将松茸(Tricholoma Matsutake Sing)用水或0～70％乙醇-水(v/v)溶液浸泡，得到水或乙醇提取物，加压浓缩得到水或乙醇提取物浸膏；(2)将松茸的水或乙醇提取物浸膏用水分散，经乙酸乙酯萃取，减压回收得到乙酸乙酯层浸膏；(3)将乙酸乙酯层浸膏进一步分离纯化，即得。

[0014] 步骤(3)中所述的分离纯化方式包括：将乙酸乙酯层经硅胶柱色谱，分别以环己烷-乙酸乙酯和氯仿-甲醇进行梯度洗脱，得到Fr.1～Fr.8共8个馏分；将Fr.8经ODS柱色谱以甲醇-水(10％～80％，v/v)作为洗脱剂进行梯度洗脱，其中Fr.8-2经HPLC制备色谱进行分离，以甲醇-水为流动相洗脱，得到式I化合物。

[0015] 哺乳动物实验表明，式I所示的内酰亚胺类化合物具有强心作用，明显改善心衰动物的心脏功能，抑制心肌代偿性肥大。式I所示的内酰亚胺类化合物在离体心脏中具有明显的增加心肌收缩力的作用(强心作用)，但对心率没有影响，且不增加心脏的基础耗氧量，并利用激光共聚焦技术证明，其强心作用可能是通过增加心肌细胞内钙作用实现的。整体动物实验表明，在哺乳动物啮齿类，式I所示的内酰亚胺类化合物及其组合物能够治疗和改善手术及化学药物诱导的急、慢性心力衰竭的出现的心脏功能变化和病理改变。

[0016] 本发明式I所示的内酰亚胺类化合物还可作为构建哺乳动物心力衰竭模型的工具药，用于构建哺乳动物心力衰竭模型，所述哺乳动物包括啮齿类实验动物。

[0017] 本发明提供了一种治疗心力衰竭的药物，该药物由治疗上有效量的式I化合物和药学上可接受的载体或稀释剂组成。通常该药物适合于口服给药，也适合其他给药方法。将药学上可接受用量的式I化合物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物制剂。该药物制剂可以是片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂，或口服液等液体制剂形式。为了增加药物的溶出和吸收，还可以制备成固体分散体。此外，该药物组合物也可以制备成缓控制剂、纳米制剂以及智能型给药系统。根据不同的给药途径和给药方法，本发明药物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的式I化合物。

[0018] 本发明所述药物的口服固体制剂，包括式I化合物和作为分散剂的载体，所述的载体材料选自交联聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、微粉硅胶、聚乙二醇、糊精及其衍生物、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维素等之一种或其中几种的混合物。所添加的稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分。常用的稀释剂包括乳糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇以及无机钙盐等。其中最常用为乳糖、淀粉、微晶纤维素。

[0019] 所采用的外加崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6％)、海藻酸(与总重量比为2-5％)、微晶纤维素(与总重量比为5-15％)中之一种或几种混合物。其中以交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-7％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6％)为佳。最佳为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6％)

[0020] 所采用的润滑剂包括硬脂酸、硬脂酸钠、硬脂酸镁、硬脂酸钙、聚乙二醇、滑石粉、氢化植物油中之一种或几种混合物。其中以硬脂酸镁最为适宜。润滑剂的用量范围(与总重量比)为0.10-1％，一般用量为0.25-0.75％，最佳用量为0.5-0.7％。

[0021] 所采用的粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分。可以是淀粉浆(10-30％，与粘合剂总重量比)，羟丙基甲基纤维素(2-5％，与粘合剂总重量比)，聚乙烯吡咯烷酮(2-20％，与粘合剂总重量比)，以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳，最佳为聚乙烯吡咯烷酮的50％乙醇水溶液。所用助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉、三硅酸镁中之一种或几种混合物。

附图说明

[0022] 图1本发明式I化合物的结构式。

具体实施方式

[0023] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0024] 实施例1、松茸乙酸乙酯提取物的制备方法

[0025] 松茸(Tricholoma Matsutake Sing)干品2kg在室温下经水或0～70％(乙醇-水，v/v)乙醇浸泡5～8周，得到的乙醇提取物经水分散，经乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯萃取液，得乙酸乙酯层样品8g。

[0026] 实施例2、松茸乙酸乙酯提取物中内酰胺类单体化合物的分离纯化仪器材料：高效液相色谱仪：HPLC detector-Shimadzu RID-6A refractive index；色谱柱：5C18-MS-II，4.6×250mm。柱色谱用硅胶(200-300目)、薄层色谱用硅胶GF254(10-40μm)(青岛海洋化工有限公司生产)，柱色谱用ODS：DM1020T(100-200目)。

[0027] 分离纯化流程：乙酸乙酯层样品(实施例1所制备)，经硅胶柱色谱，分别以环己烷-乙酸乙酯和氯仿-甲醇进行梯度洗脱，得到8个馏分(Fr.1～8)，其中Fr.8经ODS柱色谱以甲醇-水(10％～80％，v/v)作为洗脱剂进行梯度洗脱，其中Fr.8-2经HPLC制备色谱进行分离，以甲醇-水为流动相洗脱得到式I化合物(31mg)。

[0028] 实施例3、式I化合物结构解析

[0029] 仪器设备：旋光仪：Perkin-EImer 241 polarimeter；质谱仪：JEOL GCmate，Bruker APEX micrOTOF-Q；核磁共振仪：JNM-LA500(500MHz)。

[0030] 化合物I黄色油状物， (c 0.72，CHCl2)，HR-EI-MS：195.1261[M]+，分子式为C11H17NO2。根据其理化性质及谱学数据将此化合物鉴定为3，5二甲基-1-氮二环[5，2，1]癸烷-2，10-二酮(3，5-dimethyl-1-azabicyclo[5，2，1]decane-2，10-diketone)，为未见文献报道的新化合物。其NMR(500MHz，CD3OD)数据见表1。

[0031]

[0032] 式I化合物结构式

[0033] 表1、式I化合物的1H、13C NMR数据归属

[0034]

[0035] 实验例1、式I化合物对急性分离心肌细胞内钙的影响

[0036] 1、急性分离大鼠心肌细胞

[0037] 将大鼠称重用10％的水合氯醛350mg·kg-1腹腔注射麻醉，取仰卧位固定于鼠台-1上。腹腔注射肝素抗凝(0.1ml·100g )，5min后取材。迅速开胸取出心脏，置于预冷的4℃的正常台式液中。去除心包膜，快速游离主动脉并逆行插管连接于Langendorff灌流装置上(恒温，37℃)。首先用正常台氏液以约8ml/min的速度连续灌流约3-5min，使心脏复跳，洗去心脏内残血。然后换用无钙台氏液以12ml/min速度灌流大约20-25min，至心脏停止搏动后，换用含0.02％胶原酶II(110U/ml)及0.1％小牛血清白蛋白(BSA，bovine serum albumin)的无钙台氏液继续灌流消化胶原组织以获得单个心肌细胞。当心脏变软、色泽变浅时，开始剪取少量心肌组织，每隔1min剪取一次。将不同时间剪下的心肌组织置于装有KB(mmol/l)液(glutamic acid 70、taurine 15、KCl 30、KH2PO4 10、MgCl2 0.5、EGTA 0.5、HEPES 10、glucose 10)的试管中，用吸管轻轻吹打，使单个心肌细胞从组织块上分离下来。
最后取出残余的大块组织，含有细胞的KB液置于4℃冰箱稳定1h待用。整个实验过程中所有灌流液均用95％O2+5％CO2饱和，温度应始终控制在37℃±0.5℃范围。

[0038] 2、心肌细胞内钙测定

[0039] (1)Fluo-3/AM负载

[0040] 细胞稳定好后，取镜下观察多数为杆状横纹清晰无颗粒的细胞用于实验，先弃去KB液，然后分别用无钙液按体积比稀释成1/8、1/4、1/2和1倍体积的含有牛血清白蛋白(BSA，100mg/L)的正常台氏液各敷钙一次，每次10分钟，然后放在37℃恒温箱中用终浓度为5μmol/L Flue-3/AM染色30min，1000转/min离心1min去除染色液后，用正常台氏液洗涤静置15min后待用，所用液体充O2饱和。

[0041] (2)心肌细胞内[Ca2+]i的测定

[0042] 取染好色的细胞置于浴槽中，静置贴壁5min后用于实验，光镜下选取杆状、横纹2+
清晰无颗粒的细胞实验。在Time series XYT模式下扫描记录心肌[Ca ]i，激发波长为
488nm，扫描时间程序按需要设定。基础荧光值按最小噪声最大图像信号设定，预扫描获得基础值后于第2次和第3次扫描间隙之间化合物I。平均荧光强度以给药后与给药前的荧光强度比值(F∶Fo)表示。

[0043] 3、结果显示，式I化合物具有增加细胞内钙离子浓度，且其作用不依赖细胞外钙。维拉帕米并不能阻断其升高作用。IP3受体阻断剂2-APB预孵育细胞后，细胞内钙浓度升高不明显。说明式I化合物是通过激活IP3受体而引起细胞内钙升高的。结果见表2。

[0044] 表2

[0045] 式I化合物对急性分离心肌细胞内钙浓度的影响(F/F0)

[0046]* ** ***

[0047] 与对照组相比，P＜0.05，P＜0.01， P＜0.001.

[0048] 实验例2、式I化合物对离体大鼠工作心的影响

[0049] 大鼠随机分为对照组、式I化合物组。将大鼠猛击头部致死后，迅速开胸、取心脏，按常规生理技术，做肺静脉及左心室插管并顺向灌流心脏。保持灌充95％O2和5％CO2混合气体，保持心脏前负荷为1.17kPa，后负荷为5.38kPa。多导生理计录仪同步记录LVSP、-1±dp/dtmax、左室舒末压(LVEDP)。实验中灌流液为K-H液(mmol·L )，调pH为7.2～
7.4(温度恒定在37℃)。

[0050] 实验结果表明，式I化合物具有强心作用。结果表3。

[0051] 表3

[0052] 式I化合物对离体大鼠工作心的影响

[0053]

[0054] 与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.

[0055] 实验例3、式I化合物对正常大鼠血流动力学的影响

[0056] 将大鼠称重用10％的水合氯醛350mg·kg-1腹腔注射麻醉后，从右侧颈总动脉插入心导管直至进入左心室以测量心率(HR)、左室收缩压(LVSP)，左室舒张末压(LVEDP)，室内压最大上升速度(+dP/dtmax)和室内压最大降低速度(-dP/dtmax)。实验结果见表4。

[0057] 表4

[0058] 式I对正常大鼠血流动力学的影响

[0059]

[0060] 与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.

[0061] 实验例4、化合物I对压力负荷导致心衰小鼠血流动力学的影响

[0062] 小鼠腹腔注射0.3％戊巴比妥钠麻醉后，仰卧位固定，气管插管，进行机械通气。剪开颈部皮肤，从胸骨角下将胸腺拨向一边，暴露主动脉弓，在主动脉弓上穿一丝线，将主动脉弓与0.5mm垫扎针一起结扎，然后拔出垫扎针，造成主动脉弓缩窄模型。12周后，开始出现心衰。假手术组只穿线，不结扎。灌胃给药化合物I 2周后，处死动物，取心脏进行病理组织学检查。

[0063] 小鼠腹腔注射0.3％戊巴比妥钠麻醉后，从右侧颈总动脉插入心微导管直至进入左心室以测量心率(HR)，左室收缩压(LVSP)，左室舒张末压(LVEDP)，室内压最大上升速度(+dP/dtmax)和室内压最大降低速度(-dP/dtmax)。

[0064] 病理组织学检查发现，假手术组心肌纤维排列正常，无血管扩张及血管壁增厚等表现；12周时心脏肌纤维疏松水肿，间隙增宽，部分肌束间纤维结缔组织增生，心肌细胞肥大明显。灌胃给药2周后，心脏肌纤维水肿减轻，结缔组织增生少于假手术组，肥大心肌纤维部分恢复。血流动力学结果见表5。

[0065] 表5

[0066] 式I化合物对心衰小鼠血流动力学的影响

[0067]

[0068] 与手术对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。