一种刺盘孢菌及其应用

摘要

本发明公开了一种植物内生菌刺盘孢(Colletotrichum sp.)菌株CGMCC No.4180及其在制备吡喃酮类化合物中的应用。

权利要求

1.一种刺盘孢菌(Colletotrichum sp.)，保藏号为：CGMCC No.4180。

2.如权利要求1所述的刺盘孢菌在制备吡喃酮类化合物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述吡喃酮类化合物的结构为：或为

说明书

一种刺盘孢菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物领域，具体涉及一种刺盘孢菌(Colletotrichum sp.)CGMCC No.4180，以及该菌株的应用。

背景技术

[0002] 刺盘孢属真菌是一种植物致病菌，种类繁多，它能使植物染上炭疽病，造成植物烂果、枯枝、叶斑等症状，对农业生产具有一定的危害。同时刺盘孢属真菌通过产生植物毒素等次级代谢产物来抵抗其它病原菌的入侵，因而在一些刺盘孢属真菌的次级代谢产物发现了一些物质具有很强的植物生长抑制活性或抑制病原真菌活性，可用于除草剂或抗真菌药物的开发。刺盘孢属真菌特殊生存环境或生存策略，为我们提供了丰富的生态和遗传多样性，产生了结构类型丰富、活性广泛的次生代谢产物。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种刺盘孢菌。

[0004] 本发明的另一目的在于提供该菌株的应用。

[0005] 本发明提供的刺盘孢菌(Colletotrichum sp.)，从丁香蓼植物的叶中分离得到，经鉴定为刺盘孢菌，为一株植物内生菌，已于2010年9月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.4180。

[0006] 本发明提供的刺盘孢菌，用于制备吡喃酮类化合物。

[0007] 具体的，所述吡喃酮类化合物为：

[0008] 或为

[0009]

附图说明

[0010] 图1为培养6天时菌株的显微特征。

[0011] 图2为根据18SrDNA的序列构建的系统发育树。

[0012] 图3为化合物1的质谱谱图。

[0013] 图4为化合物1的氢谱谱图。

[0014] 图5为化合物1的碳谱谱图。

[0015] 图6为化合物1的HSQC谱谱图。

[0016] 图7为化合物1的H-H COSY谱谱图。

[0017] 图8为化合物1的HMBC谱谱图。

[0018] 图9为化合物1的NOESY谱谱图。

[0019] 图10为化合物2的质谱谱图。

[0020] 图11为化合物2的氢谱谱图。

[0021] 图12为化合物2的碳谱谱图。

[0022] 图13为化合物2的HSQC谱谱图。

[0023] 图14为化合物2的H-H COSY谱谱图。

[0024] 图15为化合物2的HMBC谱谱图。

[0025] 图16为化合物2的NOESY谱谱图。

[0026] 图17为5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-2H-吡喃酮-9-乙酯的质谱谱图。

[0027] 图18为5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-2H-吡喃酮-9-乙酯的氢谱谱图。

[0028] 图19为5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-2H-吡喃酮-9-乙酯的碳谱谱图。

[0029] 图20为5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-2H-吡喃酮-9-乙酯的HSQC谱谱图。

[0030] 图21为5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-2H-吡喃酮-9-乙酯的H-H COSY谱谱图。

[0031] 图22为5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-2H-吡喃酮-9-乙酯的HMBC谱谱图。

具体实施方式

[0032] 以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

[0033] 菌株CGMCC No.4180是自丁香廖植物的叶子中分离得到的内生真菌。菌株在28℃、PDA平板上培养2天后，气生菌丝和基内菌丝均为白色。如图1所示，6天后气生菌丝和基内菌丝致密且变为灰色，并产生孢子。孢子颜色为灰色，分生孢子梗从菌丝层或子座生出，不分枝也不分隔，密集成栅栏状，分生孢子常埋于胶质中，群集时使孢子成橙色等。分生孢子盘有刚毛，刚毛生于分生孢子盘的周围，分生孢子椭圆形或新月形，直或微弯。

[0034] 将该菌株的18S rDNA与GeneBank数据库中的序列进行Blast比对分析，结果显示与其相似性最高的序列主要分布在刺盘孢属(Colletotrichum sp.)。再结合文献报道进行分析，确定该菌株属刺盘孢属(Colletotrichum sp.)，这一论断与根据形态学鉴定的结果一致。进一步构建系统发育树，如图2所示，分析比对发现该菌株与Colletotrichumgloeosporioides在亲缘关系上最为接近。

[0035] 实施例1、刺盘孢菌在制备(2S，3R)-3-羟基-2，5-二甲基-3，4-二氢吡喃-7-酮(化合物1)和(2R，3S)-3-羟基-2，5-二甲基-3，4-二氢吡喃-7-酮(化合物2)中的应用[0036] 将菌株CGMCC No.4180从冻干管中接种到PDA斜面培养基上进行活化培养，于28℃恒温培养箱内培养5天后，将长满菌丝的斜面挖块接种到装有经121℃高压灭菌30min的种子培养基(种子培养基配方：葡萄糖(1.0％)、黄豆粉(2.0％)、玉米粉(1.0％)、KH2PO4(0.1％)，其余为水)的四个250ml三角瓶中进行种子培养，其中，每个三角瓶内装有
50ml种子培养基，于28℃、转速为220rpm摇床上恒温培养2天后，将四个三角瓶内的种子培养液混匀后接种到经115℃高压灭菌20min的含有800g大米、1000ml纯水的容器内，于
28℃培养30天，进行静态固体培养。

[0037] 培养结束后，将容器内的大米和菌体机械粉碎，用乙酸乙酯浸泡提取3次，在减压条件下将溶剂蒸干得到褐色油状提取物。将提取物用300目硅胶拌样后，装于含有300目硅胶的减压柱(Φ7.0*40cm)中，其中样品高2cm，分离硅胶高5cm；用1200ml石油醚∶乙酸乙酯(体积比为1∶1)洗涤，然后用400ml石油醚∶乙酸乙酯(体积比为3∶5)洗脱，得样品馏分。

[0038] 将样品馏分减压蒸干后，用2ml二氯甲烷∶甲醇＝3∶1溶解，上样于用二氯甲烷∶甲醇＝3∶1平衡好的凝胶sephadexLH20柱(Φ2.0*60cm)中，用二氯甲烷∶甲醇＝3∶1洗脱，分布收集，每3ml收一管，其中5～15管为目标馏分。

[0039] 将馏分浓缩干后，用半制备液相色谱分离得到淡黄色油状物，条件为：采用Agilent1100色谱系统，半制备柱为Agilent ZORBAX ODS 5μm，9.4mm*250mm，条件为0～40min用18体积％甲醇(82体积％水)等度洗脱，得到化合物1和化合物2，保留时间tR分别约为33.8和36.0min。

[0040] 经高分辨正离子电喷雾质谱检测，图谱如图3所示，显示化合物1准分子离子峰为：m/z 197.0812(M+H)+，分子式为C10H13O4，比旋光度 (c 2mg/mL，甲醇)，紫外吸收强度K 2524.5(c 0.02mg/mL)。采用Bruker Avance II-400型超导核磁共振仪测定了样品的氢谱(图4)、碳谱(图5)及相关二维谱(HMQC谱(图6)、H-H COSY谱(图7)、HMBC谱(图8)、NOESY谱(图9))，其核磁数据见表1。

[0041] 表1、化合物1核磁数据表(400MHZ，d-MeOH)

[0042]

[0043] 通过解析，确定了该化合物所有碳原子和氢原子的归属，得到了化合物1的结构如下，可见该化合物1为一种吡喃酮类化合物，化学名为(2S，3R)-3-羟基-2，5-二甲基-3，4-二氢吡喃-7-酮。

[0044]

[0045] 经高分辨正离子电喷雾质谱检测，图谱如图8所示，显示化合物2准分子离子峰+为：m/z 197.0808(M+H)，分子式为C10H13O4。比旋光度 (c 0.7g/100mL，甲醇)，紫外吸收强度K4563.2(c 0.033mg/mL)。采用Bruker Avance II-400型超导核磁共振仪测定了样品的氢谱(图11)、碳谱(图12)及相关二维谱(HMQC谱(图13)、H-H COSY谱(图
14)、HMBC谱(图15)NOESY谱(图16))，其核磁数据见表2。

[0046] 表2、化合物2核磁数据表(400MHZ，CD3OD)

[0047]

[0048] 通过解析，确定了该化合物所有碳原子和氢原子的归属，得到了化合物2的结构如下，可见该化合物为一种吡喃酮类化合物，化学名为(2R，3S)-3-羟基-2，5-二甲基-3，4-二氢吡喃-7-酮。

[0049]

[0050] 实施例2、刺盘孢菌在制备5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-9-羟基-2H-吡喃酮-9-乙酯中的应用

[0051] 将菌株CGMCC No.4180从冻干管中接种到PDA斜面培养基上进行活化培养，于28℃恒温培养箱内培养5天后，将长满菌丝的斜面挖块接种到装有经121℃高压灭菌30min的种子培养基(种子培养基配方：葡萄糖(1.0％)、黄豆粉(2.0％)、玉米粉(1.0％)、KH2PO4(0.1％)，其余为水)的四个250ml三角瓶中进行种子培养，其中，每个三角瓶内装有
50ml种子培养基，于28℃、转速为220rpm摇床上恒温培养2天后，将四个三角瓶内的种子培养液混匀后接种到经115℃高压灭菌20min的含有800g大米、1000ml纯水的容器内，于
28℃培养30天，进行静态固体培养。

[0052] 培养结束后，将容器内的大米和菌体机械粉碎，用乙酸乙酯浸泡提取3次，在减压条件下将溶剂蒸干得到褐色油状提取物。将提取物用300目硅胶拌样后，装于含有300目硅胶的减压柱(Φ7.0*40cm)中，其中样品高2cm，分离硅胶高5cm；用1200ml石油醚∶乙酸乙酯(体积比为13∶7)洗涤，然后用400ml石油醚∶乙酸乙酯(体积比为3∶2)洗脱，得样品馏分。

[0053] 将样品馏分减压蒸干后，用2ml二氯甲烷∶甲醇＝3∶1溶解，上样于用二氯甲烷∶甲醇＝3∶1平衡好的凝胶sephadexLH20柱(2.0*60cm)中，用二氯甲烷∶甲醇＝3∶1洗脱，分步收集，每3ml收一管，其中6～19管为目标馏分。

[0054] 将馏分浓缩干后，用半制备液相色谱分离得到淡黄色油状物，条件为：采用Agilent1100色谱系统，半制备柱为Agilent ZORBAX ODS 5μm，9.4mm*250mm，条件为0～40min用35％甲醇(65％水)等度洗脱，该化合物的保留时间tR约为36.5min。

[0055] 经高分辨正离子电喷雾质谱检测，图谱如图17所示，显示其准分子离子峰为：m/z227.0880(M+H)+，分子式为C11H15O5。采用Bruker Avance II-400型超导核磁共振仪测定了样品的氢谱(图18)、碳谱(图19)及相关二维谱(HMQC谱(图20)、H-H COSY谱(图21)、HMBC谱(图22))，其核磁数据见表3。

[0056] 表3、核磁数据表(400MHZ，Actone-d6)

[0057]

[0058] 通过解析，确定了该化合物所有碳原子和氢原子的归属，得到了该化合物的结构如下：

[0059]

[0060] 可见该化合物为一种吡喃酮类化合物，化学名为5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-2H-吡喃酮-9-乙酯。

[0061] 实施例3、吡喃酮类化合物的抗肿瘤活性测定

[0062] 取对数生长期肿瘤细胞，用RPMI1640营养液(含有10％小牛血清，100U/mL青霉4
素和100U/mL链霉素)，配成5×10 个/mL单细胞悬液，按每孔200μL接种于96孔板。于
37℃，5％CO2孵箱培养。培养24h后，小心吸去培养液，加入不同浓度的样品溶液200μL，同时设空白对组调零(无接种细胞，只加入培养液)、阴性对照组(接种细胞，不加药物处理，只加入培养液)，每组设8个平行。于37℃，5％CO2孵箱中培养。培养72h后，每孔加入20μL，5μg/mL的MTT溶液(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，PBS(pH＝7.4)溶解，浓度为5mg/mL)，继续在孵箱中培养。培养4h后，加入4％异丙醇-0.01mol/L HCl 100μL给活细胞染色并过夜。次日用MK-2全自动酶标仪在波长570nm下测定OD值。
重复测量3次按下式计算细胞抑制率：细胞抑制率(％)＝(1-试验组吸收值A/对照组光吸收值A)×100％。

[0063] 表4、化合物1抗肿瘤活性

[0064]

[0065] 表5、化合物2抗肿瘤活性

[0066]

[0067] 表6、5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-2’-羟基-2H-吡喃酮-9-乙酯抗肿瘤活性[0068]

[0069] 由表4、5、6所示的结果可知，该吡喃酮类化合物1和吡喃酮类化合物2以及5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-2′-羟基-2H-吡喃酮-9-乙酯对肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和胰腺癌细胞(PANC-1)具有抑制作用，尤其是对肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MDA-MB-231)有较强的抑制活性。