能与人B淋巴细胞上的mIgE结合的抗CεmX抗体

摘要

本发明涉及可与人B淋巴细胞表面所表达的膜结合IgE(mIgE)的CεmX结构域有效结合的抗体的产生和应用。提出将位于人膜结合ε链的CH4结构域和C末端膜锚定肽之间的52个氨基酸残基的CεmX结构域作为抗原位点，用于免疫靶向表达mIgE的B细胞。以前所报道的与CεmX的C末端的RADWPGPP(SEQ ID NO：1)肽结合的单克隆抗体，包括a20在内，目前据发现与人B细胞上的mIgE的结合较差。我们发现，只有对CεmX的某些片段具有特异性的单克隆抗体可与人B细胞上的mIgE有效结合，这些片段例如GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO：2)和HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR(SEQ ID NO：3)，并因此具有靶向那些B细胞而用于治疗IgE介导的疾病的应用。

权利要求

1.分离的CεmX特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于所述抗体或其抗原结合片段能与人mIg E上的片段GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO:2)结合，其中所述抗原结合片段是Fab、F(ab)’2或单链Fv。

2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是小鼠单克隆抗体。

3.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是包含小鼠单克隆抗体的可变区和人抗体的恒定区的嵌合抗体。

4.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是包含小鼠单克隆抗体的高变区和人抗体的框架区和恒定区的人源化单克隆抗体。

5.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人抗体。

6.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体能与与人B淋巴细胞上的膜结合IgE结合。

7.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含与抗体4B12相同的高变区，并且其中所述高变区如SEQ ID NO:5的24-39、SEQ ID NO:5的55-61、SEQ ID NO:5的94-102、SEQ ID NO:8的26-36、SEQ ID NO:8的51-66和SEQ ID NO:8的98-106所示。

8.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区为SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。

9.如权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是包含重链可变区和轻链可变区的人源化抗体，其中所述重链可变区为SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，以及所述轻链可变区为SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

10.权利要求1-9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗IgE介导的疾病的药物中的用途，其中所述抗体能在表达IgE的B细胞中有效诱导抗体依赖的细胞毒性因而治疗IgE介导的疾病，所述IgE介导的疾病是过敏性哮喘、过敏性鼻炎或特应性皮炎。

11.权利要求1-9中任一项所述的抗体在制备用于治疗IgE介导的疾病的药物中的用途，其中所述抗体能在表达IgE的B细胞中有效诱导抗体依赖的细胞毒性，有效诱导凋亡，或有效减少表达IgE的B细胞，因而治疗IgE介导的疾病，其中所述IgE介导的疾病是寒冷诱发的荨麻疹、慢性荨麻疹、胆碱能性荨麻疹、慢性鼻窦炎、系统性肥大细胞增生症、皮肤肥大细胞增生症、过敏性支气管肺曲霉病、复发性先天血管性水肿和间质性膀胱炎或嗜酸性粒细胞相关的肠胃病症。

说明书

能与人B淋巴细胞上的mIgE结合的抗CεmX抗体

[0001] 发明背景

[0002] IgE在介导I型超敏反应中起到决定性作用，I型超敏反应负责导致的过敏性疾病，包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎等。过敏性反应是免疫系统对无害环境物质的应答，所述环境物质例如尘螨、树木和草的花粉、某些食品和药物以及蜜蜂和火蚁叮咬。在这些反应中，过敏原与嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面IgE的结合引起IgE交联和相关IgE.Fc受体的聚集，所述IgE.Fc受体为I型IgE.Fc受体或FcεRI。该受体聚集随后激活信号途径，导致颗粒的胞吐和药理介质的释放，所述药理介质例如组胺、白三烯、类胰蛋白酶、细胞因子和趋化因子。那些介质从肥大细胞和嗜碱性粒细胞的释放导致过敏反应的各种病理表现。

[0003] 已经开发出用于治疗IgE介导的过敏性疾病的抗IgE的抗体，该抗体与血液和组织液中的游离的IgE和B细胞上的mIgE结合，但是不与嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的FcεRI所结合的IgE结合。利用人源化抗IgE抗体即奥马珠单抗(商品名Xolair)的治疗在多种过敏性病症中表现出弱化I型超敏性的多重药理作用。抗体与IgE在Fc的CH3结构域中的位点高亲和力结合，该位点与FcεRI的结合位点重叠。因此，该疗法基于抗体与游离IgE和B淋巴母细胞和记忆B细胞上的mIgE的结合，这导致血液和组织液中总的游离IgE水平下降。

[0004] 抗IgE与游离的IgE的结合进一步阻止IgE与嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面上的FcεRI的结合。由于未被IgE占据的FcεRI不稳定，且随后内化并降解，以抗IgE结合耗尽游离的IgE也逐渐下调嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的FcεRI。已经发现了抗体疗法其它作用的证据，包括中和细胞因子活性、弱化总炎性活性和可能通过IgE-抗-IgE免疫复合物的累积清除过敏原。

[0005] 本发明的发明人之一(T.W.Chang)发现，IgE除了与奥马珠单抗结合的位于CH3上的抗原位点之外，被称为CεmX的另一个抗原位点存在于人mIgE上，用于靶向表达mIgE的B淋巴细胞。CεmX是位于人膜结合ε链(mε)的CH4结构域和C末端膜锚定片段之间的52个氨基酸的片段。在大多数所研究的人个体中，已经证明，没有CεmX的mε(mεS)占有极小的比例，而具有CεmX的mε链(mεL)优势表达。游离、分泌型IgE的ε链的mRNA和mIgE的mεS和mεL的mRNA都来源于εRNA转录本的可选剪接。CεmX的氨基酸和核苷酸序列在整个蛋白和DNA数据库中是唯一的。因此，CεmX为靶向mIgE和表达mIgE的B细胞提供了特有的抗原位点。

[0006] Chang的研究组以前报道了所开发的数种CεmX特异性小鼠单克隆抗体，包括a20在内，这些抗体能与含有CεmX片段的重组蛋白和SKO-007细胞系的细胞结合，并且能与CHO细胞系的细胞结合，所述SKO-007细胞系是表达人mIgE的人骨髓瘤来源的细胞系，所述CHO细胞系用对应于mεL的CH2结构域至细胞质末端的片段(mεL(CH2-CM)；CM：细胞质)的基因转染。单克隆抗体a20及其所有早期开发的抗体均被发现与位于52a.a.CεmX结构域C末端的8-a.a.肽区域、RADWPGPP(SEQ ID NO：1)、残基#45-52结合。

[0007] 发明概述

[0008] 本发明涉及对人mIgE的CεmX结构域具有特异性并能与人B淋巴细胞上的mIgE结合的抗体的开发和鉴定。本发明还涉及这些抗体在治疗由IgE介导的过敏性疾病和其他疾病中的应用。

[0009] 在研究由Chang的研究组开发的抗CεmX单克隆抗体a20的过程中，发现a20与mεL(CH2-CM)基因所转染的细胞系的结合较好，所述细胞系，例如CHO细胞系或NS0细胞系，不表达Igα(CD79a)、Igβ(CD79b)、CD21、CD19、CD81和其他与B细胞受体(BCR)相关的蛋白。然而，发现a20与mεL(CH2-CM)基因所转染的表达Igα、Igβ和其他BCR相关蛋白的细胞系结合不良，例如Ramos细胞系。我们设想，a20所识别的位于CεmX上的抗原表位可能被某些BCR相关蛋白封闭。因此，a20单克隆抗体及其嵌合或人源化版本不适于在体内用于人类患者中，用于靶向表达mIgE的B淋巴母细胞和记忆细胞的目的。

[0010] 如果肽表位RADWPGPP(SEQ ID NO：1)是用于诱导抗体应答的唯一表位，那么利用以含人CεmX的蛋白所免疫的小鼠由杂交瘤方法产生的单克隆抗体，对该肽区域都将是特异性的。然而，如果该表位是优势表位，但不是唯一的免疫原性表位，那么仍可开发对CεmX上其他抗原表位具有特异性的单克隆抗体。可能在CεmX上存在不能由BCR相关蛋白封闭的表位，用于抗体结合。如果是这样，还可以开发与B细胞上的IgE结合并且可用于靶向这些B细胞的抗体。

[0011] 在以下的实施例中，我们成功地表明，尽管RADWPGPP(SEQ ID NO：1)是优势表位，但是其不是CεmX上唯一的免疫原性和抗原表位。此外，我们发现了单克隆抗体、4B12和26H2，其与不在RADWPGPP(SEQ ID NO：1)区域内的抗原表位上的CεmX结合。那些单克隆抗体在结合CεmX中不与a20抗体竞争。它们与B细胞上mIgE的结合比a20更牢固，并且在导致表达mIgE的细胞的抗体依赖性细胞溶解和凋亡中比a20更有效。

[0012] 实施例表明，诸如4B12和26H2的单克隆抗体能与人B淋巴细胞上的mIgE结合，并且适合用于靶向表达mIgE的B淋巴母细胞和记忆B细胞，用于下调IgE合成。嵌合或人源化形式的抗体适于用在受IgE介导的过敏性疾病所影响的患者中，所述过敏性疾病例如过敏性哮喘、过敏性鼻炎和特应性皮炎。由于已证实抗IgE对IgE的中和可有效治疗寒冷诱发的荨麻疹、慢性荨麻疹、胆碱能性荨麻疹、慢性鼻窦炎、系统性肥大细胞增生症、皮肤肥大细胞增生症、过敏性支气管肺曲霉病、复发性先天血管性水肿和间质性膀胱炎或嗜酸性粒细胞相关的胃肠病症，因此也可以利用诸如4B12和26H2的抗体治疗这些各种疾病。

[0013] 实施例还提出4B12和26H2所识别的肽在诱导针对CεmX和因而针对表达mIgE的B细胞的免疫应答中的潜在应用。具有相似的抗原特性即具有与抗CεmX抗体的结合活性的肽及其类似物，例如4B12和26H2，可以单独使用或与分子构建体联合使用，所述分子构建体还含有能诱导T细胞辅助的部分。这类构建体能诱导针对表达mIgE的B细胞的活性免疫，并因此实现下调总IgE合成的作用。

[0014] 本公开的一方面涉及CεmX特异性抗体，其能与B淋巴细胞上的膜结合IgE结合，但是不能与RADWPGPP肽(SEQ ID NO：1)结合。在一实例中，此类CεmX特异性抗体可以是小鼠单克隆抗体。在另一实例中，所述抗体是包含小鼠单克隆抗体的可变区和人抗体的恒定区的嵌合抗体。可选择地，所述抗体是基本包含小鼠单克隆抗体的高变区和人抗体的框架区和恒定区的人源化单克隆抗体。在另一实例中，所述抗体是人抗体。

[0015] 本公开的另一方面涉及所述CεmX特异性抗体的片段，其能与B淋巴细胞上的膜结合IgE结合，但是不能与RADWPGPP肽(SEQ ID NO：1)结合。此类抗体片段可以是Fab、F(ab′)2或单链Fv。

[0016] 在另一方面，本公开提供了利用本文所述的任一种抗体来治疗IgE介导的疾病的方法，所述IgE介导的疾病可以是过敏性哮喘、过敏性鼻炎或特应性皮炎。在一些实施方案中，所述IgE介导的疾病是寒冷诱发的荨麻疹、慢性荨麻疹、胆碱能性荨麻疹、慢性鼻窦炎、系统性肥大细胞增生症、皮肤肥大细胞增生症、过敏性支气管肺曲霉病、复发性先天血管性水肿和间质性膀胱炎或嗜酸性粒细胞相关的肠胃病症。

[0017] 在一些实施方案中，本文所述的抗体能与GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO：2)或具有相似抗原特性的类似物结合。在其它实施方案中，本文所述的抗体能与HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR(SEQ ID NO：3)或具有相似抗原特性的类似物结合。

[0018] 还在本公开范围内的是(i)利用免疫原在患者体内诱导免疫应答的治疗方法，所述免疫原含有GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO：2)或具有相似抗原特性的类似物，(ii)利用免疫原在患者体内诱导免疫应答的治疗方法，所述免疫原含有HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR(SEQ ID NO：3)或具有相似抗原特性的类似物，以及(iii)利用免疫原在患者体内诱导免疫应答的治疗方法，所述免疫原含有GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO：2)或具有相似抗原特性的类似物以及HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR(SEQ ID NO：3)或具有相似抗原特性的类似物。实施例

[0019] 实施例1：与RADWPGPP(SEQ ID NO：1)之外的抗原位点结合的新的抗CεmX单克隆抗体。

[0020] 为了诱导抗CεmX免疫应答，用50μg溶解的n-十一烷基-β-d-麦芽吡喃糖苷(UDM；Anatrace)mIgE.FcL重组蛋白按照厂商的意见以两周的间隔皮下免疫BALB/c小鼠两次，所述mIgE.FcL重组蛋白在TiterMax Gold佐剂(Sigma-Aldrich)中乳化。我们避免超免疫方案，以便小鼠不会仅产生针对优势RADWPGPP表位的抗体。用0.1mgUDM溶解的mIgE.FcL重组蛋白在没有佐剂的情况下腹膜内进行最后一次加强。融合前一天，将NS0细胞以5
5×10 个细胞/ml的细胞密度重新接种于新鲜的DMEM培养基(Invitrogen)中，所述DMEM培养基补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS；Invitrogen)和1％青霉素-链霉素混合物(100×Pen-Strep溶液；Invitrogen)。最后一次加强3天后，收集来自2只免疫小鼠的脾
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细胞，并用无血清DMEM培养基洗涤两次。收集5×10 个NS0细胞，并用无血清DMEM培养基洗涤两次。洗涤后，在用移液管吸头轻轻地不断搅动细胞的同时，通过在1分钟内添加1ml预热的50％聚乙烯丙三醇1500(PEG1500，Roche Applied Science)使脾细胞与NS0细胞融合，再次搅动细胞持续1分钟，在2分钟内添加2ml预热的无血清DMEM，并最后在2分钟内添加8ml无血清DMEM。以200×g离心10分钟之后，用600ml HAT培养基[DMEM培养基补充有2％次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷混合物(50×HAT溶液；Invitrogen)、10％BM-Condimed H1(Roche Applied Science)、10％热灭活FBS和1％青霉素-链霉素混合物]重悬浮融合的细胞，并以200μl/孔分布在30个96孔培养板中。第3天时，向每孔添加100μlHAT培养基。在第7天和第10天时，通过吸去每孔一半体积的培养基，并用HAT培养基替换来更新培养基。在第14天时，利用杂交瘤上清液通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来筛查与UDM溶解的mIgE.FcL或mIgE.FcS蛋白结合的抗CεmX mAb。

[0021] 为了利用ELISA筛查分泌抗CεmX mAb的杂交瘤，用纯化UDM溶解的mIgE.FcL或mIgE.FcS蛋白在0.1M NaCO3(pH9.6)中以50ng/孔于4℃下过夜包被96孔MaxiSorp板(Nunc)。将包被的孔用PB S中1％BSA以200μl/孔室温封闭1小时。用含0.05％Tween-20的PBS以200μl/孔将板洗涤三次，随后将100μl杂交瘤上清液添加至孔中。于室温孵育2小时。抽吸所有的孔，并用含0.05％Tween-20的PBS以200μl/孔将板洗涤六次。将板与HRP偶联的山羊抗鼠IgG抗体(Chemicon)的1∶10,000稀释液一起孵育1小时(100μl/孔)。然后抽吸所有的孔，并用含0.05％Tween-20的PBS以200μl/孔将板洗涤六次。最后，通过50μl/孔的四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(SureBlueTM，KPL)使孔显影，并通过以50μl/孔添加1N HCl来终止反应。在酶标仪上检测OD450处的吸光度。如通过ELISA所测定的，从两次融合所筛查的＞4000个杂交瘤克隆中，17个克隆表现出对UDM溶解的mIgE.FcL而不是mIgE.FcS的特异性。

[0022] 为了研究抗CεmX mAb对CεmX的特异性，然后检测多种CεmX特异性克隆与3种合成肽的反应性，这3种合成肽代表CεmX由位于残基#18处的C残基和位于残基#39-41处的CHC片段而分开的3个连续片段。具体而言，P1肽含有mε的CH4的最后4个氨基酸残基和CεmX的前17个氨基酸残基(#1-17)，即GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO：2)；P2肽含有CεmX的20个氨基酸残基#19-38，即HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR(SEQ ID NO：3)；P3肽含有CεmX的末端11个氨基酸残基(#42-52)，即GAGRADWPGPP(SEQ ID NO：4)和连续migis区域的前4个氨基酸残基，即mε链的膜锚定肽的N末端细胞外区域。所有的肽均在中央研究院基因组研究中心(台湾台北)(Genomics Research Cneter，Academia Sinica(Taipei，Taiwan))合成。用浓度为10mg/ml的PBS使肽复水。用所有肽在0.1M NaCO3(pH9.6)中以500ng/孔在4℃下过夜包被96孔MaxiSorp板。将包被的孔用PBS中1％BSA以200μl/孔室温封闭1小时。用含0.05％Tween-20的PBS以200μl/孔将板洗涤三次，随后将
100μl1μg/ml的抗CεmX mAb添加至孔中。于室温孵育2小时。抽吸所有的孔，并用含
0.05％Tween-20的PBS以200μl/孔将板洗涤六次。将板与HRP偶联的山羊抗鼠IgG抗体(Chemicon)的1∶10,000稀释液一起孵育1小时(100μl/孔)。用含0.05％Tween-20的PBS以200μl/孔将板洗涤六次之后，将50μl/孔的TMB底物溶液添加入孔中。通过以
50μl/孔添加1N HCl来终止反应。在酶标仪上检测OD450处的吸光度。在我们的实验中所制备的许多CεmX特异性单克隆抗体中，只有4B12和26H2不与含RADWPGPP的P3肽结合。
4B12与P1肽反应，26H2与P2肽反应。所有其他的CεmX特异性单克隆抗体均与P3反应(图1)。因此，毫无疑问，RADWPGPP(SEQ ID NO：1)是优势免疫原性表位。但是它不是唯一的免疫原性表位。

[0023] 实施例2：4B12和26H2与表达mIgE的B细胞上的mIgE结合

[0024] 我们进一步检测多种εmX特异性单克隆抗体与用编码mεL(CH2-CM)或mεS(CH2-CM)的重组DNA所转染的CHO和Ramos细胞系的结合能力。两个转染的CHO细胞系分别产生mIgE.FcL或mIgE.FcS，mIgE.FcL或mIgE.FcS两者都不能与诸如Igα和Igβ的辅助受体(coreceptor)形成完整的B细胞受体，因为所述CHO细胞不表达那些蛋白。转染的两个Ramos细胞系分别产生mIgE.FcL或mIgE.FcS，mIgE.FcL或mIgE.FcS两者都能与其天然辅助受体形成复合物。为了研究抗CεmX mAb与天然CεmX的结合，将表达mIgE.FcL或mIgE.7
FcS的CHO或Ramos细胞以10 个细胞/ml的细胞密度重悬浮于FACS缓冲液[PBS、1％FBS、
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0.1％叠氮化钠和2mMEDTA(pH8.0)]中。然后将10 个细胞与100μl杂交瘤上清液在冰上孵育30分钟，随后用FACS缓冲液洗涤。通过与对鼠IgG具有特异性的FITC标记的兔F(ab’)2片段在(AbD Secrotec)冰上孵育30分钟来检测结合抗体，随后在分析之前用FACS缓冲液洗涤两次。用FACSCanto II流式细胞仪(BD Bioscience)进行流式细胞术实验，并用FCSExpress软件(De Novo Software)进行分析。发现所有CεmX特异性单克隆抗体均不与表达mIgE.FcS的CHO和Ramos细胞结合。发现所有CεmX特异性单克隆抗体均与表达mIgEL的CHO细胞结合。然而，只有4B12和26H2能与表达mIgE.FcL的Ramos细胞结合，而所有其他CεmX特异性单克隆抗体都不能与表达mIgE.FcL的Ramos细胞结合(图2)。

[0025] 实施例3：4B12和26H2针对表达mIgE的B细胞诱导抗体依赖性细胞毒性[0026] 为了研究嵌合抗CεmX mAb的ADCC活性，我们使用外周血单核细胞(PBMC)作为靶向表达mIgE.FcL的Ramos细胞的效应细胞。通过在Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare)密度梯度上离心从健康供体(Taiwan Blood Service Foundation)的淡黄色层(buffy coat)TM纯化PBMC，并冷冻保存在90％FBS/10％DMSO(Hybri-Max ；Sigma-Aldrich)中。使用之前，
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使PBMC解冻，并以2×10 个细胞/ml在补充有10％热灭活的FBS和1％青霉素-链霉素混合物的IMDM培养基(Invitrogen)中过夜培养。为了识别与PBMC共培养的靶细胞，用含
2.5μM5-(和-6)-羧基荧光素二乙酸酯，琥珀酰亚胺酯(CFDA，SE；Invitrogen)在0.1％BSA/PBS中于37℃下将表达mIgE.FcL的Ramos细胞标记10分钟。在用含10％FBS的冷
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RPMI培养基(Invitrogen)洗涤三次之后，将细胞调至10 个细胞/ml。对于效应物-靶标(E/T)比滴定，将于200μl完全RPMI培养基中的20,000个标记的细胞用1μg/ml的抗体在37℃下包被30分钟，然后以50-3.125的多个E/T比与等体积的PBMC混合。对于抗体滴定，将于200μl完全RPMI培养基中的20,000个标记的细胞用多种浓度(1000～0.01ng/ml)的抗体在37℃下调理30分钟，然后以25∶1的E/T比与PBMC混合。为了测定抗体非依赖性杀伤，还将标记的靶细胞在不存在抗体的条件下以给定的E/T比与PBMC一起孵育。
在24小时的孵育结束时，用2.5μg/ml的7-氨基放线菌素(7-AAD；Invitrogen)在冰上对死细胞染色15分钟。在Becton Dickinson FACSCanto II流式细胞仪上分析细胞。将活的靶细胞定义为斑点印迹分析上CFSE-阳性/7-AAD-阴性细胞的百分比。按照以下公式计算给定E/T比时的杀伤细胞的百分比：100×[(抗体非依赖性对照中活靶细胞的％-样品中活靶细胞的％)/抗体非依赖性对照中活靶细胞的％]。在多个E/T比时观察到c4B12、c26H2和奥马珠单抗的ADCC活性。在E/T比为50时，c4B12、c26H2和奥马珠单抗给出高达
60％的特异性裂解；相反，ca20的活性较低，仅给出10～20％的特异性裂解(图3A)。而且，当c4B12和c26H2的浓度高于0.01μg/ml时，观察到显著的ADCC。在10μg/ml的最大剂量时，c4B12和c26H2对靶细胞的特异性裂解范围为80％-90％，而ca20给出高达50％的特异性裂解(图3B)。针对CD20的阳性对照利妥昔单抗和奥马珠单抗在多个E/T比时，以剂量响应的方式有效诱导ADCC。因此，我们推定，在介导ADCC中，c4B12和c26H2相对于ca20是更有效的抗CεmX mAb，并且c4B12和c26H2能有效地招募效应细胞，以在体内靶向表达mIgE的B细胞。

[0027] 实施例4：嵌合抗CεmX mAb诱导表达膜结合IgE.FcL的Ramos细胞的凋亡[0028] 为了检测磷脂酰丝氨酸(PS)暴露，在完全培养基中，将表达mIgE.FcL的Ramos细5
胞(5×10 个细胞/ml)与指定浓度的嵌合抗CεmX mAb、奥马珠单抗或对照抗体在37℃下一起孵育1小时。然后用对人IgG Fc片段具有特异性的山羊F(ab’)2片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.)以10μg/ml的浓度处理细胞，并于37℃下再孵育
24小时。通过在室温下黑暗中于200μl膜联蛋白缓冲液(Annexin buffer)[10mM HEPES/NaOH(pH7.4)、140mM NaCl、5mM CaCl2]中对细胞染色15分钟，评价磷脂酰丝氨酸(PS)暴露的检测，所述膜联蛋白缓冲液含有以1/200稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的膜联蛋白V(BioVision)和2.5μg/ml的碘化丙啶(PI，Sigma-Aldrich)。在FACSCanto II流式细胞仪上分析细胞。将凋亡的细胞定义为斑点印迹分析上膜联蛋白V-阳性/PI-阴性细胞的百分比。随着c4B12、c26H2或奥马珠单抗浓度的增加，大约80％表达mIgE.FcL的Ramos细胞通过凋亡而死亡，同时在1μg/ml时具有最大诱导，但ca20不是这样(图4A)。

[0029] 为了检测凋亡的细胞核，将表达mIgE.FcL的Ramos细胞(5×105个细胞/ml)与1μg/ml浓度的嵌合抗CεmX mAb、奥马珠单抗或对照抗体在完全培养基中在37℃下一起孵育1小时。然后用对人IgG Fc片段具有特异性的山羊F(ab’)2片段以10μg/ml的终浓
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度处理细胞，并于37℃下再孵育48小时。将5×10 个细胞在冰上黑暗中于0.5ml的碘化丙啶(PI)/Triton溶液(含0.1％柠檬酸钠、0.1％Triton X-100、15μg/ml PI和100μg/ml RNase A的PBS；所有的都来自Sigma-Aldrich)中孵育1小时。在FACSCanto II流式细胞仪上测定PI荧光。将完整细胞核中的DNA含量记录在线性标尺上。将在通道中发出的荧光低于G0/G1峰的含有亚二倍体DNA的凋亡细胞核计算成总群体的百分比。在c4B12、c26H2或奥马珠单抗所处理的表达mIgE.FcL的Ramos细胞中，观察到具有亚二倍体DNA的细胞群显著增加(图4B)。

[0030] 为了检测半胱天冬酶3(caspase3)和聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)切割，在完全5
培养基中，将表达mIgE.FcL的Ramos细胞(5×10 个细胞/ml)与浓度为1μg/ml的嵌合抗CεmX mAb、奥马珠单抗或对照抗体在37℃下一起孵育1小时。然后用对人IgG Fc片段具有特异的山羊F(ab’)2片段以10μg/ml的终浓度处理细胞，并于37℃下再孵育24小时。
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用冰冷的PBS洗涤5×10 个细胞，并重悬浮于100μl冰冷的改良RIPA裂解缓冲液[20mM Tris(pH7.4)、150mM NaCl、1％Triton-X100、0.5％脱氧胆酸、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)、
5mM EDTA和蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)]中。将裂解物于冰上孵育20分钟。将样品在4℃下以16000×g离心20分钟。将上清液转移到新的1.5ml管中，并储存于-80℃。用DC蛋白测定(Bio-Rad Laboratories)按照厂商的建议对每个澄清裂解物中的蛋白量进行定量。将每个样品的总蛋白含量进行标准化，并进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移到PVDF膜(GE Healthcare)上。从Cell Signaling Techonology获得半胱天冬酶3和PARP的兔多克隆抗体，并以1∶500稀释使用。HRP偶联的山羊抗兔IgG二抗(Sigma-Aldrich)以1∶10,000稀释使用。用ECL试剂(ImmobilonTM Westem；Millipore)对膜进行显影。通过用β肌动蛋白的抗体(Sigma-Aldrich)探测印迹来核实加载了等量的蛋白。在用c4B12、c26H2和奥马珠单抗而不是ca20处理表达mIgE.FcL的Ramos细胞24小时以后，半胱天冬酶3明显切割成Mr19-和17-kDa的片段。此外，在c4B12-、c26H2-和奥马珠单抗处理的表达mIgE.FcL的Ramos细胞中，利用识别Mr116kDa的完整PARP和Mr89kDa的切割产物的抗体可检测到PARP的切割(图4C)。

[0031] 附图简要说明

[0032] 图1显示代表CεmX的连续片段的3个合成肽，及多种抗CεmX mAb与这些肽的反应。以粗体显示CεmX结构域的氨基酸残基，CH4-migis：SEQ ID NO：11；Pl：SEQ ID NO：12；P2：SEQ ID NO：3；P4：SEQ ID NO：13。

[0033] 图2显示多种抗CεmX mAb与表达mIgE.FcL或mIgE.FcS的CHO或Ramos细胞系的结合。

[0034] 图3A显示嵌合c4B12和c26H2以多个E/T比诱导针对表达mIgE.FcL的Ramos细胞诱导的ADCC。图3B显示嵌合c4B12和c26H2以剂量响应的方式诱导针对表达mIgE.FcL的Ramos细胞的ADCC。

[0035] 图4A显示嵌合c4B12和c26H2在表达mIgE.FcL的Ramos细胞中所诱导的PS暴露是剂量依赖性的。图4B显示在嵌合c4B12和c26H2所处理的表达mIgE.FcL的Ramos细胞中观察到凋亡的细胞核。图4C显示在嵌合c4B12和c26H2所处理的表达mIgE.FcL的Ramos细胞中观察到半胱天冬酶3和PARP的切割。

[0036] 图5显示亲本小鼠4B12的VL和VH、VL和VH的各自所选的人生殖系模板KV2和HV4以及人源化4B12(hu4B12)的氨基酸序列比对，人源化4B12(hu4B12)在比对中被标记为“Replace(取代)”。该hu4B12与嵌合4B12(c4B12)对CεmX重组蛋白和表达mIgE.FcL的Ramos细胞具有相同的结合亲和力，4B12轻链：SEQ ID NO：5；4B12重链：SEQ ID NO：8；KV2轻链：SEQ ID NO：6；HV4重链：SEQ ID NO：9；Hu4B12(取代)轻链：SEQ ID NO：7；Hu4B12(取代)重链：SEQ ID NO：10。

[0037] 所引用的参考文献

[0038] 相关的专利文件

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[0040] US5,254,671 10/1993 Chang

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[0042] US5,274,075 12/1993 Chang

[0043] US5,292,867 3/1994 Chang

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[0046] 其他参考文献

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