壳聚糖微球作为基因疫苗载体的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种壳聚糖的制备方法，以及作为基因疫苗载体在提高基因疫苗免疫原性方面的应用。本发明通过BALB/c动物免疫实验证实了壳聚糖微球可以作为基因疫苗载体。1.壳聚糖(chitosan)可以通过静电、疏水相互作用、氢键与核酸疫苗作用，浓缩核酸疫苗成为致密状态，减少其体内降解。2.免疫注射后，金颗粒可以作为免疫细胞，特别是抗原提呈细胞(APCs)的粒子引诱剂；壳聚糖本身也有免疫加强的作用。本发明的壳聚糖微球具有良好的分散性和稳定性，无任何的毒性，可用于预防性和治疗性疫苗。

权利要求

1.一种壳聚糖纳米微粒的制备方法，该微粒可作为在实验动物包括人身上增强核酸疫苗免疫应答的非病毒载体。其特征在于：-4

50mL 1.0×10 g/ml氯金酸(HAuCl4)水溶液剧烈搅拌下加入不同浓度(0.01％-0.5％w/v)的壳聚糖乙酸溶液，冰浴条件下快速加入适量的硼氰化钠，继续搅拌30分钟。

2.权利要求1所述壳聚糖纳米微粒作为增强核酸疫苗免疫应答的非病毒载体的应用，其特征在于形成壳聚糖/疫苗微球。

3.权利要求2所述壳聚糖/疫苗微球的制备方法：

壳聚糖/疫苗微球的制备是壳聚糖和DNA共凝聚的过程。壳聚糖的阳离子特性是其必要条件。具体操作是在固定的体系里(1×TAE)，固定DNA疫苗的质量，改变壳聚糖的质量，分析不同N/P(0.1～1.0～10.0)下凝胶电泳的结果来筛选最好的(金-壳聚糖/DNA)比例。硫酸钠作为去溶剂化试剂(5mM-50mM)进入这个体系，稳定形成的壳聚糖/疫苗微球。

4.在权利要求2中的核酸疫苗，是编码病原体抗原基因的DNA和/或RNA。

5.权利要求4中的抗原，可以选自但不限于如下病原体：人免疫缺陷病毒、水痘带状疱疹病毒、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、登革病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或戊型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、人乳头瘤病毒、流感病毒、脑膜炎病毒、沙门氏菌属(Salmonella)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、疏螺旋体属(Borrelia)、衣原体属(Chlamydia)、博德特氏菌属(Bordetella)、链球菌属(Streptococcus)、支原体属(Mycoplasma)、分枝杆菌属(Mycobateria)、嗜血菌属(Haemophilus)、疟原虫属(Plasmodium)或弓形虫属(Toxoplasma)或者肿瘤相关抗原。

6.将权利要求2中的壳聚糖-疫苗微球用乙酸缓冲溶液悬浮，调节成1-100ng/ul的微球悬液，即可得应用剂型。

7.在权利要求6中的应用剂型可用于肌肉注射，腹腔注射，皮下注射，皮内注射。

8.在权利要求6中的应用剂型可用于粘膜给药和口服给药。

9.权利要求6中的微球悬液可用于哺乳动物包括人的预防性基因疫苗。

10.结合权利要求6中的微球悬液可用于哺乳动物包括人的治疗性基因疫苗。

说明书

壳聚糖微球作为基因疫苗载体的制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术免疫制剂领域，涉及疫苗的载体系统及制备方法和应用，特别涉及利用壳聚糖微球作为基因疫苗载体，诱导快速并且强烈的体液和细胞免疫应答，用于传染性疾病的预防和治疗。

背景技术

[0002] 基因疫苗既可诱导体液免疫，又可诱导细胞免疫，被称为疫苗的第三次革命。基因疫苗目前已被用来在临床前使用的多种病毒、细菌和寄生虫动物模型中激发保护性抗体和细胞介导的免疫应答，并且在防治癌症、变态反应和自身免疫性疾病方面进行了研究。然而，裸DNA在细胞内外及体内外不稳定，容易被核酸酶降解；其天生的负电荷限制了与负电荷的细胞膜接触而内在化。从而使得基因疫苗的免疫原性低下，需要高剂量的基因疫苗才能诱导足够的免疫应答。因此现在基因疫苗的瓶颈，就是载体问题。如何能够有效的将抗原基因基因释放到靶细胞内而又较少的产生副作用，即是要解决载体的效率、靶向性和安全性的问题。

[0003] 目前应用的基因疫苗载体主要为病毒载体和非病毒载体，在临床试验研究中，有三分之二采用病毒载体。病毒载体存在诸多缺陷，如具有免疫原性及细胞毒性、缺少组织特异性、对装载外源基因大小有限制、有潜在的致瘤性，以及在重组过程中可产生活性的病毒颗粒等。非病毒载体大部分为多聚阳离子聚合物和脂质体的衍生物，具有低毒、低免疫原性、外源基因整合几率低、无基因插入片断大小限制、使用简单、制备方便、便于保存和检验等优势。在许多不同的实验与治疗方面，表现出了多种潜在的优越性。

[0004] 在这些非病毒载体中，壳聚糖由于其良好的生物相容性、生物可降解性、无毒性和免疫原性，成为近年来研究的热点。而且壳聚糖的结构单元葡萄糖胺能够识别抗原提呈细胞表面的甘露糖受体，使之成为基因疫苗的良好载体。而金纳米颗粒，由于其制备简单，生物惰性，并且很容易修饰偶联功能分子，作为非病毒基因载体，展示了一个独特的技术平台。更重要的是，现在已有实验表明，金颗粒可以作为抗原提呈细胞的引诱剂，较少免疫反应的时间，提高免疫反应的效率。结合壳聚糖和金纳米颗粒的优势，壳聚糖微球极有可能成为一个迷人的基因疫苗非病毒载体。

[0005] 而且，这种壳聚糖微球由于其良好的粘膜黏附性能，还能通过粘膜和口服给药。除了避开对痛苦的注射需要和相关的因“针头恐惧”所致的对患者顺从的不利影响外，已有动物实验表明经粘膜给予抗原诱发保护性应答的效率更大。而且，粘膜是许多病原体进入的途径，因此粘膜接种是吸引人的。例如：鼻内接种，不仅可以在鼻粘膜中诱导粘膜免疫，而且在远端粘膜部位如生殖器粘膜中也诱导粘膜免疫(Mestecky，1987，Journal of clinical Immunology，7，265-276；McGhee，Infectious Agents and Disease，1993，2，55-73)。

[0006] 因此，本发明利用壳聚糖微球作为基因疫苗的载体，增强了基因疫苗的免疫原性。其原理在于：

[0007] 1.壳聚糖(chitosan)可以通过静电、疏水相互作用、氢键与核酸疫苗作用，浓缩核酸疫苗成为致密状态，减少其体内降解。

[0008] 2.免疫注射后，金颗粒可以作为免疫细胞，特别是抗原提呈细胞(APCs)的粒子引诱剂；壳聚糖本身也有免疫加强的作用。

[0009] 这种研究基因疫苗载体的新思路，到目前为止，在国际上仍旧是独一无二的。

发明内容

[0010] 本发明的目的是提供了一种用于预防性和治疗性基因疫苗的载体系统及其制备方法。

[0011] 本发明将基因疫苗和壳聚糖复合物免疫动物后，能够诱导强的体液和细胞免疫应答，并且缩短免疫应答的时间，能用于传染性疾病的预防和治疗。

[0012] 本发明的目的是提供了一种用于预防性和治疗性基因疫苗的载体系统及其制备方法及其应用：

[0013] 50mL 1.0×10-4g/ml氯金酸(HAuCl4)水溶液剧烈搅拌下加入不同浓度(0.01％-0.5％w/v)的壳聚糖乙酸溶液，冰浴条件下快速加入适量的硼氰化钠，继续搅拌30分钟。

[0014] 壳聚糖/疫苗微球的制备是壳聚糖和DNA共凝聚的过程。壳聚糖的阳离子特性是其必要条件。具体操作是在固定的体系里(1×TAE)，固定DNA疫苗的质量，改变壳聚糖的质量，分析不同N/P(0.1～1.0～10.0)下凝胶电泳的结果来筛选最好的(壳聚糖/DNA)比例。硫酸钠作为去溶剂化试剂(5mM-50mM)进入这个体系，稳定形成的壳聚糖/疫苗微球。

[0015] 经过BALB/c动物实验表明，该载体系统能够提高特异性抗体水平，更主要的是Th1型细胞因子的水平得到显著提高，并且在低抗原剂量的条件下显著增强细胞免疫应答(CTL)。

[0016] 该方法制备的壳聚糖，具有以下优点：

[0017] (i)通过改变壳聚糖的浓度，温度，搅拌速度和离子强度，可以得到粒径可控的壳聚糖纳米微粒。

[0018] (ii)高壳聚糖含量[≥0.1％w/w)]的金纳米球具有良好的稳定性，低壳聚糖含量的金纳米球易聚集。

[0019] (iii)在pH＝5.5乙酸缓冲溶液里，外观呈红色的均匀溶液。

[0020] (iv)单分散性好，表面电势较高，可以很好的结合并浓缩基因。

[0021] 壳聚糖/疫苗微粒具有以下特点：

[0022] (i)金颗粒在微球的外部排布，基因疫苗以浓缩的状态处于微球的内部。

[0023] (ii)在pH＝5.5乙酸缓冲溶液里，外观呈粉红色的悬浊液；粒径处于亚微米水平，且单分散性好。

[0024] (iii)表面电势底，细胞毒性小，适用于体内应用。

[0025] (iv)对抗原提呈细胞有天然的嗜性。

[0026] 壳聚糖微球作为基因疫苗载体，成分简单，制备方便，稳定，安全无毒。不仅适用于基因疫苗，也可以适用于传统的蛋白疫苗和减毒疫苗，因此通用性强。可望为传统疫苗、基因疫苗的研究与应用提供一种新型的免疫载体。

附图说明

[0027] 图1为本发明采用JEOL JEM-2010透射电子显微镜拍的壳聚糖纳米颗粒(0.1％壳聚糖)电镜照片。没有进行染色，是防止遮盖了小粒径的金纳米粒子的观察。纳米颗粒基本呈现球形的外观，大约在2-6nm左右。

[0028] 图2为壳聚糖(0.1％壳聚糖)-DNA微球的电镜照片。没有进行染色，是防止遮盖了小粒径的金纳米粒子的观察。壳聚糖-DNA微球粒径在200-300nm左右，呈现不规则的多边型结构。

[0029] 图3a为壳聚糖纳米颗粒(0.1％壳聚糖)的动态光散射的结果：在pH＝5.5的50mM乙酸缓冲溶液中显示了一个单峰的尺寸分布，范围在6～11nm，平均粒径9.2nm，符合高斯分布。图3b.c为壳聚糖纳米颗粒(0.1％壳聚糖)在4度冰箱里避光保存6个月和
12个月的动态光散射的结果，平均粒径略有增加，但是没有统计学上的意义，证明其稳定性好。

[0030] 图4壳聚糖纳米颗粒(0.1％壳聚糖)的表面Zeta电势的结果。在pH＝5.5的50mM乙酸缓冲溶液中，该纳米颗粒显示较高的表面电势(19.73±4.14mV)，能够很稳定的单分散存在，适合结合负电荷的基因疫苗或者蛋白疫苗。

[0031] 图5壳聚糖纳米颗粒(0.1％壳聚糖)对基因疫苗的体外结合实验。壳聚糖纳米颗粒对DNA的结合采用琼脂糖凝胶电泳进行分析。固定DNA的质量一定(100ng)，改变壳聚糖纳米颗粒/DNA的比例。当壳聚糖纳米颗粒/DNA(w/w)大于1∶1时，DNA完全阻滞于上样孔。

[0032] 图6壳聚糖纳米颗粒对基因疫苗的体外结合曲线。通过对电泳的结果进行计算机模拟分析，我们获得了一个S型的体外结合曲线。

[0033] 图7毒性试验结果。金颗粒没有明显的细胞毒性，因为其生物惰性。壳聚糖也没有明显的细胞毒性，它生物相容，生物可降解，已被用于很多药用途径。壳聚糖纳米颗粒显示了微弱的体外细胞毒性，其细胞毒性来源于其较高的表面电势可以和负电荷的细胞表面相互作用，从而导致细胞膜破裂，细胞内容物外泻，从而导致细胞死亡。和DNA结合后，这种微弱的毒性更是急剧降低，来源于其降低的表面电势，有利于体内应用。

[0034] 图8壳聚糖纳米颗粒的体外细胞瞬时转染的结果。通过对壳聚糖纳米颗粒的转染动力学进行分析，用LUC(荧光素酶)作为报告基因。可以得出壳聚糖纳米颗粒转染的优势：能够在抗原提呈细胞比如巨嗜细胞里有较高的基因表达。

[0035] 图9HIV-1特异性抗体分析。通过ELISA分析，壳聚糖纳米颗粒在三个不同的时间点，三个不同的剂量下，诱导抗体的能力都明显优于裸DNA直接注射组。壳聚糖纳米颗粒不但能够增强抗体的水平，而且能够在降低的疫苗剂量下诱导强的抗体反应。

[0036] 图10HIV-1特异性CTL分析。通过体外直接BALB/c P815细胞直接杀伤实验(LDH释放)，壳聚糖纳米颗粒在三个不同的剂量下，诱导CTL的能力都明显优于裸DNA直接注射组。壳聚糖纳米颗粒不但能够增强CTL的水平，而且能够在降低的疫苗剂量下诱导强的CTL反应。

[0037] 图11 HIV-1特异性IFN-γ分析。IFN-γ的特异性产生，能够间接的说明细胞免疫的情况。通过ELISPOT分析HIV-1特异性的IFN-γ分泌，壳聚糖纳米颗粒不但能够增强IFN-γ的水平，而且能够在降低的疫苗剂量下诱导强的IFN-γ特异性分泌。

具体实施方式

[0038] 下面结合实例对本发明进一步说明。

[0039] 实施例1

[0040] 壳聚糖纳米颗粒的制备

[0041] 50mL 1.0×10-4g/ml氯金酸(HAuCl4)水溶液剧烈搅拌下加入不同浓度(0.01％-0.5％w/v)的壳聚糖乙酸溶液，冰浴条件下快速加入适量的硼氰化钠，继续搅拌30分钟后，避光保存至4℃冰箱。

[0042] 实施例2

[0043] 壳聚糖纳米颗粒的表征

[0044] 利用快速滴加硼氰化钠的方法，可以确保金纳米晶快速成核，稳定生长，有利于减小纳米晶的尺寸分布。利用透射电镜(TEM)可观测纳米晶的形貌并确定其尺寸。图1是在pH＝5.5、离子强度I＝0.5M、壳聚糖浓度为0.1％(w/v)条件下合成的壳聚糖纳米颗粒的TEM照片。

[0045] 图3给出了相应的壳聚糖纳米颗粒的动态光散射DLS结果。与半年后以及一年后金溶胶的DLS结果对比可知，壳聚糖浓度为0.1％(w/w)条件下合成的壳聚糖纳米颗粒，其单分散性好，粒径分布符合高斯分布；稳定性也很好，4℃水溶液一年保存未见明显的聚集。

[0046] 图4给出了相应的壳聚糖纳米颗粒的表面Zeta电势的结果。表面电势呈高的正电荷，可以结合并浓缩基因疫苗。

[0047] 实施例3

[0048] 壳聚糖纳米颗粒的基因疫苗结合实验

[0049] 图5给出了壳聚糖纳米颗粒对基因疫苗的体外结合实验。当壳聚糖纳米颗粒/DNA(w/w)大于1∶1时，DNA完全阻滞于上样孔。通过对DNA进行电泳分析并用计算机模拟，可以得出壳聚糖纳米颗粒对基因疫苗的体外结合曲线，列于图6。壳聚糖/疫苗微球的制备是壳聚糖和DNA共凝聚的过程。壳聚糖的阳离子特性是其必要条件。图2为壳聚糖(0.1％壳聚糖)-DNA微球的电镜照片。

[0050] 实施例4

[0051] 壳聚糖纳米颗粒的体外毒性实验

[0052] 尽管壳聚糖被认为是安全的，金颗粒也被认为是生物惰性而对器官和组织没有细胞毒性。我们还是对壳聚糖纳米颗粒的体外细胞毒性进行说明。壳聚糖纳米颗粒在高剂量显示了微弱的细胞毒性(图7)，我们认为其来源于两个原因：一是其高的表面电势；二是乙酸缓冲溶液引入了乙酸相关的毒性。

[0053] 实施例5

[0054] 壳聚糖纳米颗粒的体外细胞瞬时转染

[0055] 图8给出了壳聚糖纳米颗粒的体外细胞瞬时转染的结果。我们用荧光素酶的质粒作为报告基因。壳聚糖纳米颗粒可以有效的介导外源基因转染细胞，特别是抗原提呈细胞。

[0056] 实施例6基因疫苗-壳聚糖复合物的免疫原性

[0057] (1)免疫动物

[0058] HIV-1基因疫苗-壳聚糖复合物用来免疫BALB/c鼠，设7个实验组(0.1μg，1μg，10μg和100μg裸DNA组和0.1μg，1μg和10μg基因疫苗-壳聚糖复合物组)和一个阴性对照组，每组5只。采用下肢肌肉单点注射法进行免疫。每两周免疫一次，共免疫4次，每次免疫后一周尾静脉取血，收集血清样本用ELISA检测抗-HIV-1抗体产生情况。并于最后一次免疫10天后脱臼处死老鼠，提取被免疫和对照鼠的淋巴细胞，分别用CTL、ELISPOT实验进行细胞免疫测定。

[0059] (2)体液免疫效果分析

[0060] 通过酶联免疫吸附实验(ELISA)测定HIV-1基因疫苗-壳聚糖复合物在动物体内所诱导的抗体水平。

[0061] 以HIV-1的gp蛋白包被96孔板，用间接ELISA法测量不同稀释度血清的OD值，通过OD值来分析抗体的滴度。

[0062] 从图9中我们可以看出，基因疫苗-壳聚糖复合物给药后，1μg基因疫苗四周后即有抗体产生；而100μg基因疫苗组六周以后才能检测到明显的抗体反应。图中还反映出10μg与1μg剂量组在免疫后抗体水平差别并不显著，这说明以1μg剂量免疫小鼠已足够饱和注射位点的肌肉。

[0063] (3)细胞免疫效果分析

[0064] 于最后一次免疫14天后脱臼处死老鼠，提取被免疫和对照鼠的淋巴细胞，分别用CTL、ELISPOT实验进行细胞免疫测定。

[0065] a.特异性CTL反应。

[0066] 检测基因疫苗免疫后的Balb/c小鼠在体内产生的与CD8+T淋巴细胞相关的特异性CTL反应。免疫后的小鼠脾细胞作为效应细胞，加入与Balb/C小鼠MHC-I类分子特异性结合的抗原决定簇共孵育的P815做为靶细胞；未加抗原决定簇刺激的P815作阴性对照。按一定比例混合上述脾细胞和靶细胞，测定靶细胞P815被裂解的比例，用来表征该疫苗在小鼠体内诱导的特异性CTL反应强度。结果如图10。以MHC-I类分子特异性结合的抗原决定簇共孵育的靶细胞P815被裂解的比例进行分析，可以得出结论，基因疫苗-壳聚糖复合物组(在任何计量下)与空白组相比产生了较强的特异性的CTL反应。

[0067] b.ELISPOT实验

[0068] ELISPOT实验中斑点的个数可以反应在抗原特异性短肽刺激时T细胞分泌IFN-γ的能力，而分泌IFN-γ的能力可以作为测量细胞免疫水平的指标。HIV-1基因疫苗免疫后小鼠淋巴细胞产生对HIV-1相关抗原的记忆。用gp蛋白中MHCclass-I抗原决定簇小肽刺激被免疫小鼠脾细胞，应使其分泌细胞因子(如INF-γ)，从而反映出疫苗诱导的与CD8+T淋巴细胞相关的，对HIV-1gp抗原的特异性细胞免疫反应。因此通过测定被免疫小鼠100万个脾细胞中能分泌INF-γ的淋巴细胞的数量，可以用于表示特异性细胞免疫反应强度。以免疫后的小鼠脾细胞为靶细胞，加入Balb/C小鼠MHC-I类分子特异性的短肽作为刺激剂，未加表位短肽作对照。显色后取膜扫描，显微镜下读取阳性细胞点数，结果如图11所示。可以看出，基因疫苗-壳聚糖复合物免疫小鼠后可以产生较强的细胞免疫，这与CTL结果相吻合。