一种用于生产WF11899A的发酵培养基

摘要

本发明公开了一种用于生产WF11899A的发酵培养基。所述发酵培养基含有碳源、有机氮源、无机盐、和金属离子。本发明还公开了一种在所述的发酵培养基中培养菌株Coleophoma sp.F-11899或其变体，获得WF11899A的方法。

权利要求

1.一种用于菌株Coleophoma sp.F-11899或其变体生产WF11899A的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基含有碳源、有机氮源、无机盐、和金属离子。

2.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述的碳源选自下述的一种或一种以上：葡萄糖、蔗糖、糊精、玉米淀粉、和可溶性淀粉。

3.如权利要求2所述的发酵培养基，其特征在于，所述的碳源是葡萄糖和可溶性淀粉。

4.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述的有机氮源选自下述的一种或一种以上：大豆蛋白胨、鱼粉蛋白胨、黄豆饼粉、棉籽蛋白粉、豆粕粉、和小麦胚芽粉。

5.如权利要求4所述的发酵培养基，其特征在于，所述的氮源选自下述的一种或一种以上：黄豆饼粉、棉籽蛋白粉、和小麦胚芽粉。

6.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述的无机盐选自下述的一种或一种以上：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、和磷酸氢二钠。

7.如权利要求6所述的发酵培养基，其特征在于，所述的无机盐是磷酸二氢钾、和/或磷酸二氢钠。

8.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，所述的金属离子是镁离子。

9.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，以培养基的总重量计，其中碳源的含量为1.0-10.0w/w％，氮源的含量为1.0-6.0w/w％，无机盐的含量为1.0-5.0w/w％。

10.一种WF11899A的制备方法，其特征在于，所述方法包括在如权利要求1-9任一所述的发酵培养基中培养菌株Coleophoma sp.F-11899或其变体，和从所述培养基分离WF11899A的步骤。

11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，发酵期间培养基pH4.0-6.0。

12.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，在发酵期间，温度为25-30℃。

13.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基是液体培养肉汤。

14.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述WF11899A的分离包括过滤、离心、浓缩、和结晶中的一种或一种以上。

15.一种如权利要求1-9任一所述的发酵培养基的用途，其特征在于，用于菌株Coleophoma sp.F-11899或其变体发酵培养生产WF11899A。

16.一种产品集，其特征在于，所述的产品集含有：

第一产品：菌株Coleophoma sp.F-11899或其变体；和第二产品：如权利要求1-9任一所述的发酵培养基。

17.一种用于生产WF11899A的发酵培养基，其特征在于，所述发酵培养基含有菌株Coleophoma sp.F-11899或其变体、碳源、有机氮源、无机盐、和金属离子。

18.如权利要求17所述的发酵培养基，其特征在于，所述的碳源是葡萄糖和可溶性淀粉。

19.如权利要求17所述的发酵培养基，其特征在于，所述的有机氮源选自下述的一种或一种以上：黄豆饼粉、棉籽蛋白粉、和小麦胚芽粉。

20.如权利要求17所述的发酵培养基，其特征在于，所述的无机盐是磷酸二氢钾、和/或磷酸二氢钠。

21.如权利要求17所述的发酵培养基，其特征在于，所述的金属离子是镁离子。

22.如权利要求17所述的发酵培养基，其特征在于，以培养基的总重量计，其中碳源的含量为1.0-10.0w/w％，氮源的含量为1.0-6.0w/w％，无机盐的含量为1.0-5.0w/w％。

说明书

一种用于生产WF11899A的发酵培养基

技术领域

[0001] 本发明涉及发酵工业，尤其涉及一种用于生产米卡芬净的发酵培养基。 背景技术

[0002] WF11899A(FR901379) 是 1994 年 从 腔 胞 纲 菌 Coelomyceres empetri F-11899(Coleophoma sp.F-11899，FERM BP-2635)的发酵培养液中分离得到的一种脂肽类物质，其分子式为C51H82N8O21S，经过结构修饰改造可以得到一种抗真菌抗生素米卡芬净(Micafungin，MFG，FK463)。WF11899A(FR901379)及FK463结构式如下：

[0003]

[0004]

[0005] 米卡芬净对大部分的念珠菌和曲霉菌都有活性，能够非竞争性抑制1，3-β-D葡聚糖合成酶的活性，从而抑制真菌细胞壁合成，由于哺乳动物细胞缺乏1，3-β-D葡聚糖合成酶，故该化合物对真菌细胞具有较高的特异性，能迅速杀灭真菌，而对人体正常细胞影响不大。

[0006] 米卡芬净由日本藤泽公司开发，于2002年12月在日本上市，商品名为Fungusrd，2005年3月通过美国FDA认证，目前仅被批准用于治疗食道念珠菌感染、骨髓移植及ADS患者中性粒细胞减少症的预防治疗。

[0007] USP5502033公布了利用真菌Coleophoma sp.F-11899发酵生产WF11899A的过程：从斜面培养基上取一环WF11899A的产生菌接种于含种子培养基(蔗糖4％，棉子粉2％，干酵母1％，蛋白胨1％，KH2PO4 0.2％，CaCO3 0.2％，Tween-800.1％，121℃灭菌30min，上述百分比均为重量百分比)的500ml摇瓶中，装量160ml，25℃振荡培养4天后，以1.6％的接种量接种于含20L发酵培养基(葡萄糖1％，小麦胚芽粉1％，棉子粉0.5％，KH2PO4 2％，Na2HPO4·12H2O 1.5％，ZnSO4·7H2O 0.001％，泡敌0.05％，121℃灭菌30min，上述百分比均为重量百分比)的30L发酵罐中，200rpm搅拌，通气量为20L/min，25℃培养96小时，HPLC检测效价为100mg/L。

[0008] EP0431350A1公布了利用真菌Coleophoma sp.F-11899发酵生产WF11899A的过程：从斜面培养基上取一环WF11899A的产生菌接种于含种子培养基(蔗糖4％，棉子粉2％，干酵母1％，蛋白胨1％，KH2PO4 0.2％，CaCO3 0.2％，Tween-800.1％，121℃灭菌30min，上述百分比均为重量百分比)的500ml摇瓶中，装量160ml，25℃振荡培养4天后，以1.6％的接种量接种于含20L发酵培养基(葡 萄糖1％，小麦胚芽粉1％，棉子粉0.5％，KH2PO4 2％，Na2HPO4·12H2O 1.5％，ZnSO4·7H2O 0.001％，泡敌0.05％，121℃灭菌30min，上述百分比均为重量百分比)的30L发酵罐中，200rpm搅拌，通气量为20L/min，25℃培养96小时，HPLC检测效价为100mg/L。

[0009] Munekazu Kanda et al.Journal of Bioscience and Bioengineering107，530-534，(2009)公布了利用一株高渗透性的Coleophoma sp.F-11899突变株M-7来发酵产生WF11899A的发酵培养基，产量可高达30U/ml。但是该培养基仅适用于此突变株，其余的菌株在此发酵培养基中WF11899A产量不高。

[0010] 因此，本领域需要提供一种新的产生WF11899A的发酵培养基。

发明内容

[0011] 本发明旨在提供一种用于生产WF11899A的发酵培养基。

[0012] 在本发明的第一方面，提供了一种用于菌株Coleophoma sp.F-11899或其变体生产WF11899A的发酵培养基，所述发酵培养基含有碳源、有机氮源、无机盐、和金属离子；较佳地，所述的发酵培养基含有菌株Coleophoma sp.F-11899或其变体、碳源、有机氮源、无机盐、和金属离子。

[0013] 在本发明提供的发酵培养基中，所述的碳源选自下述的一种或一种以上：葡萄糖、蔗糖、糊精、玉米淀粉、和可溶性淀粉；较佳地，所述的碳源是葡萄糖和可溶性淀粉。 [0014] 在本发明提供的发酵培养基中，所述的有机氮源选自下述的一种或一种以上：大豆蛋白胨、鱼粉蛋白胨、黄豆饼粉、棉籽蛋白粉、豆粕粉、和小麦胚芽粉；较佳地，所述的氮源选自下述的一种或一种以上：黄豆饼粉、棉籽蛋白粉、和小麦胚芽粉。

[0015] 在本发明提供的发酵培养基中，所述的无机盐选自下述的一种或一种以上：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、和磷酸氢二钠；较佳地，所述的无机盐是磷酸二氢钾、和/或磷酸二氢钠。

[0016] 在本发明提供的发酵培养基中，所述的金属离子是镁离子。

[0017] 在另一优选例中，在本发明提供的发酵培养基中，以培养基的总重量计，其中碳源的含量为1.0-10.0w/w％，氮源的含量为1.0-6.0w/w％，无机盐的含量为1.0-5.0w/w％。 [0018] 在本发明的第二方面，提供了一种WF11899A的制备方法，所述方法包括在如上所述的本发明提供的发酵培养基中培养菌株Coleophoma sp.F-11899或其变体，和从所述培养基分离WF11899A的步骤。

[0019] 在本发明提供的制备方法中，发酵期间培养基pH 4.0-6.0；在发酵期间，温度为25-30℃；所述发酵培养基是液体培养肉汤；所述WF11899A的分离包括过滤、离心、浓缩、和结晶中的一种或一种以上。

[0020] 在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的本发明提供的发酵培养基的用途，用于菌株Coleophoma sp.F-11899或其变体发酵培养生产WF11899A。

[0021] 在本发明的第四方面，提供了一种产品集，所述的产品集含有： [0022] 第一产品：菌株Coleophoma sp.F-11899或其变体；和

[0023] 第二产品：如上所述的本发明提供的发酵培养基。

[0024] 据此，本发明提供一种新的产生WF11899A的发酵培养基。

附图说明

[0025] 图1显示了不同碳源对WF11899A合成的影响。

[0026] 图2显示了不同有机氮源对WF11899A合成的影响。

具体实施方式

[0027] 发明人经过广泛而深入的研究，发现了一种用于培养Coleophoma empetriF-11899以生产WF11899A的培养基，采用本发明的发酵培养基生产WF11899A，培养基粘稠度合适，WF11899A产生菌及其突变株菌丝体不会生长过旺，或菌丝结球，发酵产物WF11899A的产率高，效价较文献报道的培养基提高了300％-400％，效价达到300-400mg/L。

[0028] 本发明提供的用于生产WF11899A的发酵培养基包含碳源、有机氮源、无机盐和金属离子。

[0029] 所述培养基中碳源为葡萄糖、木糖、半乳糖、右旋糖、甘油、蔗糖、淀粉、 糊精、麦芽糖、聚乙二醇、大豆油等；优选为葡萄糖、蔗糖、糊精、玉米淀粉、可溶性淀粉等，更佳地为葡萄糖和可溶性淀粉；以培养基的总重量计，其中碳源的含量为1.0％-10.0％，最优为7.0％。

[0030] 所述有机氮源为酵母抽提物、大豆蛋白胨、大豆粉、棉籽粉、玉米浆、小麦蛋白胨、鱼粉蛋白胨、玉米麸、豆粕粉、奶粉、麦芽等；优选为大豆蛋白胨、鱼粉蛋白胨、黄豆饼粉、棉籽蛋白粉、豆粕粉、小麦胚芽粉等，更佳地为黄豆饼粉、棉籽蛋白粉和小麦胚芽粉；以培养基的总重量计，其中有机氮源的含量为1.0％-6.0％，最优为4％。

[0031] 所述无机盐为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等，其中优选为磷酸二氢钾和磷酸二氢钠；以培养基的总重量计，其中磷酸盐的含量为0.4％-5.0％，最优为4.5％。

[0032] 所述发酵培养基中还需加入镁离子等金属离子。培养基中还可加入维生素、氨基酸等微量元素和天然油脂等。

[0033] 本发明提供的使用上述发酵培养基生产WF11899A的方法中采用的菌株为Coelomyceres empetri F-11899或其任一突变体/变体。所述突变体/变体包括天然的以及人工培养的突变体，后者通过采用常规的方法如辐照UV、X光、γ射线和用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲磺酸乙酯(EMS)、甲磺酸甲酯(MMS)等处理或进行遗传操作从已描述的生物获得。

[0034] 本发明提供的生产WF11899A的方法中，需氧发酵，如果需要，尤其是在培养基严重起泡时，可加入消泡剂，如液体石蜡、脂肪油、植物油、矿物油或硅氧烷。 [0035] 发酵过程中一般不需要搅拌，如果搅拌，一般控制转速为250rpm。 [0036] 发酵过程中，培养基的pH维持在4.0-6.0，温度在25-30℃，发酵时间为96-192小时。

[0037] 可采用常规的方法从发酵培养基中回收所获得的WF11899A，如采用高效液相色谱法(HPLC)。WF11899A发现存在于培养基和滤液中，并可从菌丝体和滤液中分离和纯化。 [0038] 从发酵培养基中分离WF11899A包括过滤、离心、浓缩、和结晶中的一种或一种以上的处理。可将获得的产物再结晶一次或多次，以获得较高的纯度。

[0039] 本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所 揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

[0040] 本发明的主要优点在于：

[0041] 1、本发明提供的用于生产WF11899A的发酵培养基粘稠度合适，WF11899A产生菌及其突变株菌丝体不会生长过旺，或菌丝结球。

[0042] 2、本发明提供的发酵产物WF11899A产率高。

[0043] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

[0044] 本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。

[0045] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

[0046] 本发明实施例中，采用菌株为Coelomyceres empetri F-11899，FERM-BP2635，由日本国家生物科学与人类科技研究所保藏。

[0047] 本发明实施例中，发酵培养方法及标准效价的制定：

[0048] 将Coleophoma empetri F-11899种子取出活化后接种斜面培养基(PDA培养基：去皮马铃薯煮沸30min，取滤液20％、葡萄糖2％、琼脂1.8％，余量为水，pH7.0，121℃灭菌30min)，将接种菌种的斜面置于28℃恒温培养箱中，培养6天，得到成熟的孢子，然后成熟的孢子接种于装有40ml种子培养基(蔗糖1％，棉籽蛋白粉2％，干酵母1％，鱼粉蛋白胨1％，KH2PO40.2％，CaCO30.2％，Tween-800.1％，余量为水，pH6.5，121℃灭菌30min)的
250ml摇瓶中，在28℃、250rpm摇床上培养4天，得到成熟的种子，得到的种子以1.6％的接种量接入装有40ml发酵培养基(玉米淀粉3％，葡萄糖1％，麸质粉0.5％，棉籽蛋白粉2％，小麦胚芽粉0.2％，Na2HPO4·12H2O 0.2％，KH2PO40.2％，ZnSO4·7H2O 0.001％，余量为水，pH5.5-6.5，121℃灭菌30min)的250ml摇瓶中，置于28℃、250rpm摇床继续培养168小时，取发酵液500μl，加入丙酮500μl，浸泡2小时，离心取上清用HPLC进行WF11899A含量的测定。

[0049] HPLC采用的色谱仪是Waters510型高效液相色谱仪，色谱柱是C18柱，4.6×250mm，5μm，检测波长220nm，流动相是乙腈∶0.5％磷酸二氢铵(45∶55)，流速是
1ml/min，进样量是20μl，柱温是30℃。

[0050] 相对效价计算公式为：相对效价＝(HPLC测定的改良培养基产物峰面积÷HPLC测定的原始培养基发酵产物的峰面积)×100％。

[0051] 以上实施例中所用的药品和试剂为：

[0052] 可溶性淀粉、KH2PO4、NaH2PO4·2H2O、MgSO4·7H2O、Tween-80：国药集团化学试剂有限公司；

[0053] 蔗糖：广西上上糖业有限公司；

[0054] CaCO3：上海森斐化学品有限公司；

[0055] 黄豆饼粉：山东枣庄市豆制品研究中心；

[0056] 玉米淀粉：上海诺泰化工有限公司；

[0057] 小麦胚芽粉：上海亿欣生物科技有限公司；

[0058] 葡萄糖：上海聚豪精细化工有限公司；

[0059] 棉籽蛋白粉：北京华康希望生物技术有限公司；

[0060] 琼脂粉：上海源聚生物科技有限公司。

[0061] 培养基中用到的组分及试剂均为化学纯。

[0062] 实施例1-5

[0063] 不同碳源对发酵产生WF11899A有较明显的影响

[0064] 分别使用葡萄糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、葡萄糖和玉米淀粉、葡萄糖和可溶性淀粉等五种碳源代替上述原始发酵培养基中的碳源，以培养基的总重量计，碳源的含量为7％，发酵终点用HPLC检测产物效价，结果如图1所示。

[0065] 结果表明，葡萄糖和可溶性淀粉的效果最佳。

[0066] 实施例6-12

[0067] 不同氮源对发酵产生WF11899A有很明显的影响

[0068] 分别使用鱼粉蛋白胨、大豆蛋白胨、棉籽蛋白粉、黄豆饼粉、玉米浆干粉、小麦胚芽粉、花生粕七种有机氮源代替上述原始发酵培养基中的有机氮源，以培养基的总重量计，有机氮源的含量为4％，发酵终点用HPLC检测产物效价，结果见图2。

[0069] 结果表明，棉籽蛋白粉、黄豆饼粉和小麦胚芽粉效果最好。

[0070] 实施例13-30

[0071] 发酵方法同上述，除其中的发酵培养基分别用下表中的培养基代替以外，其他条件相同。具体发酵培养基见表1。

[0072] 表1培养基的配方及相对效价

[0073]

[0074]

[0075] 实施例31

[0076] 一种产品，包括若干包装，包装1中是Coleophoma empetri F-11899种子，包装2中是葡萄糖，包装3中是可溶性淀粉，包装4中是棉籽蛋白粉，包装5中是黄豆饼粉，包装6中是小麦胚芽粉，包装7中是磷酸盐，包装8中是镁盐。

[0077] 使用该产品时，可根据本发明实施例中的最佳条件，将包装2和3中的葡萄糖、可溶性淀粉作为碳源，将包装4、5、或6中的棉籽蛋白粉、黄豆饼粉、或小麦胚芽粉作为氮源，再将包装7中的磷酸盐和包装8中的镁盐加入摇瓶中，然后接种包装1中的Coleophoma empetri F-11899种子进行发酵培养，生产WF11899A。

[0078] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。