一种发酵生产达托霉素的方法

摘要

本发明提供了一种发酵生产达托霉素的方法。该方法包括在发酵培养玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)的过程中，将无菌复合氨基酸水溶液补料到发酵液中。与未补加复合氨基酸的工艺相比，本发明使达托霉素发酵单位提高10％以上，产物杂质组分没有明显变化，同时，生产操作简单，对设备要求低，成本较低，适用于工业化生产。

权利要求

1.一种发酵生产达托霉素的方法，该方法包括：

1)将生产达托霉素的玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)在发酵培养基中发酵培养；

2)在步骤1)中的所述发酵培养进行20-40小时后，将无菌的复合氨基酸的水溶液添加到发酵液中，其中所述复合氨基酸包含构成达托霉素结构的氨基酸和/或其前体的混合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤2)中，将所述的复合氨基酸的水溶液以流加方式添加到所述发酵液中，其中所述复合氨基酸的水溶液的浓度为1.0g/L-18.0g/L，所述流加持续92小时至124小时，所述流加的速度为每升发酵液中每小时流加1.0ml-7.0ml所述复合氨基酸的水溶液。

3.根据权利要求2所述的方法，该方法还包括：

3)继续发酵培养16-28小时，然后停止发酵。

4.根据权利要求2所述的方法，所述流加的速度为每升发酵液中每小时流加2.4ml所述复合氨基酸的水溶液。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述复合氨基酸的组成和质量含量范围为：L-犬尿氨酸：11.73-12.85％；3-甲基谷氨酸：8.97-10.02％；D-丝氨酸：5.44-6.79％；

D-丙氨酸：5.68-6.63％；L-鸟氨酸：7.32-8.25％；甘氨酸：8.42-9.16％；L-苏氨酸：

6.73-7.19％；L-天冬氨酸：22.98-23.75％；L-天冬酰胺：7.34-8.08％；L-色氨酸：

11.82-12.32％。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述复合氨基酸的组成和质量含量为：L-犬尿氨酸：12.24％；3-甲基谷氨酸：9.53％；D-丝氨酸：6.18％；D-丙氨酸：5.23％；

L-鸟氨酸：7.77％；甘氨酸：8.82％；L-苏氨酸：7.00％；L-天冬氨酸：23.47％；L-天冬酰胺：7.76％；L-色氨酸：12.00％。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述的复合氨基酸的水溶液的浓度为1.0g/L-10.0g/L。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的复合氨基酸的水溶液的浓度为3.0g/L。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，使用工业复合氨基酸粗品作为所述复合氨基酸，该工业复合氨基酸粗品含有占其总质量41.05％-59.31％的下列氨基酸：天冬氨酸：6.28％-8.34％；苏氨酸：2.52％-3.48％；丝氨酸：4.05％-4.97％；

谷氨酸：7.19％-8.36％；甘氨酸：2.07％-3.12％；丙氨酸：2.19％-2.76％；半胱氨酸：0.29％-1.02％；缬氨酸：1.91％-2.73％；蛋氨酸：0.21％-0.74％；异亮氨酸：1.07％-1.92％；亮氨酸：2.19％-2.94％；酪氨酸：0.43％-1.27％；苯丙氨酸：1.06％-2.37％；赖氨酸：1.52％-2.73％；组氨酸：0.49％-1.64％；精氨酸：

4.06％-6.03％；脯氨酸：3.52％-4.89％。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述工业复合氨基酸粗品含有占其总质量

50.97％的下列氨基酸：

天冬氨酸：7.28％；苏氨酸：3.04％；丝氨酸：4.53％；谷氨酸：8.01％；甘氨酸：2.76％；

丙氨酸：2.54％；半胱氨酸0.79％；缬氨酸：2.63％；蛋氨酸：0.71％；异亮氨酸：1.72％；亮氨酸：2.43％；酪氨酸：0.52％；苯丙氨酸：1.35％；赖氨酸：1.98％；组氨酸：1.35％；精氨酸：5.32％；脯氨酸：4.01％。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述的复合氨基酸的水溶液的浓度为6.0g/L-18.0g/L。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的复合氨基酸的水溶液的浓度为11.0g/L。

说明书

一种发酵生产达托霉素的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物制药领域，涉及一种通过微生物发酵生产抗生素的方法。具体地说，本发明涉及一种发酵生产达托霉素的方法。

背景技术

[0002] 达托霉素(Daptomycin)是一种从玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)发酵液分离得到的环脂肽类抗生素，其化学结构如式(I)所示。从式(I)可以看出，达托霉素由13个氨基酸和1个长链脂肪酸组成，其中10个氨基酸组成一个氨基酸环，另有3个氨基酸排列成线状，并且在末端的L-色氨酸(L-Trp)上，连接1个正癸酸。

[0003]

[0004] 式(I)

[0005] 达托霉素不仅具有新颖的化学结构，其作用模式也与任何现有上市的抗生素不同：达托霉素能扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀菌的目的。达托霉素通过从多个方面破坏细菌细胞膜功能，能迅速杀死革兰氏阳性菌，并且使细菌很难对其产生耐药性(A.Raja et al.，Nature Rev.Drug Discov.，2003，2，943-944)。达托霉素除了能作用于大多数临床相关革兰氏阳性菌外，更重要的是，它在体外试验中还对甲氧西林、万古霉素和利奈唑烷等的耐药分离菌株呈现出强力的活性。

[0006] 达托霉素的合成方法有化学全合成、化学半合成和生物合成三种工艺，其中前二种由于工艺过程复杂且产率低尚无商业价值。目前，行业内生产达托霉素的常规方法主要是通过玫瑰孢链霉菌菌株发酵制得。

[0007] 到目前为止，还尚未有有关在补料过程中加入达托霉素氨基酸环的前体物质复合氨基酸的报道。

发明内容

[0008] 为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种发酵生产达托霉素的方法。

[0009] 具体而言，本发明提供：

[0010] (1)一种发酵生产达托霉素的方法，该方法包括：

[0011] 1)将生产达托霉素的玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)在发酵培养基中发酵培养；

[0012] 2)在步骤1)中的所述发酵培养进行20-40小时后，将无菌的复合氨基酸的水溶液添加到发酵液中，其中所述复合氨基酸包含构成达托霉素结构的氨基酸和/或其前体的混合物。

[0013] (2)根据(1)所述的方法，其中在步骤2)中，将所述的复合氨基酸的水溶液以流加方式添加到所述发酵液中，其中所述复合氨基酸的水溶液的浓度为1.0g/L-18.0g/L，所述流加持续92小时至124小时，所述流加的速度为每升发酵液中每小时流加1.0ml-7.0ml所述复合氨基酸的水溶液。

[0014] (3)根据(2)所述的方法，该方法还包括：

[0015] 3)继续发酵培养16-28小时，然后停止发酵。

[0016] (4)根据(2)所述的方法，所述流加的速度为每升发酵液中每小时流加2.4ml所述复合氨基酸的水溶液。

[0017] (5)根据(1)-(4)中任一项所述的方法，其中所述复合氨基酸的组成和质量含量范围为：

[0018] L-犬尿氨酸：11.73-12.85％；3-甲基谷氨酸：8.97-10.02％；D-丝氨酸：5.44-6.79％；D-丙氨酸：5.68-6.63％；L-鸟氨酸：7.32-8.25％；甘氨酸：8.42-9.16％；
L-苏氨酸：6.73-7.19％；L-天冬氨酸：22.98-23.75％；L-天冬酰胺：7.34-8.08％；L-色氨酸：11.82-12.32％。

[0019] (6)根据(5)所述的方法，其中所述复合氨基酸的组成和质量含量为：

[0020] L-犬尿氨酸：12.24％；3-甲基谷氨酸：9.53％；D-丝氨酸：6.18％；D-丙氨酸：5.23％；L-鸟氨酸：7.77％；甘氨酸：8.82％；L-苏氨酸：7.00％；L-天冬氨酸：23.47％；
L-天冬酰胺：7.76％；L-色氨酸：12.00％。

[0021] (7)根据(5)所述的方法，其中所述的复合氨基酸的水溶液的浓度为1.0g/L-10.0g/L。

[0022] (8)根据(7)所述的方法，其中所述的复合氨基酸的水溶液的浓度为3.0g/L。

[0023] (9)根据(1)-(4)中任一项所述的方法，其中，使用工业复合氨基酸粗品作为所述复合氨基酸，该工业复合氨基酸粗品含有占其总质量41.05％-59.31％的下列氨基酸：

[0024] 天冬氨酸：6.28％-8.34％；苏氨酸：2.52％-3.48％；丝氨酸：4.05％-4.97％；谷氨酸：7.19％-8.36％；甘氨酸：2.07％-3.12％；丙氨酸：2.19％-2.76％；半胱氨酸：0.29％-1.02％；缬氨酸：1.91％-2.73％；蛋氨酸：0.21％-0.74％；异亮氨酸：1.07％-1.92％；亮氨酸：2.19％-2.94％；酪氨酸：0.43％-1.27％；苯丙氨酸：1.06％-2.37％；赖氨酸：1.52％-2.73％；组氨酸：0.49％-1.64％；精氨酸：
4.06％-6.03％；脯氨酸：3.52％-4.89％。

[0025] (10)根据(9)所述的方法，其中所述工业复合氨基酸粗品含有占其总质量50.97％的下列氨基酸：

[0026] 天冬氨酸：7.28％；苏氨酸：3.04％；丝氨酸：4.53％；谷氨酸：8.01％；甘氨酸：2.76％；丙氨酸：2.54％；半胱氨酸0.79％；缬氨酸：2.63％；蛋氨酸：0.71％；异亮氨酸：
1.72％；亮氨酸：2.43％；酪氨酸：0.52％；苯丙氨酸：1.35％；赖氨酸：1.98％；组氨酸：
1.35％；精氨酸：5.32％；脯氨酸：4.01％。

[0027] (11)根据(9)所述的方法，其中所述的复合氨基酸的水溶液的浓度为6.0g/L-18.0g/L。

[0028] (12)根据(11)所述的方法，其中所述的复合氨基酸的水溶液的浓度为11.0g/L。

[0029] 本发明提供的方法能够在发酵培养玫瑰孢链霉菌生产达托霉素过程中补加构成达托霉素结构的氨基酸和/或其前体物质，该方法与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

[0030] (1)可提高发酵产量10％以上；(2)复合氨基酸在微生物生长过程中利用快、效率高，可以有效减少培养基中其他氮源的使用量；(3)复合氨基酸在微生物利用后残余杂质少，可以简化下游提取工艺；(4)工业复合氨基酸来源广泛，价格低廉，且工艺操作简单，不存在环境污染，适用于工业化生产。

[0031] 综上所述，本发明提供的在发酵生产达托霉素过程中的补料方法能较大幅度降低生产成本，具有工业化价值。

附图说明

[0032] 图1是发酵过程中未补加复合氨基酸条件下的发酵液HPLC图谱(比较例1)；

[0033] 图2是发酵过程中补加复合氨基酸(构成达托霉素结构的氨基酸的混合物)条件下的发酵液HPLC图谱(实施例1)。

具体实施方式

[0034] 以下通过具体实施方式的描述并结合附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

[0035] 在本文中“玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)”可以是任何能主要产生达托霉素的玫瑰孢链霉菌，例如：玫瑰孢链霉菌NRRL11379菌株(在美国农业研究菌种保藏中心保藏)。

[0036] 在本文中“流加”是指在发酵过程中连续补加某种基质。

[0037] 在本文中“发酵单位”是指发酵液中达托霉素的含量。

[0038] 在本文中“复合氨基酸”为构成达托霉素结构的氨基酸和/或其前体的混合物，具体而言，可以为构成达托霉素结构的氨基酸的混合物或工业复合氨基酸粗品。

[0039] 在本文中“工业复合氨基酸粗品”是指通过酶水解蛋白质获得的各种氨基酸混合水溶液经喷雾干燥加工而成，可购自四川恒润禾实业有限公司。

[0040] 本发明中，将生产达托霉素的玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)在发酵培养基中发酵培养。

[0041] 发酵培养前，先将孢子接入种子培养基，种子培养基通常含有植物蛋白肉汤、糊精等，在30℃左右培养一定时间后转入二级种子培养基；二级种子培养基通常含有黄豆粉、蛋白胨、糊精、金属盐等，在30℃左右培养一定时间后转入发酵培养基；发酵培养基通常含有黄豆粉、蛋白胨、糊精、金属盐等，在30℃左右(例如30±1℃)培养一定时间后可补加癸酸溶液。

[0042] 在本发明中，发酵培养进行20-40小时(优选的是，20-30小时，更优选的是，24小时)后，将无菌的复合氨基酸的水溶液添加到发酵液中，其中所述复合氨基酸包含构成达托霉素结构的氨基酸和/或其前体的混合物。

[0043] 其中，在发酵培养进行20-40小时后，玫瑰孢链霉菌由生长期进入代谢期，开始合成达托霉素，优选此时进行补料，能提高达托霉素的产量。

[0044] 优选将所述的复合氨基酸的水溶液以流加方式添加到所述发酵液中，其中所述复合氨基酸的水溶液的浓度为1.0g/L-18.0g/L。

[0045] 所述流加优选持续92小时至124小时，更优选100-120小时，更优选116小时。所述流加的速度优选为每升发酵液中每小时流加1.0ml-7.0ml所述复合氨基酸的水溶液。更优选的是，所述流加的速度为每升发酵液中每小时流加2.4ml所述复合氨基酸的水溶液。

[0046] 流加可以采用蠕动泵进行。蠕动泵可得自重庆杰恒蠕动泵有限公司，型号为BT-50(100)E。

[0047] 流加的速度不能过快，否则会对玫瑰孢链霉菌的发酵产生反馈抑制。流加的速度也不能过慢，否则会对发酵时间造成不必要的延长。

[0048] 优选的是，在将复合氨基酸的水溶液添加到发酵液之后，在继续发酵培养16-28小时(更优选18-22小时，更优选20小时)，停止发酵。

[0049] 在复合氨基酸的水溶液中，优选的是复合氨基酸的组成和质量含量范围为：

[0050] L-犬尿氨酸：11.73-12.85％；3-甲基谷氨酸：8.97-10.02％；D-丝氨酸：5.44-6.79％；D-丙氨酸：5.68-6.63％；L-鸟氨酸：7.32-8.25％；甘氨酸：8.42-9.16％；
L-苏氨酸：6.73-7.19％；L-天冬氨酸：22.98-23.75％；L-天冬酰胺：7.34-8.08％；L-色氨酸：11.82-12.32％。

[0051] 更优选的是，复合氨基酸的组成和质量含量为：

[0052] L-犬尿氨酸：12.24％；3-甲基谷氨酸：9.53％；D-丝氨酸：6.18％；D-丙氨酸：5.23％；L-鸟氨酸：7.77％；甘氨酸：8.82％；L-苏氨酸：7.00％；L-天冬氨酸：23.47％；
L-天冬酰胺：7.76％；L-色氨酸：12.00％。

[0053] 上述复合氨基酸的水溶液的浓度优选为1.0g/L-10.0g/L，更优选为3.0g/L。

[0054] 在复合氨基酸的水溶液中，还优选的是，使用工业复合氨基酸粗品作为复合氨基酸，该工业复合氨基酸粗品含有占其总质量41.05％-59.31％的下列氨基酸：

[0055] 天冬氨酸：6.28％-8.34％；苏氨酸：2.52％-3.48％；丝氨酸：4.05％-4.97％；谷氨酸：7.19％-8.36％；甘氨酸：2.07％-3.12％；丙氨酸：2.19％-2.76％；半胱氨酸：0.29％-1.02％；缬氨酸：1.91％-2.73％；蛋氨酸：0.21％-0.74％；异亮氨酸：1.07％-1.92％；亮氨酸：2.19％-2.94％；酪氨酸：0.43％-1.27％；苯丙氨酸：1.06％-2.37％；赖氨酸：1.52％-2.73％；组氨酸：0.49％-1.64％；精氨酸：
4.06％-6.03％；脯氨酸：3.52％-4.89％。

[0056] 更优选的是，工业复合氨基酸粗品含有占其总质量50.97％的下列氨基酸：

[0057] 天冬氨酸：7.28％；苏氨酸：3.04％；丝氨酸：4.53％；谷氨酸：8.01％；甘氨酸：2.76％；丙氨酸：2.54％；半胱氨酸0.79％；缬氨酸：2.63％；蛋氨酸：0.71％；异亮氨酸：
1.72％；亮氨酸：2.43％；酪氨酸：0.52％；苯丙氨酸：1.35％；赖氨酸：1.98％；组氨酸：
1.35％；精氨酸：5.32％；脯氨酸：4.01％。

[0058] 上述复合氨基酸的水溶液的浓度优选为6.0g/L-18.0g/L，更优选为11.0g/L。

[0059] 发酵液组分可用HPLC色谱法测定，测定条件如下：

[0060] 色谱柱，Shimadzu VP-0DS，(250.0mm×4.6mm，5.0μm)；流动相，乙腈：0.05mol/L磷酸缓冲液(65∶35)；流速，1.0mL/min；检测波长，223nm；色谱柱温度，25℃。

[0061] 样品溶液制备方法为：达托霉素发酵液按1∶1(V/V)加入乙醇，12000rpm离心5min，上清用0.22μm滤膜过滤，弃初滤液，取续滤液20μL进行HPLC检测。

[0062] 在下述比较例和实施例中：

[0063] 植物蛋白肉汤可购自BD公司；

[0064] 黄豆粉可得自重庆大新药业股份有限公司；

[0065] 蛋白胨可购自BD公司；

[0066] 糊精可购自成都科龙化工试剂厂；

[0067] 磷酸二氢钾和硫酸镁可购自西陇化工股份有限公司；

[0068] 癸酸和油酸甲酯可购自上海千为化工有限公司；

[0069] 工业复合氨基酸粗品可购自四川恒润禾实业有限公司。

[0070] 比较例1

[0071] 按以下方法发酵培养玫瑰孢链霉菌NRRL11379菌株：

[0072] 将孢子接入150ml种子培养基，培养基配比为：植物蛋白肉汤2.5％，糊精3％，pH7.0，121℃灭菌30分钟。摇床转速250rpm，30℃培养28h，转入3L二级种子培养基，转种量为5％。

[0073] 二级种子培养基配比为：黄豆粉2％，蛋白胨0.5％，糊精2％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.2％。pH 7.0，121℃灭菌25分钟。搅拌300rpm，空气流量180L/h，30℃培养28h，转入30L发酵培养基，转种量为10％。

[0074] 发酵培养基配比为：糊精10％，黄豆粉4％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁3
0.2％，pH 7.0，121℃灭菌35分钟。培养温度30℃，搅拌300rpm，空气流量2.16M/h。

[0075] 在发酵培养开始36小时后，在无菌条件下，用蠕动泵将其按7.6ml/h的速度将体积比1∶1的癸酸与油酸甲酯无菌溶液泵入含有30L发酵培养液的发酵罐中，直至在发酵培养开始160小时后放罐。

[0076] 该方法生产达托霉素的发酵单位为1.47g/L。发酵液HPLC图谱见图1。

[0077] 实施例1

[0078] 1.氨基酸溶液的制备：

[0079] 称取下述组分和质量的氨基酸：

[0080] L-犬尿氨酸：3.67g，3-甲基谷氨酸：2.86g，D-丝氨酸：1.85g，D-丙氨酸：1.57g，L-鸟氨酸：2.33g，甘氨酸：2.65g，L-苏氨酸：2.10g，L-天冬氨酸：7.04g，L-天冬酰胺：2.33g，L-色氨酸：3.60g；上述氨基酸总重为30g。

[0081] 将上述称量好的氨基酸加入到纯化水中，搅拌使其充分溶解，并定容至10L，获得浓度为3.0g/L的复合氨基酸水溶液；将该复合氨基酸水溶液在121℃高压蒸汽灭菌15分钟，冷却得无菌复合氨基酸水溶液。

[0082] 2.按以下方法发酵培养玫瑰孢链霉菌NRRL11379菌株：

[0083] 将孢子接入150ml种子培养基，培养基配比为：植物蛋白肉汤2.5％，糊精3％，pH7.0，121℃灭菌30分钟。摇床转速250rpm，30℃培养28h，转入3L二级种子培养基，转种量为5％。

[0084] 二级种子培养基配比为：黄豆粉2％，蛋白胨0.5％，糊精2％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.2％。pH 7.0，121℃灭菌25分钟。搅拌300rpm，空气流量180L/h，30℃培养28h，转入30L发酵培养基，转种量为10％。

[0085] 发酵培养基配比为：糊精10％，黄豆粉4％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁3
0.2％，pH 7.0，121℃灭菌35分钟。培养温度30℃，搅拌300rpm，空气流量2.16M/h。

[0086] 在发酵培养开始24小时后，在无菌条件下，将上述无菌复合氨基酸水溶液用蠕动泵将其按72ml/h的速度泵入含有30L发酵培养液的发酵罐中。同时，在发酵培养开始36小时后，在无菌条件下，用蠕动泵将其按7.6ml/h的速度将体积比1∶1的癸酸与油酸甲酯无菌溶液泵入含有30L发酵培养液的发酵罐中。在发酵培养开始140小时(补料116小时)后，停止补加复合氨基酸水溶液，在发酵培养开始160小时后放罐。

[0087] 该方法生产达托霉素的发酵单位为1.76g/L，与未补加复合氨基酸的工艺相比，本方法可使发酵单位提高20％，而本方法的发酵液组分没有明显变化(见图2)。

[0088] 如图1和2所示(其中横轴表示保留时间，纵轴表示响应值)，图2中保留时间6.898分钟时的峰面积大于图1同样位置的峰面积，显示出发酵过程中补加复合氨基酸的批次(即实施例1)比未补加复合氨基酸的批次(即比较例1)的发酵单位高约20％。前后的小峰代表发酵液中的杂组分，两图相比较没有明显不同，代表发酵过程中补加复合氨基酸比未补加复合氨基酸的批次杂组分没有明显变化。

[0089] 实施例2

[0090] 1.氨基酸溶液的制备：

[0091] 工业复合氨基酸粗品包含下述氨基酸组成和质量比：

[0092] 天冬氨酸：7.28％，苏氨酸：3.04％；丝氨酸：4.53％；谷氨酸：8.01％；甘氨酸：2.76％；丙氨酸：2.54％；半胱氨酸0.79％；缬氨酸：2.63％；蛋氨酸：0.71％；异亮氨酸：
1.72％；亮氨酸：2.43％；酪氨酸：0.52％；苯丙氨酸：1.35％；赖氨酸：1.98％；组氨酸：
1.35％；精氨酸：5.32％；脯氨酸：4.01％。氨基酸总量为：50.97％。

[0093] 称取上述工业复合氨基酸粗品110g加入到纯化水中，搅拌使其充分溶解，并定容至10L，获得浓度为11.0g/L的复合氨基酸水溶液；将该复合氨基酸水溶液在121℃高压蒸汽灭菌15分钟，冷却得无菌复合氨基酸水溶液。

[0094] 2.按以下方法发酵培养玫瑰孢链霉菌NRRL11379菌株：

[0095] 将孢子接入150ml种子培养基，培养基配比为：植物蛋白肉汤2.5％，糊精3％，pH7.0，121℃灭菌30分钟。摇床转速250rpm，30℃培养28h，转入3L二级种子培养基，转种量为5％。

[0096] 二级种子培养基配比为：黄豆粉2％，蛋白胨0.5％，糊精2％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.2％。pH 7.0，121℃灭菌25分钟。搅拌300rpm，空气流量180L/h，30℃培养28h，转入30L发酵培养基，转种量为10％。

[0097] 发酵培养基配比为：糊精10％，黄豆粉4％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁3
0.2％，pH 7.0，121℃灭菌35分钟。培养温度30℃，搅拌300rpm，空气流量2.16M/h。

[0098] 在发酵培养开始24小时后，在无菌条件下，将上述无菌复合氨基酸水溶液用蠕动泵将其按72ml/h的速度泵入含有30L发酵培养液的发酵罐中。同时，在发酵培养开始36小时后，在无菌条件下，用蠕动泵将其按7.6ml/h的速度将体积比1∶1的癸酸与油酸甲酯无菌溶液泵入含有30L发酵培养液的发酵罐中。在发酵培养开始140小时(补料116小时)后，停止补加复合氨基酸水溶液，在发酵培养开始160小时后放罐。

[0099] 该方法生产达托霉素的发酵单位为1.63g/L，与未补加复合氨基酸的工艺相比，本方法可使发酵单位提高11％，而本方法的发酵液组分没有明显变化。