检测库蚊乙酰胆碱酯酶G119S突变的试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测库蚊乙酰胆碱酯酶G119S突变的试剂盒。本发明提供的试剂盒包括蛋白提取液、显色剂、抑制剂I、抑制剂II和碘化硫代乙酰胆碱；蛋白提取液由PB缓冲液和Triton X100组成，Triton X100浓度为1％；显色剂由PB缓冲液、DTNB和NaHCO3组成，DTNB的浓度为0.2mM，NaHCO3的浓度为0.35mM；抑制剂I由残杀威和乙醇组成，残杀威的浓度为10-3M；抑制剂II由残杀威和乙醇组成，残杀威的浓度为10-1M；G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因如序列表的序列4所示。本发明提供的试剂盒操作简单，仅通过肉眼观察、颜色对比便可得知蚊虫是否存在乙酰胆碱酯酶G119S突变，快速高效，可用于田间及日常生活中，为人们对蚊虫进行杀虫剂控制起指导作用。

权利要求

1.辅助鉴定蚊虫是否携带G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因的试剂盒，包括如下组分：蛋白提取液、显色剂、抑制剂I、抑制剂II和碘化硫代乙酰胆碱；所述蛋白提取液由

250mM pH7.0PB缓冲液和Triton X100组成，Triton X100的浓度为1％(重量百分比)；所述显色剂由25mM pH7.0PB缓冲液、DTNB和NaHCO3组成，DTNB的浓度为0.2mM，NaHCO3的浓-3度为0.35mM；所述抑制剂I由残杀威和乙醇组成，残杀威的浓度为10 M；所述抑制剂II由-1残杀威和乙醇组成，残杀威的浓度为10 M；所述G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因如序列表的序列4所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由独立包装的如下组分组成：所述蛋白提取液、所述显色剂、所述抑制剂I、所述抑制剂II和碘化硫代乙酰胆碱。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述蚊虫为尖音库蚊复组中的库蚊，具体为致倦库蚊。

4.权利要求1或2或3所述试剂盒在辅助鉴定蚊虫是否携带突变型乙酰胆碱酯酶编码基因中的应用；所述G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因如序列表的序列4所示。

5.权利要求1或2或3所述试剂盒在辅助鉴定待测蚊虫为G119S突变型纯合体、G119S突变型杂合体或G119S野生型纯合体中的应用；所述G119S野生型纯合体为序列2所示核苷酸自5′末端第739位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；所述G119S突变型纯合体为序列4示核苷酸自5′末端第739位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；所述G119S突变型杂合体为序列4所示核苷酸自5′末端第739位脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体。

6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述蚊虫为尖音库蚊复组中的库蚊，具体为致倦库蚊。

7.应用权利要求1或2所述试剂盒辅助鉴定蚊虫是否携带G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因的方法，包括如下步骤：(1)将待测蚊虫在所述蛋白提取液中进行研磨提取，得到的上清作为待测蛋白样本；

(2)将5mg碘化硫代乙酰胆碱与1ml所述显色剂混合，得到底物；

(3)取三份待测蛋白样本，每份100μl；第一份样本加10μl无水乙醇，第二份样本加

10μl所述抑制剂I，第三份样本加10μl所述抑制剂II，放置15min；

(4)向步骤(3)的三份样本中，每份加80μl所述显色剂、20μl所述底物，混匀，放置5-10min；如果三份样本均显示为黄色，待测蚊虫携带G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因；如果第一份样本显示为黄色，第二份和第三份样本均未显示为黄色，待测蚊虫不携带G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因；

所述G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因如序列表的序列4所示。

8.应用权利要求1或2所述试剂盒辅助鉴定待测蚊虫为G119S突变型纯合体、G119S突变型杂合体或G119S野生型纯合体的方法，包括如下步骤：(1)将待测蚊虫在所述蛋白提取液中进行研磨提取，得到的上清作为待测蛋白样本；

(2)将5mg碘化硫代乙酰胆碱与1ml所述显色剂混合，得到底物；

(3)取三份待测蛋白样本，每份100μl；第一份样本加10μl无水乙醇，第二份样本加

10μl所述抑制剂I，第三份样本加10μl所述抑制剂II，放置15min；

(4)向步骤(3)的三份样本中，每份加80μl所述显色剂、20μl所述底物，混匀，放置

5-10min；如果三份样本均显示为黄色且饱和度一致，待测蚊虫为G119S突变型纯合体；如果三份样本均显示为黄色，且第二份和第三份样本的饱和度低于第一份样本的饱和度，待测蚊虫为G119S突变型杂合体；如果第一份样本显示为黄色，第二份和第三份样本均未显示为黄色，待测蚊虫为G119S野生型纯合体；

所述野生型纯合体为序列2所示核苷酸自5′末端第739位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；所述G119S突变型纯合体为序列4示核苷酸自5′末端第739位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；所述G119S突变型杂合体为序列4所示核苷酸自5′末端第739位脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体。

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述蚊虫为尖音库蚊复组中的库蚊，具体为致倦库蚊。

10.权利要求1至3中任一所述试剂盒或权利要求7至9中任一所述方法在辅助鉴定蚊虫对有机磷杀虫剂的抗药性中的应用。

说明书

检测库蚊乙酰胆碱酯酶G119S突变的试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种检测库蚊乙酰胆碱酯酶G119S突变的试剂盒。

背景技术

[0002] 蚊虫由于其特殊的行为、生理特性，成为多种疾病的传播媒介，严重影响了旅游业、饮食业，制约了卫生城市的发展，严重的危害了人类健康。蚊虫的种类繁多，其通过叮咬传播的疾病也比较多，库蚊是丝虫病、乙型脑炎、西尼罗河病毒的主要传播媒介，按蚊是丝虫病和疟疾的主要传播媒介，伊蚊是登革热和乙型脑炎的主要传播媒介(Hemingway J and Ranson H.Insecticide resistance in insect vectors of humandisease[J].Annu.Rev.Entomol.2000，45：371-391.)。

[0003] 目前主要采取物理防治、化学防治、生物防治(徐承龙，姜志宽.蚊虫防治(三)-蚊虫防治的原则与方法[J].中华卫生杀虫药械.2006c，12(6)：494-496.)等方法防止其对疾病的传染，以化学杀虫剂为主的化学防治，以其高效、快速、便捷等优势成为主要的防治方法(王以燕.我国卫生杀虫剂面临的机遇与挑战[J].中华卫生杀虫药械，2009，15(3)：215-216.)。由于大量的使用化学杀虫剂，蚊虫逐渐对有机磷、有机氯、拟除虫菊酯类杀虫剂产生了抗药性(刘维德.我国蚊类抗药性发展动向[J].中国媒介生物学及控制，1990，(1)：41-44.)。蚊虫抗药性主要分为代谢抗药性和靶标抗药性，其中导致代谢抗药性的有三种酶：羧酸酯酶(W.G.Brogdon：Comp.Biochem.Physiol.C.1988，90，145-150.；O.Dary，G.P.Georghiou，E.Parsons and N.Pasteur：J.Econ.Entomol.1990，83，2187-2192.；C.Brengues，N.J.Hawkes，F.Chandre，L.McCarroll，S.Duchon，P.Guillet，S.Manguin，J.C.Morgan and J.Hemingway：Med.Vet.Entomol.2003，17，87-94.)，P450单加氧酶，谷胱甘肽S转移酶(W.G.Brogdon and A.M.Barber：Comp.Biochem.Physiol.B1990，96，339-342.)，与抗药性相关的靶标有：氨基丁酸受体的突变(W.Du，T.S.Awolola，P.Howell，L.L.Koekemoer，B.D.Brooke，M.Q.Benedict，M.Coetzeeand L.Zheng：Insect Mol.Biol.2005，14，179-183.；R.H.ffrench-Constant，J.C.Steichen and F.Shotkoski：Med.Vet.Entomol.1994，8，99-100.)，乙酰胆碱酯酶的突变，电压门钠离子通道突变(D.Martinez-Torres，F.Chandre，M.S.Williamson，F.Darriet，J.B.Berge，A.L.Devonshire，P.Guillet，N.Pasteurand D.Pauron：Insect Mol.Biol.1998，7，
179-184.；A.Lynd，H.Ranson，P.J.McCall，N.P.Randle，W.C.Black，E.D.Walker and M.J.Donnelly：Malar.J.2005，4，16.)。

[0004] 目前对于监测和鉴定蚊虫抗药性，常用方法有4种：毒效生物测定法(包括半数致死量法、区分剂量法)、酶测定法、遗传学方法和免疫学方法。其中，WHO生物测定方法(WHO technical report series，No，818.Vecter resistance to pesticide，1992.62.)，测定蚊虫四龄幼虫对不同杀虫剂的敏感性，计算LC50及抗性指数。区分剂量法，按照世界卫生组织(WHO)及全国蚊虫抗性协作组统一制定的区分剂量法进行，根据死亡率判断抗性级别。为了便于抗性调查和抗性遗传的研究，早在1958年Davidson就提出了“区分剂量”的概念，此后，大量的抗药性监测工作也使用了区分剂量法(周水森，王漪，汤林华.2005年全国疟疾形式[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2006，24：401-403.[2]；李华宪，陈国伟，杨沅川，等.云南省2001～2005年疟疾疫情分析[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2008，26(1)：46-49.；陈国伟，李唯本，任志先，等.云南省嗜人按蚊分布区疟疾防治对策研究[J].中国热带医学，2004，4(1)：29-31.)。区分计量法用于检测群体中抗性个体的出现频率，半数致死量法用于衡量群体中大多数个体抗性分布状况，但由于缺乏敏感品系做参照，现场测试不能判断其抗药性水平，只能在不同地区之间进行横向比较(孙养信，岳永杰，佘建军，孙亮，阮春来，安翠红，吕文.陕西省流行性乙型脑炎高发区三带喙库蚊的抗药性研究[J].中国媒介生物学及控制.2009，20(4)：313-316.)。

[0005] 尖音库蚊复组(Culex pipiens complex)为库蚊属(Genus Culex)的重要类群之一。复组包括模式种尖音库蚊，以及一些形态相似的亲缘种(sibling species)、亚种或“型”(陈汉彬，陆宝麟.中国尖音库蚊复组的研究.贵阳医学院学报.1983，01)，我国有4种，分别是：尖音库蚊(Culex pipiens pipiens)、致倦库蚊(Culex pipiensquinquefasciatus)、淡色 库蚊(Culex pipienspallens)、骚 扰库蚊 (Culex pipiensmolestus)(Dina M.Fonseca，Nusha Keyghobadi，Colin A.Malcolm，Ceylan Mehmet，Francis Schaffner，Motoyoshi Mogi，Robert C.Fleischer and Richard C.Wilkerson.Emerging Vectors in the Culex pipiens Complex.Science 5March 2004：
Vol.303 no.5663 pp.1535-1538；宋社吾，赵彤言，董言德等.我国尖音库蚊复组的杂交及其与Wolbachia感染的关系[J].昆虫学报，2002.)。

[0006] 对于蚊虫有机磷抗性，研究发现，酯酶水平的增加标志着对有机磷药物的抗性增加(Singh Y，Khanna H，Chopra AP，Mehra V.A dominant negative mutant ofBacillus anthracis protective antigen inhibits anthrax toxin action in vivo [J].J Biol Chem，2001，276(25)：22090-22094.；Leppla SH.Anthrax toxin edemafactor：a bacterial adenylate cyclase that increases cyclic AMP concentrationsof eukaryotic cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，1982，79(10)：3162-3166.)。目前常用检测有机磷抗性的方法的就是微量滴定板法(生物化学方法)，通过酶标仪得出羧酸酯酶的活性水平(李士根.非特异性酯酶与淡色库蚊抗药性关系的研究[J].中华卫生杀虫药械，2009，15(4)：269-271.)，借以判断个体蚊虫的抗性状况。这种方法的优点是能得到羧酸酯酶活性的准确值，不足之处是必须借助酶标仪才能完成，在日常生活中较麻烦。
对于靶标抗药性(有机磷)，可以采用生化检测技术(J.Hemingway and C.Smith：Bull.Entomol.Res.76，559-565(1986))检测不敏感的乙酰胆碱酯酶，相对于代谢抗性中的微孔板检测，此种检测更精确，且能检测出抗性个体种的纯合和杂合体(Michael COLEMAN and Janet HEMINGWAY：Insecticideresistance monitoring and evaluation in disease transmitting mosquitoes，J.Pestic.Sci.，32(2)，69-76(2007))且运用等位基因特异性PCR能检测出三大靶标的突变，但这种方法在日常生活检测中较麻烦。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种检测库蚊乙酰胆碱酯酶G119S突变的试剂盒。

[0008] 本发明提供的辅助鉴定蚊虫是否携带G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因的试剂盒，包括如下组分：蛋白提取液、显色剂、抑制剂I、抑制剂II和碘化硫代乙酰胆碱；所述蛋白提取液由250mM pH7.0PB缓冲液和Triton X100组成，Triton X100的浓度为1％(重量百分比)；所述显色剂由25mM pH7.0PB缓冲液、DTNB和NaHCO3组成，DTNB的浓度为0.2mM，-3NaHCO3的浓度为0.35mM；所述抑制剂I由残杀威和乙醇组成，残杀威的浓度为10 M；所述-1
抑制剂II由残杀威和乙醇组成，残杀威的浓度为10 M；所述G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因如序列表的序列4所示。

[0009] 残杀威即2-(1-甲基乙氧基)苯基氨基甲酸甲酯。

[0010] DTNB即5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)。

[0011] 所述试剂盒具体可由独立包装的如下组分组成：所述蛋白提取液、所述显色剂、所述抑制剂I、所述抑制剂II和碘化硫代乙酰胆碱。

[0012] 所述250mM pH7.0PB缓冲液具体可由水、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成。

[0013] 所述25mM pH7.0PB缓冲液具体可由水、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成。

[0014] 所述蚊虫可为尖音库蚊复组中的库蚊，具体可为致倦库蚊。

[0015] 所述试剂盒可用于辅助鉴定蚊虫是否携带突变型乙酰胆碱酯酶编码基因；所述G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因如序列表的序列4所示。

[0016] 所述试剂盒可用于辅助鉴定待测蚊虫为G119S突变型纯合体、G119S突变型杂合体或G119S野生型纯合体；所述G119S野生型纯合体为序列2所示核苷酸自5′末端第739位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；所述G119S突变型纯合体为序列4示核苷酸自5′末端第739位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；所述G119S突变型杂合体为序列4所示核苷酸自5′末端第739位脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体。

[0017] 所述蚊虫可为尖音库蚊复组中的库蚊，具体可为致倦库蚊。

[0018] 本发明还保护一种应用所述试剂盒辅助鉴定蚊虫是否携带G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因的方法，包括如下步骤：

[0019] (1)将待测蚊虫(如成虫)在所述蛋白提取液中进行研磨提取，得到的上清作为待测蛋白样本；

[0020] (2)将5mg碘化硫代乙酰胆碱与1ml所述显色剂混合，得到底物；

[0021] (3)取三份待测蛋白样本，每份100μl；第一份样本加10μl无水乙醇，第二份样本加10μl所述抑制剂I，第三份样本加10μl所述抑制剂II，放置15min；

[0022] (4)向步骤(3)的三份样本中，每份加80μl所述显色剂、20μl所述底物，混匀，放置5-10min(如8min)；如果三份样本均显示为黄色，待测蚊虫携带G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因；如果第一份样本显示为黄色，第二份和第三份样本均未显示为黄色，待测蚊虫不携带G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因；

[0023] 所述G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因如序列表的序列4所示。

[0024] 本发明还保护一种应用所述试剂盒辅助鉴定待测蚊虫为G119S突变型纯合体、G119S突变型杂合体或G119S野生型纯合体的方法，包括如下步骤：

[0025] (1)将待测蚊虫在所述蛋白提取液中进行研磨提取，得到的上清作为待测蛋白样本；

[0026] (2)将5mg碘化硫代乙酰胆碱与1ml所述显色剂混合，得到底物；

[0027] (3)取三份待测蛋白样本，每份100μl；第一份样本加10μl无水乙醇，第二份样本加10μl所述抑制剂I，第三份样本加10μl所述抑制剂II，放置15min；

[0028] (4)向步骤(3)的三份样本中，每份加80μl所述显色剂、20μl所述底物，混匀，放置5-10min(如8min)；如果三份样本均显示为黄色且饱和度一致，待测蚊虫为G119S突变型纯合体；如果三份样本均显示为黄色，且第二份和第三份样本的饱和度低于第一份样本的饱和度，待测蚊虫为G119S突变型杂合体；如果第一份样本显示为黄色，第二份和第三份样本均未显示为黄色，待测蚊虫为G119S野生型纯合体；

[0029] 所述野生型纯合体为序列2所示核苷酸自5′末端第739位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体；所述G119S突变型纯合体为序列4示核苷酸自5′末端第739位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体；所述G119S突变型杂合体为序列4所示核苷酸自5′末端第739位脱氧核糖核苷酸为G和A的杂合体。

[0030] 所述蚊虫可为尖音库蚊复组中的库蚊，具体可为致倦库蚊。

[0031] 所述试剂盒或所述方法可用于辅助鉴定蚊虫对有机磷杀虫剂的抗药性用。

[0032] 本发明提供的试剂盒，可以辅助鉴定待测蚊虫体内的抗性基因ace-1的一个位点G119S是否发生突变(能检测出G119S突变纯合体、突变杂合体、无靶标突变三种情况的样本)，从而判断待测蚊虫是否对杀虫剂产生了靶标抗性，本发明提供的试剂盒操作简单，仅通过肉眼观察、颜色对比便可得知所检测蚊虫是否存在乙酰胆碱酯酶G119S突变，快速高效，可用于田间及日常生活中，可以为人们对蚊虫进行杀虫剂控制方面起到指导作用。

附图说明

[0033] 图1为G119S突变型纯合体的检测结果。

[0034] 图2为G119S野生型纯合体的检测结果。

[0035] 图3为G119S突变型杂合体的检测结果。

具体实施方式

[0036] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

[0037] 致倦库蚊SR品系(有机磷杀虫剂抗性品系)；参考文献：Feng Cui，Michel Raymond，Arnaud Berthomieu，Haoues Alout，Mylene Weill and Chuan-Ling Qiao.2006.Recent emergence of insensitive acetylcholinesterase in Chinese populationsof the mosquito Culex pipiens.Journal of Medical Entomology，43：878-883.；该品系为G119S突变型纯合体，携带纯合的G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因(如序列表的序列4所示)，该基因编码序列表的序列3所示的G119S突变型乙酰胆碱酯酶。

[0038] 致倦库蚊S-LAB品系(杀虫剂敏感品系)；参考文献：Feng Cui，Michel Raymond，Arnaud Berthomieu，Haoues Alout，Mylene Weill and Chuan-Ling Qiao.2006.Recent emergence of insensitive acetylchol inesterase in Chinese populat ionsof the mosquito Culex pipiens.Journal of Medical Entomology，43：878-883.；该品系为野生型纯合体)，携带纯合的野生型乙酰胆碱酯酶编码基因(如序列表的序列2所示)，该基因编码序列表的序列1所示的野生型乙酰胆碱酯酶。

[0039] DTNB即5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，购自Fluka公司，产品目录号为43760。

[0040] 残杀威即2-(1-甲基乙氧基)苯基氨基甲酸甲酯，购自北京市农药检定所，产品目录号为114-26-1。

[0041] 碘化硫代乙酰胆碱：购自Sigma公司，产品目录号为A-5751。

[0042] 实施例1、试剂盒的组成

[0043] 试剂盒由蛋白提取液、显色剂、抑制剂I、抑制剂II和底物管组成。

[0044] 蛋白提取液(1瓶)：由250mM pH7.0PB缓冲液和Triton X100组成，Triton X100的浓度为1％(重量百分比)；所述250mM pH7.0PB缓冲液由水、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成。

[0045] 显色剂(1瓶)：由25mM pH7.0PB缓冲液、DTNB和NaHCO3组成，DTNB的浓度为0.2mM，NaHCO3的浓度为0.35mM；所述25mM pH7.0PB缓冲液由水、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成。

[0046] 抑制剂I(1瓶)：由残杀威和乙醇组成，残杀威的浓度为10-3M。

[0047] 抑制剂II(1瓶)：由残杀威和乙醇组成，残杀威的浓度为10-1M。

[0048] 底物管(20支)：装有5mg碘化硫代乙酰胆碱的1.5ml离心管。

[0049] 储存条件：蛋白提取液、显色剂于4℃保存；抑制剂I、抑制剂II、底物管于-20℃保存。

[0050] 试剂盒可做100次实验，提供20次的底物，因此至少5只蚊虫一起做，或者底物配好后存放-20℃，可以保存一周。底物和显色剂很易降解，现用现配；抑制剂I、抑制剂II易挥发，用完后立刻盖紧，它们是高浓度有机磷农药，有毒，剩余的请回收处理。

[0051] 实施例2、试剂盒的应用

[0052] 一、应用实施例1制备的试剂盒检测致倦库蚊SR品系

[0053] 1、将单只蚊子(致倦库蚊SR品系，成虫)放在1.5ml离心管中，加400ul蛋白提取液，将蚊虫充分研磨均匀，4℃下10000rpm离心10min，取上清作为待测蛋白样本(小心地放在冰上备用)。

[0054] 2、取一支底物管，少许离心使药聚集到管底，取1ml显色剂加到底物管中，充分摇匀，得到底物(放在冰上备用)。

[0055] 3、准备3支0.5ml离心管(1号管、2号管和3号管)，每管加100μl待测蛋白样本；然后1号管加10μl无水乙醇，2号管加10μl抑制剂I，3号管加10μl抑制剂II，室温下放置15min。

[0056] 4、步骤3的3支离心管中，每支加80μl显色剂、20μl底物，充分混匀，室温下放置8min(5-10min均可)。

[0057] 观察3支管的颜色，见图1。3支管都呈现黄色且深度一致，说明待测蚊虫携带纯合的G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因，其乙酰胆碱酯酶发生了G119S突变。

[0058] 二、应用实施例1制备的试剂盒检测致倦库蚊S-LAB品系

[0059] 用致倦库蚊S-LAB品系代替致倦库蚊SR品系，其它同步骤一。

[0060] 观察3支管的颜色，见图2。1号管出现黄色，2号管和3号管均未显示黄色，说明待测蚊虫携带纯合的G119S野生型乙酰胆碱酯酶编码基因(不携带G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因)，其乙酰胆碱酯酶未发生G119S突变。

[0061] 三、应用实施例1制备的试剂盒检测杂合样本

[0062] 1、将单只蚊子(致倦库蚊SR品系，成虫)放在1.5ml离心管中，加400ul蛋白提取液，将蚊虫充分研磨均匀，4℃下10000rpm离心10min，取上清作为蛋白样本甲；将单只蚊子(致倦库蚊S-LAB品系，成虫)放在1.5ml离心管中，加400ul蛋白提取液，将蚊虫充分研磨均匀，4℃下10000rpm离心10min，取上清作为蛋白样本乙；将蛋白样本甲和蛋白样本乙等体积混合，作为待测蛋白样本(小心地放在冰上备用)。

[0063] 2、取一支底物管，少许离心使药聚集到管底，取1ml显色剂加到底物管中，充分摇匀，得到底物(放在冰上备用)。

[0064] 3、准备3支0.5ml离心管(1号管、2号管和3号管)，每管加100μl待测蛋白样本；然后1号管加10μl无水乙醇，2号管加10μl抑制剂I，3号管加10μl抑制剂II，室温下放置15min。

[0065] 4、步骤3的3支离心管中，每支加80μl显色剂、20μl底物，充分混匀，室温下放置8min(5-10min均可)。

[0066] 观察3支管的颜色，见图3。1号管出现黄色，2号管和3号管均显示淡黄色，说明待测蚊虫携带野生型乙酰胆碱酯酶编码基因和G119S突变型乙酰胆碱酯酶编码基因，为G119S突变杂合体。