花曲柳的离体快繁方法

摘要

花曲柳的离体快繁方法，涉及一种花曲柳的离体快繁方法及其增殖培养基。是要解决现有花曲柳快繁方法存在步骤繁琐、休眠芽萌发率低、茎芽增殖率低、生根率低、移栽成活率低、成本高的问题。方法：将花曲柳的休眠枝条水培，切取新的枝条带芽茎段预处理，接种到增殖培养基，获得丛生茎芽；以单个茎芽为单位进行切离，再切割成带顶芽的茎段，接种到生根培养基；将再生植株在培养室内敞口炼苗，洗净根系附着的培养基，再移植到栽培基质中培养至长出的新叶完全展开，获得花曲柳苗木，即完成花曲柳的离体快繁。本发明的方法繁殖周期短、速度快、效率高，茎芽增殖率达100％；繁殖成本低；茎芽生根率和移栽成活率均可达90％以上。

权利要求

1.花曲柳的离体快繁培养基，其特征在于包括增殖培养基和生根培养基；

其中增殖培养基为含有1.0～4.0mg/L细胞分裂素、0～1.0mg/L生长素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的改良的B5培养基，pH值为5～6；改良的B5培养基，由3000mg/L的KNO3、150mg/L的CaCl2·2H2O、740mg/L的MgSO4·7H2O、150mg/L的NaH2PO4·2H2O、0.75mg/L的KI、3mg/L的H3BO3、33.5mg/L的MnSO4·4H2O、2mg/L的ZnSO4·7H2O、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O、

0.025mg/L的CuSO4·5H2O、0.025mg/L的CoCl2·6H2O、338mg/L的FeSO4·7H2O、37.3mg/L的Na2-EDTA、100mg/L的肌醇、10mg/L的盐酸硫胺素、10mg/L的烟酸、0.1mg/L的盐酸吡哆素和蒸馏水制成，细胞分裂素为苄基腺嘌呤、玉米素、激动素或噻苯隆，生长素为萘乙酸或吲哚丁酸；

其中生根培养基为含有0.5～2.0mg/L生长素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的

1/2MS培养基或含有0.5～2.0mg/L生长素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L琼脂的WPM培养基，pH值均为5～6，生长素为萘乙酸或吲哚丁酸。

2.利用权利要求1所述的培养基进行花曲柳的离体快繁的方法，其特征在于按以下步骤进行：一、将花曲柳的休眠枝条于室温进行水培，每天换一次水，培养至休眠枝条的休眠芽萌发形成新的枝条，切取新的枝条的带芽茎段进行预处理，然后接种到增殖培养基上，在温度-2 -1为20～30℃、湿度为40％～80％、光照强度为20～80μmol·m ·s 的条件下培养，每天光照12～24h，每10～30天更换增殖培养基，培养1～2个月，获得丛生茎芽；所述增殖培养基含有1.0～4.0mg/L细胞分裂素、0～1.0mg/L生长素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L琼脂；

二、挑选正常发育的丛生茎芽，以单个茎芽为单位进行切离，将切离后的单个茎芽切割成长度为1.5～5.0cm的带顶芽的茎段，然后将带顶芽的茎段接种到生根培养基上，在温度-2 -1为20～30℃、湿度为40％～80％、光照强度为20～80μmol·m ·s 的条件下培养，每天光照12～24h、每10～30天更换生根培养基，培养1～2个月，获得再生植株；所述生根培养基含有0.5～2.0mg/L生长素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L琼脂；

三、将株高达3cm、根系发达且叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3～5d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到容器中的栽培基质中并浇水，用塑料薄膜覆盖容器口，在-2 -1温度为20～30℃、湿度为60％～80％、光照强度为40～80μmol·m ·s 、每天光照12～

24h的条件下培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得花曲柳苗木，即完成花曲柳的离体快繁；

步骤三中栽培基质按体积百分含量由50％的草炭土、40％～50％的蛭石和0％～10％的珍珠岩组成。

3.根据权利要求2所述的花曲柳的离体快繁方法，其特征在于步骤一中的带芽茎段为带有顶芽或腋芽且长度为2.0～3.0cm的茎段。

4.根据权利要求2或3所述的花曲柳的离体快繁方法，其特征在于步骤一中在温度为-2 -1

22～28℃、湿度为50％～70％、光照强度为40～60μmol·m ·s 的条件下培养。

5.根据权利要求2或3所述的花曲柳的离体快繁方法，其特征在于步骤一中在温度为-2 -1

25℃、湿度为55％、光照强度为50μmol·m ·s 的条件下培养。

6.根据权利要求4所述的花曲柳的离体快繁方法，其特征在于步骤一中增殖培养基含有3.0mg/L细胞分裂素、0.5mg/L生长素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂。

7.根据权利要求6所述的花曲柳的离体快繁方法，其特征在于步骤二中在温度为22～-2 -1

28℃、湿度为50％～70％、光照强度为40～60μmol·m ·s 的条件下培养。

8.根据权利要求6所述的花曲柳的离体快繁方法，其特征在于步骤二中在温度为-2 -1

25℃、湿度为60％、光照强度为50μmol·m ·s 的条件下培养。

9.根据权利要求7所述的花曲柳的离体快繁方法，其特征在于步骤二中生根培养基含有1.0mg/L生长素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂。

10.根据权利要求9所述的花曲柳的离体快繁方法，其特征在于步骤三中在温度为-2 -1

25℃、湿度为70％、光照强度为60μmol·m ·s 、每天光照16h的条件下培养至长出的新叶完全展开。

说明书

花曲柳的离体快繁方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种花曲柳的离体快繁方法及其增殖培养基。

背景技术

[0002] 花曲柳(Fraxinus rhynchophylla)是木犀科白蜡树属的落叶大乔木，是我国东北东部山地的重要经济硬阔树种。花曲柳抗逆性强，材质坚硬致密，花纹美丽，树皮为中药“秦皮”，可清肝热、止痢、明目、主治肠炎；种子可榨油，供制肥皂，是一种重要的装饰用材树种、药用树种和园林绿化树种。

[0003] 在生产实践中用种子繁殖花曲柳存在优质母树不足、种子质量和数量没保障的问题。仅仅靠种子繁殖获得并扩繁出的花曲柳苗木的数量，远远不能满足造林生产实践对优质苗木的需求。如果利用嫩枝扦插或嫁接的方式进行繁殖，存在可利用植物材料不足，繁殖周期长(至少需要6个月)，增殖效率低、成本高的问题，因此很难在短时间内繁殖出大量、优质的苗木以满足造林生产实践对花曲柳优质苗木的需求。

[0004] 利用组织培养手段可以在短时间内扩繁出大量的花曲柳优质苗木以满足生产实践的需求。《大叶白蜡的离体培养与快速繁殖》(洪源范等，2006年12月，植物生理学通讯，第42卷第6期)中公开了一种花曲柳的快繁方法，但该方法在芽的诱导阶段使用了组织培养的方法，步骤繁琐，增加了培养周期，而萌发率仅为84％，还存在茎芽增殖系数低(增殖系数为2.5)、茎芽生根率低(81.7％)、移栽存活率低(83.7％)的问题。现有的花曲柳组织培养技术在茎芽增殖培养基中使用的激素种类复杂(需要2种细胞分裂素和1种生长素配合)，致使通过组织培养手段扩繁花曲柳优质苗木的成本偏高。

发明内容

[0005] 本发明是要解决现有花曲柳快繁方法存在步骤繁琐、休眠芽萌发率低、茎芽增殖率低、生根率低、移栽成活率低、成本高的问题，提供花曲柳的离体快繁方法。

[0006] 本发明花曲柳的离体快繁方法，按以下步骤进行：

[0007] 一、将花曲柳的休眠枝条于室温进行水培，每天换一次水，培养至休眠枝条的休眠芽萌发形成新的枝条，切取新的枝条的带芽茎段进行预处理，然后接种到增殖培养基上，在-2 -1温度为20～30℃、湿度为40％～80％、光照强度为20～80μmol·m ·s 的条件下培养，每天光照12～24h，每10～30天更换增殖培养基，培养1～2个月，获得丛生茎芽；所述增殖培养基含有1.0～4.0mg/L细胞分裂素、0～1.0mg/L生长素、20～40g/L蔗糖和5～
7g/L琼脂；

[0008] 二、挑选正常发育的丛生茎芽，以单个茎芽为单位进行切离，将切离后的单个茎芽切割成长度为1.5～5.0cm的带顶芽的茎段，然后将带顶芽的茎段接种到生根培养基上，在-2 -1温度为20～30℃、湿度为40％～80％、光照强度为20～80μmol·m ·s 的条件下培养，每天光照12～24h、每10～30天更换生根培养基，培养1～2个月，获得再生植株；所述生根培养基含有0.5～2.0mg/L生长素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L琼脂；

[0009] 三、将株高达3cm、根系发达且叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3～5d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到容器中的栽培基质中并浇水，用塑料薄膜覆盖容器-2 -1口，在温度为20～30℃、湿度为60％～80％、光照强度为40～80μmol·m ·s 、每天光照12～24h的条件下培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得花曲柳苗木，即完成花曲柳的离体快繁；

[0010] 其中步骤一中增殖培养基为改良的B5培养基，pH值为5～6；

[0011] 步骤一中细胞分裂素为苄基腺嘌呤、玉米素、激动素或噻苯隆；

[0012] 步骤一中的生长素为萘乙酸或吲哚丁酸；

[0013] 步骤二中生根培养基为1/2MS培养基或WPM培养基，pH值均为5～6；

[0014] 步骤二中生长素为萘乙酸或吲哚丁酸；

[0015] 步骤三中栽培基质按体积百分含量由50％的草炭土、40％～50％的蛭石和0％～10％的珍珠岩组成。

[0016] 上述花曲柳的离体快繁方法的增殖培养基为改良的B5培养基，由3000mg/L的KNO3、150mg/L的CaCl2·2H2O、740mg/L的MgSO4·7H2O、150mg/L的NaH2PO4·2H2O、0.75mg/L的KI、3mg/L的H3BO3、33.5mg/L的MnSO4·4H2O、2mg/L的ZnSO4·7H2O、0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O、0.025mg/L的CuSO4·5H2O、0.025mg/L的CoCl2·6H2O、33.8mg/L的FeSO4·7H2O、37.3mg/L的Na2-EDTA、100mg/L的肌醇、10mg/L的盐酸硫胺素、1.0mg/L的烟酸、0.1mg/L的盐酸吡哆素和蒸馏水制成。

[0017] 本发明中花曲柳的离体快繁方法，对母本破坏小，繁殖周期短，繁殖速度快，繁殖效率高(每1个月的增殖可达10倍)，而且利用母株上原有的顶芽或腋芽直接进行芽的增殖，所产生的后代遗传稳定性好；休眠芽的萌发不需要进行组织培养，降低了方法的难度和成本，休眠芽萌发率达到100％；使用改良的B5培养基作为增殖培养基，茎芽生长状态较好，茎芽增殖率达到100％，茎芽增殖系数达到3以上，每1个月增殖倍数可达到10；茎芽增殖培养基中只需要1种细胞分裂素和1种生长素配合，减小了繁殖成本；茎芽生根率和再生植株的移栽成活率均可达90％以上。可以实现缩短繁殖周期、提高繁殖效率、降低成本、有效扩大花曲柳超级苗数量的目标。

具体实施方式

[0018] 本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

[0019] 具体实施方式一：本实施方式花曲柳的离体快繁方法，按以下步骤进行：

[0020] 一、将花曲柳的休眠枝条于室温进行水培，每天换一次水，培养至休眠枝条的休眠芽萌发形成新的枝条，切取新的枝条的带芽茎段进行预处理，然后接种到增殖培养基上，在-2 -1温度为20～30℃、湿度为40％～80％、光照强度为20～80μmol·m ·s 的条件下培养，每天光照12～24h，每10～30天更换增殖培养基，培养1～2个月，获得丛生茎芽；所述增殖培养基含有1.0～4.0mg/L细胞分裂素、0～1.0mg/L生长素、20～40g/L蔗糖和5～
7g/L琼脂；

[0021] 二、挑选正常发育的丛生茎芽，以单个茎芽为单位进行切离，将切离后的单个茎芽切割成长度为1.5～5.0cm的带顶芽的茎段，然后将带顶芽的茎段接种到生根培养基上，在-2 -1温度为20～30℃、湿度为40％～80％、光照强度为20～80μmol·m ·s 的条件下培养，每天光照12～24h、每10～30天更换生根培养基，培养1～2个月，获得再生植株；所述生根培养基含有0.5～2.0mg/L生长素、20～40g/L蔗糖和5～7g/L琼脂；

[0022] 三、将株高达3cm、根系发达且叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3～5d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到容器中的栽培基质中并浇水，用塑料薄膜覆盖容器-2 -1口，在温度为20～30℃、湿度为60％～80％、光照强度为40～80μmol·m ·s 、每天光照12～24h的条件下培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得花曲柳苗木，即完成花曲柳的离体快繁；

[0023] 其中步骤一中增殖培养基为改良的B5培养基，pH值为5～6；

[0024] 步骤一中细胞分裂素为苄基腺嘌呤(BA)、玉米素(ZT)、激动素(KT)或噻苯隆(TDZ)；

[0025] 步骤一中的生长素为萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)；

[0026] 步骤二中生根培养基为1/2MS培养基(MS培养基中大量元素含量减半的培养基)或WPM培养基，pH值均为5～6；

[0027] 步骤二中生长素为萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)；

[0028] 步骤三中栽培基质按体积百分含量由50％的草炭土、40％～50％的蛭石和0％～10％的珍珠岩组成。

[0029] 本实施方式步骤一中切取新的枝条的带芽茎段进行预处理的方法为用体积浓度为70％～80％的乙醇溶液浸泡20～60s，然后用无菌水冲洗3～7次，再用质量浓度为0.05％～0.2％的氯化汞溶液搅拌浸泡3～10min，然后用无菌水冲洗至少5次，置于无菌水中备用。接种前用无菌滤纸吸干茎段表面水分，切割成长1.5～2.0cm且带1-2个芽的茎段。

[0030] 本实施方式步骤一中每10～30天更换新鲜培养基，在每次更换新鲜培养基前可将已经形成的茎芽分割成2～5cm长带芽的茎段，然后分别接种到新鲜培养基上，可循环重复进行，以获得更多增殖倍数的茎芽，直至产生能够满足需求的茎芽数量。

[0031] 本实施方式步骤三中移植后的培养过程中每天1次向容器中喷洒水以保持较高的湿度。

[0032] 本实施方式中的改良的B5培养基、WPM培养基和1/2MS培养基成分如表1所示。

[0033] 表1

[0034]

[0035]

[0036] 本实施方式中花曲柳的离体快繁方法，对母本破坏小，繁殖周期短，繁殖速度快，繁殖效率高(每1个月的增殖可达10倍)，而且利用母株上原有的顶芽或腋芽直接进行芽的增殖，所产生的后代遗传稳定性好；休眠芽的萌发不需要进行组织培养，降低了方法的难度和成本，休眠芽萌发率达到100％；使用改良的B5培养基作为增殖培养基，茎芽生长状态较好，茎芽增殖率达到100％，茎芽增殖系数达到3以上，每1个月增殖倍数可达到10；茎芽增殖培养基中只需要1种细胞分裂素和1种生长素配合，减小了繁殖成本；茎芽生根率和再生植株的移栽成活率均可达90％以上。可以实现缩短繁殖周期、提高繁殖效率、降低成本、有效扩大花曲柳超级苗数量的目标。

[0037] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中的带芽茎段为带有顶芽或腋芽且长度为2.0～3.0cm的茎段。其它与具体实施方式一相同。

[0038] 具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中在温度-2 -1为22～28℃、湿度为50％～70％、光照强度为40～60μmol·m ·s 的条件下培养。其它与具体实施方式一或二相同。

[0039] 具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中在温度-2 -1为25℃、湿度为55％、光照强度为50μmol·m ·s 的条件下培养。其它与具体实施方式一或二相同。

[0040] 具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一中增殖培养基含有3.0mg/L细胞分裂素、0.5mg/L生长素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂。其它与具体实施方式一至四之一相同。

[0041] 具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中在-2 -1温度为22～28℃、湿度为50％～70％、光照强度为40～60μmol·m ·s 的条件下培养。
其它与具体实施方式一至五之一相同。

[0042] 具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中在-2 -1温度为25℃、湿度为60％、光照强度为50μmol·m ·s 的条件下培养。其它与具体实施方式一至五之一相同。

[0043] 具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤二中生根培养基含有1.0mg/L生长素、30g/L蔗糖和6g/L琼脂。其它与具体实施方式一至七之一相同。

[0044] 具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤三中在-2 -1温度为25℃、湿度为70％、光照强度为60μmol·m ·s 、每天光照16h的条件下培养至长出的新叶完全展开。其它与具体实施方式一至八之一相同。

[0045] 具体实施方式十：本实施方式花曲柳的离体快繁方法，按以下步骤进行：

[0046] 一、将花曲柳的休眠枝条于室温进行水培，每天换一次水，培养至休眠枝条的休眠芽萌发形成新的枝条，切取新的枝条的带芽茎段进行预处理，然后接种到增殖培养基上，在-2 -1温度为25℃、湿度为50％、光照强度为40μmol·m ·s 的条件下培养，每天光照16h，每
20天更换增殖培养基，培养1个月，获得丛生茎芽；所述增殖培养基为含有4.0mg/L苄基腺嘌呤、0.1mg/L吲哚乙酸、20g/L蔗糖和6g/L琼脂的改良的B5培养基；

[0047] 二、挑选正常发育的丛生茎芽，以单个茎芽为单位进行切离，将切离后的单个茎芽切割成长度为2.0cm的带顶芽的茎段，然后将带顶芽的茎段接种到生根培养基上，在温度-2 -1为25℃、湿度为50％、光照强度为40μmol·m ·s 的条件下培养，每天光照16h、每20天更换生根培养基，培养1个月，获得再生植株；所述生根培养基为含有0.5mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和6g/L琼脂的1/2MS培养基；

[0048] 三、将株高达3cm、根系发达且叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到容器中的栽培基质中并浇水，用塑料薄膜覆盖容器口，在-2 -1温度为25℃、湿度为60％、光照强度为40μmol·m ·s 、每天光照16h的条件下培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得花曲柳苗木，即完成花曲柳的离体快繁；

[0049] 其中增殖培养基和生根培养基的pH值均为5.8；

[0050] 步骤三中栽培基质按体积百分含量由50％的草炭土、40％的蛭石和10％的珍珠岩组成。

[0051] 本实施方式步骤一中切取新的枝条的带芽茎段进行预处理的方法为用体积浓度为75％的乙醇溶液浸泡30s，然后用无菌水冲洗5次，再用质量浓度为0.1％的氯化汞溶液搅拌浸泡6min，然后用无菌水冲洗至少5次，置于无菌水中备用。接种前用无菌滤纸吸干茎段表面水分，切割成长1.5cm且带1-2个芽的茎段。

[0052] 本实施方式中每1个月增殖数量可达10倍，茎芽生根率可达95％，再生植株移栽成活率可达93％。

[0053] 将本实施方式步骤一所述的增殖培养基更换为含有4.0mg/L苄基腺嘌呤、0.1mg/L吲哚乙酸、20g/L蔗糖和6g/L琼脂的B5培养基，含有4.0mg/L苄基腺嘌呤、0.1mg/L吲哚乙酸、20g/L蔗糖和6g/L琼脂的WPM培养基，含有4.0mg/L苄基腺嘌呤、0.1mg/L吲哚乙酸、20g/L蔗糖和6g/L琼脂的QL培养基，其他与本实施方式相同。不同种类的培养基对茎芽增殖率和茎芽生长的影响如表2所示。

[0054] 表2 不同种类的培养基对茎芽增殖率和茎芽生长的影响

[0055]

[0056] 注：不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)

[0057] 结果表明，采用了改良的B5培养基的茎芽生长状态最好，茎芽增殖率达到100％。

[0058] 具体实施方式十一：本实施方式花曲柳的离体快繁方法，按以下步骤进行：

[0059] 一、将花曲柳的休眠枝条于室温进行水培，每天换一次水，培养至休眠枝条的休眠芽萌发形成新的枝条，切取新的枝条的带芽茎段进行预处理，然后接种到增殖培养基上，在-2 -1温度为25℃、湿度为50％、光照强度为40μmol·m ·s 的条件下培养，每天光照16h，每
20天更换增殖培养基，培养1个月，获得丛生茎芽；所述增殖培养基为含有4.0mg/L苄基腺嘌呤、0.1mg/L吲哚乙酸、20g/L蔗糖和6g/L琼脂的改良的B5培养基；

[0060] 二、挑选正常发育的丛生茎芽，以单个茎芽为单位进行切离，将切离后的单个茎芽切割成长度为2.0cm的带顶芽的茎段，然后将带顶芽的茎段接种到生根培养基上，在温度-2 -1为25℃、湿度为50％、光照强度为40μmol·m ·s 的条件下培养，每天光照16h、每20天更换生根培养基，培养1个月，获得再生植株；所述生根培养基为含有0.5mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和6g/L琼脂的1/2MS培养基；

[0061] 三、将株高达3cm、根系发达且叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到容器中的栽培基质中并浇水，用塑料薄膜覆盖容器口，在-2 -1温度为25℃、湿度为60％、光照强度为40μmol·m ·s 、每天光照16h的条件下培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得花曲柳苗木，即完成花曲柳的离体快繁；

[0062] 其中增殖培养基和生根培养基的pH值均为5.8；

[0063] 步骤三中栽培基质按体积百分含量由50％的草炭土和50％的蛭石组成。

[0064] 本实施方式步骤一中切取新的枝条的带芽茎段进行预处理的方法为用体积浓度为75％的乙醇溶液浸泡30s，然后用无菌水冲洗5次，再用质量浓度为0.1％的氯化汞溶液搅拌浸泡6min，然后用无菌水冲洗至少5次，置于无菌水中备用。接种前用无菌滤纸吸干茎段表面水分，切割成长1.5cm且带1-2个芽的茎段。

[0065] 本实施方式中休眠芽萌发率可达100％，茎芽增殖率可达到100％，茎芽增殖系数可达到3，每1个月增殖数量可达10倍，茎芽生根率可达95％，再生植株移栽成活率可达90％。

[0066] 具体实施方式十二：本实施方式花曲柳的离体快繁方法，按以下步骤进行：

[0067] 一、将花曲柳的休眠枝条于室温进行水培，每天换一次水，培养至休眠枝条的休眠芽萌发形成新的枝条，切取新的枝条的带芽茎段进行预处理，然后接种到增殖培养基上，在-2 -1温度为25℃、湿度为50％、光照强度为40μmol·m ·s 的条件下培养，每天光照16h，每
20天更换增殖培养基，培养1个月，获得丛生茎芽；所述增殖培养基为含有4.0mg/L苄基腺嘌呤、20g/L蔗糖和6g/L琼脂的改良的B5培养基；

[0068] 二、挑选正常发育的丛生茎芽，以单个茎芽为单位进行切离，将切离后的单个茎芽切割成长度为2.0cm的带顶芽的茎段，然后将带顶芽的茎段接种到生根培养基上，在温度-2 -1为25℃、湿度为50％、光照强度为40μmol·m ·s 的条件下培养，每天光照16h、每20天更换生根培养基，培养1个月，获得再生植株；所述生根培养基为含有0.5mg/L萘乙酸、20g/L蔗糖和6g/L琼脂的1/2MS培养基；

[0069] 三、将株高达3cm、根系发达且叶片展开的再生植株在培养室内敞口炼苗3d，然后洗净根系附着的培养基，再移植到容器中的栽培基质中并浇水，用塑料薄膜覆盖容器口，在-2 -1温度为25℃、湿度为60％、光照强度为40μmol·m ·s 、每天光照16h的条件下培养至长出的新叶完全展开后，去掉覆盖的塑料薄膜，获得花曲柳苗木，即完成花曲柳的离体快繁；

[0070] 其中增殖培养基和生根培养基的pH值均为5.8；

[0071] 步骤三中栽培基质按体积百分含量由50％的草炭土、40％的蛭石和10％的珍珠岩组成。

[0072] 本实施方式步骤一中切取新的枝条的带芽茎段进行预处理的方法为用体积浓度为75％的乙醇溶液浸泡30s，然后用无菌水冲洗5次，再用质量浓度为0.1％的氯化汞溶液搅拌浸泡6min，然后用无菌水冲洗至少5次，置于无菌水中备用。接种前用无菌滤纸吸干茎段表面水分，切割成长1.5cm且带1-2个芽的茎段。

[0073] 本实施方式中休眠芽萌发率可达100％，茎芽增殖率可达100％，茎芽增殖系数可达3，每1个月增殖数量可达10倍，茎芽生根率可达90％，再生植株移栽成活率可达93％。