一种枯草芽孢杆菌氨肽酶在酵母抽提物制备中的应用

摘要

一种枯草芽孢杆菌氨肽酶在酵母抽提物制备中的应用，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。本发明选择自溶酶解同时进行的工艺，在一定阶段一定条件下将枯草芽孢杆菌Zj016固体氨肽酶与商品中性蛋白酶复配后按一定比例加入酵母待抽提物中，振荡酶解24小时后，酵母抽提物中分子量小于500Da的肽占总肽量的80%以上，酵母抽提物中游离氨基酸的总含量提高到11mg/mL以上，主要呈味氨基酸含量均有提高，进一步提高了酵母抽提物的营养价值，增加了酵母抽提物的鲜味，能达到与风味酶相当的效果，具有代替诺维信风味酶应用在酵母抽提物中的潜力。

权利要求

1.一种枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在酵母抽提物制备中的应用，其特征在于：

（1）称取8.5g活性干酵母粉溶于100mL蒸馏水，加入2g食盐，用中性蛋白酶和固体氨肽酶复配进行酶解，其中中性蛋白酶加入量为E/S=20-30U/g，固体氨肽酶加入量为E/S=700-800U/g，在55℃，自然pH条件下，放入摇床中150rpm振荡自溶24～26h；

（2）95℃灭酶15min，冷却后4℃、5000r/min离心10min，此时沉淀为酵母菌体，上清液为多肽混合物，即酵母抽提物产品；酶解后上清液中分子量小于500Da的肽占总肽量的80%以上，并且游离氨基酸的总含量提高到11mg/mL以上,主要呈味氨基酸丙氨酸的含量提高到1.4mg/mL以上，甘氨酸的含量提高到0.5mg/mL以上，天冬氨酸的含量提高到0.5mg/mL以上，谷氨酸的含量提高到1.7mg/mL以上。

说明书

一种枯草芽孢杆菌氨肽酶在酵母抽提物制备中的应用

技术领域

[0001] 一种食品级枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在酵母抽提物制备中的应用，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。

背景技术

[0002] 酶制剂是指从生物中提取的具有酶特性的一类物质，已广泛应用在食品、酿造、制药、有机酸、淀粉糖、饲料、纺织、皮革、洗涤剂及保健品等各个领域，应用领域越来越广泛。食品与人们的生活密切相关，因此酶在食品工业中的应用价值越来越重要，目前在烘焙、奶制品、肉类加工、新型营养食品和蛋白质的水解中得到很大的体现。

[0003] 随着科技的发展，酶制剂的应用越来越广泛，氨肽酶的应用领域也在不断拓展。国际上已有诺维信风味蛋白酶 Flavorzyme（属内外切复合酶）；AB 公司LAP（液体复合酶，只有部分氨肽酶活力）；日本天野公司有系列肽酶 ProteAX等，而国内的氨肽酶产品目前尚属空白。

[0004] 酵母抽提物是新一代天然高级调味品，含有丰富的蛋白质、游离氨基酸、呈味核苷酸与杂环化合物，具有强烈的呈味性能，有肉香味，是集营养、调味和保健为一体的优良食品调味料。因此酵母抽提物被誉为第三代味精，具有很高的营养价值。

[0005] 本实验室自行筛选出了一株产氨肽酶的枯草芽孢杆菌，菌种来源于传统食品，无安全性风险，提取工艺成熟。这种酶具有与多种内切性蛋白酶复配应用的潜力。将氨肽酶与内切酶复配，应用于酵母抽提物中，可得到较高的水解度，小分子量的肽明显增加，同时呈味氨基酸的量也有提高，显著增加鲜味，进一步提高了酵母抽提物的营养价值，复配酶酶解酵母的效果与诺维信风味酶相当，可以代替诺维信风味酶应用在酵母抽提中，减少生产成本。

发明内容

[0006] 本发明目的是提供一种枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在酵母抽提物制备中的应用，制得的酵母抽提物中小分子量肽含量显著提高，呈味氨基酸含量也有大幅提高，用作食品调味添加剂。

[0007] 本发明的技术方案：

[0008] 枯草芽孢杆菌Zj016的发酵液冷冻离心、澄清、超滤浓缩、脱盐、冷冻干燥，得食品级固体氨肽酶（中国专利201010578579.1已公开，公开号CN102078012A，公开日2011-6-1）。一种枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在酵母抽提物制备中的应用，酵母自溶过程经优化后，用氨肽酶和中性蛋白酶对酵母进行复配酶解，主要以游离氨基酸含量和谷氨酸含量为依据，形成酵母抽提物的最佳制备工艺。提取工艺为：

[0009] A酵母自溶过程中条件的优化

[0010] 通过单因素实验考察了酵母自溶时间，自溶促进剂食盐的添加量，调浆浓度对酵母自溶的影响，以氨基氮含量为依据，得出酵母自溶的最佳条件：酵母自溶时间为24～26h，自溶促进剂食盐的添加量为体系浓度2%，调浆浓度为8.5%为佳。

[0011] B 酶解条件的优化

[0012] （1）复配酶的选择：在相同条件下，酵母自溶26h后，分别加入固体氨肽酶（E/S=960U/g）和中性蛋白酶（E/S=36U/g），固体氨肽酶（E/S=960U/g）和碱性蛋白酶（E/S=36U/g）的复配酶组合，酶解10h后，95℃灭酶15min，冷却后5000r/min、4℃离心10min，计算氨基氮含量、氨基氮得率以及固形物得率，最佳的复配酶组合是固体氨肽酶和中性蛋白酶的组合。

[0013] （2）酶解时间的优化：酵母在相同条件下自溶26h后，加入固体氨肽酶和中性蛋白酶，每隔2h取样测定氨基氮含量，最佳的酶解时间是10h。

[0014] （3）复配酶加酶量的优化：酵母在相同条件下自溶26h后，加入不同酶量的复配酶，酶解10h后，95℃灭酶15min，冷却后5000r/min、4℃离心10min，测定上清液中游离氨基酸总量和谷氨酸含量，合适的加酶量为中性蛋白酶加入量为E/S=20-30U/g，固体氨肽酶加入量为E/S=700-800U/g，最佳的加酶量为中性蛋白酶（E/S=28U/g）和氨肽酶（E/S=774U/g）。

[0015] （4）诺维信风味蛋白酶加酶量的优化：酵母在相同条件下自溶26h后，分别加入E/S=500U/g、E/S=1000U/g、E/S=5000U/g、E/S=10000U/g、E/S=15000U/g、E/S=20000U/g的风味酶，酶解10h后，95℃灭酶15min，冷却后5000r/min、4℃离心10min，测定上清液中游离氨基酸总量和谷氨酸含量，风味酶的最佳加酶量为E/S=1000U/g。

[0016] （5）自溶酶解同时进行和先后进行过程的选择：氨肽酶和中性蛋白酶的复配酶在自溶初始加入，或自溶26h后加入，再酶解10h后，95℃灭酶15min，冷却后5000r/min、4℃离心10min，测定上清液中游离氨基酸总量和谷氨酸含量，通过比较，两者的游离氨基酸含量和谷氨酸含量相当。所以选择自溶酶解同时进行的过程。

[0017] （6）自溶酶解同时进行酶解时间的选择：在4～30h的范围内，每隔4h取样，测定上清液中氨基氮的含量，最佳酶解时间为24h。

[0018] C 在最佳的自溶酶解条件下，单独自溶、复配酶以及诺维信风味蛋白酶的比较[0019] （1）称取8.5g活性干酵母粉溶于100mL蒸馏水，加入2g食盐，分别加入E/S=1000U/g的风味酶，或氨肽酶（E/S=774U/g）和中性蛋白酶（E/S=28U/g）的复配酶，以及不加入蛋白酶。在55℃，自然pH条件下，放入摇床中，150rpm振荡自溶24h。

[0020] （2）95℃灭酶15min，冷却后5000r/min、4℃离心10min，测定上清液中游离氨基酸含量和主要呈味氨基酸的含量以及肽分子量分布。

[0021] 加入诺维信风味酶后，酶解后的上清液中游离氨基酸的总含量为11.5494mg/mL，主要呈味氨基酸：谷氨酸的含量为1.8412 mg/mL，甘氨酸的含量为0.4896mg/mL，天冬氨酸的含量为0.4515mg/mL，丙氨酸的含量为1.3726mg/mL，上清液中分子量小于500Da的肽占总肽量的84.67%。

[0022] 加入复配酶后，酶解后的上清液中游离氨基酸的总含量为11.7325mg/mL，主要呈味氨基酸：谷氨酸的含量为1.7204mg/mL，甘氨酸的含量为0.5254mg/mL，天冬氨酸的含量为0.5363mg/mL，丙氨酸的含量为1.4345mg/mL，上清液中分子量小于500Da的肽占总肽量的81.56%。

[0023] 单独自溶后（不加酶），酶解后的上清液中游离氨基酸的总含量为5.1831mg/mL，主要呈味氨基酸：谷氨酸的含量为0.8513mg/mL，甘氨酸的含量为0.2444mg/mL，天冬氨酸的含量为0.3181mg/mL，丙氨酸的含量为1.0830mg/mL。

[0024] 固体氨肽酶的酶活

[0025] LNA法测定。测定时，首先配Tris-HCl缓冲液，取6.075gTris溶于900mL蒸馏水，用浓HCl调至pH8.5，然后定容至1L。以L-亮氨酸对硝基苯胺 L-leu-pNA作为底物，取0.1g底物溶于1mL酒精，然后用Tris-HCl缓冲液定容到100mL。取0.1g固体氨肽酶粉用Tris-HCl缓冲液定容到100mL作为待测酶液。加入2mL的Tris-HCl缓冲液和1mL底物（L-亮氨酸对硝基苯胺 L-leu-pNA），一个加入1mL酶液，另一个加入1mL Tris-HCl缓冲液作为对照，在50℃水浴反应10min后，405nm比色测定酶活。

[0026] 酶活公式：酶活=A×105.7×4×n/10

[0027] 其中：A为待测酶液的吸光度；n为待测酶液的稀释倍数。

[0028] 酶活力定义：50℃，每分钟分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1微摩尔的对硝基苯胺所需酶量即为一个酶活单位。

[0029] 甲醛滴定法测定氨基氮含量。

[0030] 上清液固形物含量的测定：离心后取一定重量的自溶上清液烘干至恒重，测其固形物含量。

[0031] 氨基氮得率=（自溶后上清液氨基氮含量/自溶前酵母干重）×100%[0032] 固形物得率=[（自溶后上清液总重×上清液固形物含量—外加物质干重）/自溶前酵母干重］×100%，式中：外加物质指所加入的破壁酶、蛋白酶、自溶促进剂等。

[0033] 酶解酵母后酶解液中游离氨基酸的测定。氨基酸分析液相色谱仪(Ag1100)复配酶酶解后上清液中游离氨基酸的总含量从5.1831mg/mL提高到11.7325mg/mL,主要呈味氨基酸丙氨酸的含量从1.0830mg/mL提高到1.4345mg/mL，甘氨酸的含量从0.2444mg/mL提高到0.5254mg/mL，天冬氨酸的含量从0.3181mg/mL提高到0.5363mg/mL，谷氨酸的含量从0.8513mg/mL提高到1.7204mg/mL，结果如图1。

[0034] 酶解酵母酶解液中肽分子量分布的测定。Waters 600高效液相色谱仪（配2487紫外检测器和Empower工作站）。自制复配酶酶解后酶解液中分子量小于500Da的肽占总肽量的81.56%，如图4。诺维信风味蛋白酶酶解液中分子量小于500Da的肽占总肽量的84.67%，如图5。

[0035] 本发明的有益效果：实验所用的枯草芽孢杆菌固体氨肽酶是本课题组自行研制的，通过固体氨肽酶和中性蛋白酶复配酶解酵母后，酶解所得上清液中游离氨基酸的含量显著增加，呈味氨基酸的量也有大幅提高，鲜味增加，同时酶解后小分子量的肽含量增加，进一步提高了酵母抽提物的营养价值，经优化后，形成酵母抽提物的最佳制备工艺，比较后发现，中性蛋白酶和氨肽酶复配后的酶解效果与诺维信风味蛋白酶的酶解效果相当，具备在高端酵母抽提物制备工艺中应用的潜力。

附图说明

[0036] 图1添加复配酶的酵母酶解抽提液中游离氨基酸图谱；

[0037] 图2添加诺维信风味蛋白酶的酵母酶解抽提液中游离氨基酸图谱；

[0038] 图3酵母未加酶自溶后酶解抽提液中游离氨基酸图谱；

[0039] 图4添加复配酶的酵母酶解抽提液中肽分子量分布图谱；

[0040] 图5添加诺维信风味蛋白酶的酵母酶解抽提液中肽分子量分布图谱；

[0041] 图6酵母抽提物制备中蛋白酶复配加入工艺段示意图。

具体实施方式

[0042] 实施例 1

[0043] 将枯草芽孢杆菌Zj016发酵液在4℃，6000rpm离心10min收集2.5L发酵液，在4℃下加入(NH4)2SO4 500 g(边加边搅拌)，4℃，6000rpm离心10min，收集澄清液2.5L，选用50kDa的超滤膜进行浓缩到0.85L，流速30mL/min；选用30kDa的超滤膜脱盐后0.85L，流速40 mL/min，将浓缩脱盐液冷冻干燥后得到固体氨肽酶。得到的固体氨肽酶的酶活
5
为7×10U/g。称取8.5g活性干酵母粉溶于100mL蒸馏水，加入2g食盐，用中性蛋白酶和固体氨肽酶复配进行酶解，其中中性蛋白酶加入量为E/S=28U/g，固体氨肽酶加入量为E/S=774U/g，在55℃，自然pH条件下，放入摇床中，150rpm振荡自溶24h。95℃灭酶15min，冷却后5000r/min、4℃离心10min，此时沉淀为酵母菌体，上清液为多肽混合物。酶解后上清液中分子量小于500Da的肽占总肽量的81.56%，并且游离氨基酸的总含量从5.1831mg/mL提高到11.7325mg/mL,主要呈味氨基酸：丙氨酸的含量从1.0830mg/mL提高到1.4345mg/mL，甘氨酸的含量从0.2444mg/mL提高到0.5254mg/mL，天冬氨酸的含量从0.3181mg/mL提高到0.5363mg/mL，谷氨酸的含量从0.8513mg/mL提高到1.7204mg/mL。

[0044] 实施例2

[0045] 将枯草芽孢杆菌Zj016发酵液在4℃，6000rpm离心10min收集2.5L发酵液，在4℃下加入(NH4)2SO4 500 g(边加边搅拌)，4℃，6000rpm离心10min，收集澄清液2.5L，选用50kDa的超滤膜进行浓缩到0.85L，流速35mL/min；选用30kDa的超滤膜脱盐后0.85L，流速40 mL/min，将浓缩脱盐液冷冻干燥后中得到固体氨肽酶。得到的固态氨肽酶的酶活
5
为7×10U/g。称取8.5g活性干酵母粉溶于100mL蒸馏水，加入2g食盐，用中性蛋白酶和固体氨肽酶复配进行酶解，其中中性蛋白酶加入量为E/S=20U/g，固体氨肽酶加入量为E/S=800U/g，在55℃，自然pH值条件下，放入摇床中， 150rpm振荡自溶24h。95℃灭酶15min，冷却后5000r/min，4℃离心10min，游离氨基酸的总含量达到11.0738mg/mL，主要呈味氨基酸：丙氨酸的含量达到1.4015mg/mL，甘氨酸的含量达到0.5184mg/mL，天冬氨酸的含量达到0.5000mg/mL，谷氨酸的含量达到1.7018mg/mL。