一种羰基还原酶及其基因和在不对称还原羰基化合物中的应用

摘要

本发明公开了一种新的羰基还原酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶及其制备方法，以及该重组酶作为催化剂在不对称还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯等前手性羰基化合物制备手性醇中的应用。本发明的羰基还原酶基因来源于光滑假丝酵母，可作为催化剂应用于(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯等多种光学活性手性醇的制备。与其他制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法相比，本方法催化制备的产物浓度高，不需要额外添加昂贵的辅酶，且产物光学纯度高，反应条件温和，操作简便，易于放大，因此在普利类降压药物中间体的生产中具有很好的工业应用前景。

权利要求

1.一种如序列表中SEQ ID NO.2所示氨基酸组成的羰基还原酶作为催化剂在不对称还原前手性羰基化合物制备手性醇中的应用，其特征在于，所述的前手性羰基化合物为如式

1、2或3所示的前手性羰基化合物：

式1 式2 式3

其中，R1为-CH3、-C6H5、o-Cl-C6H4-或-(CH2)2C6H5；

R2为-CH3或-CH2CH3；

R3为-CH2CH3、-CH2Cl、-CH2Br或-CF3；

R4为-CH2Cl、-CH2Br或-CF3。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用按下述方法进行：在pH5.5-7.0的磷酸盐缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP+的存在下，在如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的羰基还原酶作用下，将前手性羰基化合物进行不对称还原反应，制得光学活性手性醇。

说明书

一种羰基还原酶及其基因和在不对称还原羰基化合物中的

应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及其重组酶和该重组酶的制备方法，该羰基还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯等前手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。

背景技术

[0002] (R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(分子式为C6H5(CH2)2CH(OH)COOCH2CH3，分子量为208.25，CAS号：90315-82-5)是合成多种血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)普利药物，如贝那普利、西拉普利等的重要手性砌块。该类药物主要用于治疗高血压、充血性心力衰竭等疾病。在抗高血压药物市场中，与非肽类血管紧张素II受体抑制剂、钙通道拮抗剂形成了三足鼎立的市场格局。国内对普利原料药需求旺盛，价格稳定，尤其是贝那普利等紧俏产品，主要依赖进口。因此，研究(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的手性合成具有广阔的应用前景。
(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的合成有化学法和生物法两种。与化学方法相比，生物法具有反应条件温和、高转化率、高对映体选择性等多种优点。生物法又包括动力学拆分法和不对称合成法。其中，不对称合成法由于可实现100％的理论产率，更受研究者的青睐。

[0003] 不对称合成法所研究的较多是用野生菌或重组工程菌的细胞或游离酶进行催化。在已报道的不对称合成方法中，底物浓度的最高水平是400mM(82g/L)，所用催化剂为预处理的面包酵母(Baker’s yeast)，但是反应48h后仅有41.9％的底物转化成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，且对映体过量值(ee)只有87.5％(Biocatal.Biotransfor.2009，
27，211-218)。很多其他报道可以达到高对映选择性的催化，但是生成的产物浓度一般都很低，不具备产业化的可行性。Zhang等用克鲁氏假丝酵母(Candida krusei SW2026)不对称还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，在底物浓度为2.5g/L时，ee值99.7％，分离得率95.1％。但当底物浓度提高到20g/L后，ee值降低到97.4％(Process Biochemistry 2009，44，1270-1275)。Lavandera等用重组醇脱氢酶催化还原5g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，ee值99％以上，但是需要外源添加1mM NADH(ChemSusChem 2008，1，431-436)。林文清等用筛选的博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)等，在水相和水/有机两相两相体系中，催化还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，产品ee值为84.9％-98.88％，然而该方法的产物浓度也不高，最高为50g/L(中国专利，公开号CN 101314784A)。

[0004] 以上方法仅限于实验室规模，且存在产物浓度不高，需要添加昂贵辅酶，以及反应时间长等缺陷，不适合用于工业化生产(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(一般要求产物浓度应在100g/L以上)。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是，针对已报道的生物催化不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的反应中酶催化活性偏低、底物耐受性差、产物浓度不够高，以及需要额外添加昂贵辅酶、反应时间长等问题，提供了一种催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好、反应时间短、无需额外添加辅酶的羰基还原酶，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及该羰基还原酶在催化还原其他酮类底物中的用途。特别地，将该酶用于(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的制备中，不仅催化反应时间短，而且不需要+额外添加昂贵的辅酶NADP 或NADPH。

[0006] 本发明通过下述技术方案以解决现有的生物法不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中存在的技术问题：

[0007] 本发明提供一种羰基还原酶，其是如下(a)或(b)的蛋白质：

[0008] (a)由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；

[0009] (b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有羰基还原酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

[0010] 该羰基还原酶来源于光滑假丝酵母(Candida glabrata)CGMCC 2.234。该还原酶通过基因组挖掘的方法获得，所设计的挖掘方法具体为，以来自Saccharomyces cerevisiae的三个还原酶YDL124w，YDR368w，YGL185c(均对2-羰基-4-苯基丁酸乙酯具有出色的立体选择性)的氨基酸序列做探针，在NCBI数据库中进行pBLAST搜索，选定一批预测的羰基还原酶，将所选的羰基还原酶进行克隆表达，构建重组大肠杆菌细胞。通过测定羰基还原酶活力和酶对2-羰基-4-苯基丁酸乙酯的立体选择性等，对所克隆的酶进行反复比较和筛选，最终获得催化性能最佳的羰基还原酶。

[0011] 根据本发明，SEQ ID No.2所示氨基酸序列的1个氨基酸残基的突变，如第220位的Asn突变为Asp所得的突变蛋白质具有羰基还原酶活性。

[0012] 本发明提供一种羰基还原酶基因，其是如下(1)或(2)的基因：

[0013] (1)由序列表中SEQ ID No.1所示核苷酸序列组成的基因；

[0014] (2)编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

[0015] (a)由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0016] (b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有羰基还原酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

[0017] 本发明的羰基还原酶基因来源于光滑假丝酵母(Candida glabrata)CGMCC2.234，具体制备方法可为：根据Genbank中收录的预测为还原酶的光滑假丝酵母(Candida glabrata)基因(Genebank登录号：CAG61069.1)序列设计合成引物，较佳的，上游引物为：
CGCGGATCCATGGTTAAGCAAGAATTCTTT；下游引物为：GTGAAGCTTTTAGGCCTTCTGGGACTCTGA；然后以光滑假丝酵母(Candida glabrata)CGMCC 2.234的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，获得完整的还原酶全长基因序列。

[0018] 本发明中，碱基序列如序列表中SEQ ID No.1所示的基因，命名为CgKR2，全长936bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第933个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

[0019] 由于密码子的简并性，编码SEQ ID No.2的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID No.1。另外，还可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对碱基序列SEQ ID No.1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。

[0020] SEQ ID No.1的同系物也指启动子变体。在所述的碱基序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。

[0021] SEQ ID No.1的同系物还指一种具有在标准条件下能够与SEQ ID No.1所示序列的多聚核苷酸进行杂交的碱基序列的多聚核苷酸。在标准条件下进行杂交可根据“分子克隆”中描述的方式进行：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，分子生物学中的通用方案(Current Protocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行，将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交。杂交缓冲液的组成为0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2～
8×SSC。20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液。杂交温度为50～70℃。在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜。清洗温度为室温，更优选为杂交温度。清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt％SDS。当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过在DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。

[0022] 本发明提供一种包含本发明的还原酶基因的核苷酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的还原酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的还原酶基因产物用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切，形成互补的粘性末端，同时将克隆载体和表达载体pET28a用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的还原酶基因的重组表达质粒pET-CgKR2。

[0023] 本发明提供一种包含本发明的还原酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体。其可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的还原酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)或大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α。将前述重组表达质粒pET-CgKR2转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-CgKR2。

[0024] 本发明提供一种重组还原酶的制备方法，其包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，获得重组还原酶。其中，所述的重组表达转化体同前述介绍，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物得到。其中，所述的培养重组表达转化体中所用的培养基可本领域任何可使转化体生长并产生本发明的还原酶的培养基，对于菌株，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并产生还原酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。对于菌株，优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌(优选E.coliBL21(DE3))接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5-0.7(优选0.6)时，在终浓度为0.1-1.0mmol/L(优选0.5mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组羰基还原酶。

[0025] 本发明提供一种新型的羰基还原酶作为催化剂，应用在不对称还原潜手性羰基化合物以制备光学活性手性醇。

[0026] 较佳的，所述的应用按下述方法进行：在pH 5.5-7.0的磷酸盐缓冲液中，在葡萄+糖脱氢酶、葡萄糖和NADP 的存在下，在本发明的还原酶或重组还原酶的作用下，将前手性羰基化合物进行不对称还原反应，制得光学活性手性醇。

[0027] 上述应用中，所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，优选如下：所述的前手性羰基化合物较佳的为α-酮酯或β-酮酯或芳基酮类化合物。本发明优选如式1、2、3所示的前手性羰基化合物：

[0028]

[0029] 式1 式2 式3[0030] 其中，

[0031] R1为烷基、苯基或带有取代基的苯基，取代基为卤素或烷基；

[0032] R2为烷基；

[0033] R3为烷基或卤代烷基；

[0034] R4为卤代烷基。

[0035] 优选的，

[0036] R1为C1-C8烷基、苯基或带有取代基的苯基，取代基为卤素或C1-C2烷基；

[0037] R2为C1-C2烷基；

[0038] R3为C1-C2烷基或卤代烷基，优选的，所述的卤素是Cl、Br或F；更优选的，R3为Cl、Br或F一至三取代甲烷。

[0039] R4为卤代烷基。优选的，所述的卤素是Cl、Br或F。更优选的，R4为Cl、Br或F一至三取代甲烷。

[0040] 更优选的，

[0041] R1为-CH3、-C6H5、o-Cl-C6H4-或-(CH2)2C6H5；

[0042] R2为-CH3或-CH2CH3；

[0043] R3为-CH2CH3、-CH2Cl、-CH2Br或-CF3；

[0044] R4为-CH2Cl、-CH2Br或-CF3。

[0045] 对于2-羰基-4-苯基丁酸乙酯：R1为-(CH2)2C6H5，R2为-CH2CH3，为本发明优选。

[0046] 所述的前手性羰基化合物在反应液中的浓度较佳的为1～15mmol/L(2-羰基-4-苯基丁酸乙酯为0.001～2mol/L)。本发明的还原酶用量为催化有效量，较佳的为0.01～4kU/L(以2-羰基-4-苯基丁酸乙酯作为底物时为0.01～240kU/L)。葡萄糖脱氢酶的用量较佳的为0.01～4kU/L(以2-羰基-4-苯基丁酸乙酯作为底物时为0.01～
240kU/L)。葡萄糖的用量较佳的为5～50g/L(以2-羰基-4-苯基丁酸乙酯作为底物时为+
5～540g/L)。NADP 的用量较佳的为0～1.0mmol/L。所述的磷酸盐缓冲液可为本领域常规磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.05～0.1mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述的不对称还原反应较佳的是在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度较佳的为20～35℃。所述的不对称还原反应的时间较佳的以反应完全为准。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取手性醇产物。

[0047] 本发明中，优选的，使用粗酶液做催化剂，需要加辅酶。如果用静息细胞做催化剂则不需要加辅酶，只需利用细胞内所含有的辅酶即可。

[0048] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

[0049] 本发明所用试剂和原料均市售可得。

[0050] 本发明的积极进步效果在于：本发明针对已经报道的生物催化不对称合成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的研究中存在产物浓度不高，需要额外添加昂贵辅酶等问题，提供了一种新的羰基还原酶及利用重组还原酶结合辅酶再生不对称还原2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，制备光学纯(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的方法。在催化浓度高达2mol/L(412g/L)的底物时，产物的光学纯度仍高达99％以上，且不需要额外添加昂贵的辅酶。相对于其它不对称还原制备方法，使用本发明方法制备所得的产物浓度高，不必额外添加昂+贵的辅酶NADP，且产物光学纯度高，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。

附图说明

[0051] 图1为基因CgKR2的PCR扩增电泳图谱，其中：1.DNA Marker(MarkerII，北京天根生化科技有限公司)；2～3.基因CgKR2的PCR扩增产物。

[0052] 图2为大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α/pET-CgKR2的菌液PCR扩增电泳图，其中，1.DNA Marker(Marker II，北京天根生化科技有限公司)；2～3.大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α/pET-CgKR2的菌液PCR扩增电泳图。

[0053] 图3为大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-CgKR2的菌液PCR扩增电泳图，其中，1.DNA Marker(Marker II，北京天根生化科技有限公司)；2～3.大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-CgKR2的菌液PCR扩增电泳图。

[0054] 图4为重组表达质粒pET-CgKR2的构建示意图。

[0055] 图5为重组还原酶CgKR2的聚丙烯凝胶电泳图。

具体实施方式

[0056] 本发明人分析一些基因组序列，在一些在生物信息学上被预测为还原酶基因的序列中将该候选基因分离出来，进行克隆表达，并验证其功能，从这些候选基因中发现了一个羰基还原酶基因，其可以高效的不对称催化还原前手性羰基化合物形成手性醇，从而完成了本发明。

[0057] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

[0058] 下列实施例中的材料来源为：

[0059] 光滑假丝酵母(Candida glabrata)CGMCC 2.234。

[0060] 表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。

[0061] E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

[0062] 实施例1～2过程如图4所示。

[0063] 实施例1还原酶基因的克隆

[0064] 根据Genbank收录的预测为光滑假丝酵母(Candida glabrata)还原酶的基因序列(Genebank登录号：CAG61069.1)为依据，设计PCR引物如下：

[0065] 上游引物：CGCGGATCCATGGTTAAGCAAGAATTCTTT；

[0066] 下游引物：GTGAAGCTTTTAGGCCTTCTGGGACTCTGA。

[0067] 其中，上游引物下划线部分为BamHI酶切位点，下游引物下划线部分为HindIII酶切位点。

[0068] 以光滑假丝酵母(Candida glabrata)CGMCC 2.234的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 10μl，上游引物和下游引物各1μl(0.3μmol/L)，DNA模板1μl(0.1μg)和ddH2O 7μl。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)94℃，变性1min；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1.5min；步骤(2)～(4)重复30次；
(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收900～1200bp区间的目标条带(图1)。获得一条完整的光滑假丝酵母(Candida glabrata)CGMCC 2.234的还原酶全长基因序列，经DNA测序，全长936bp，命名为CgKR2，其碱基序列如序列表中SEQ ID No.1。

[0069] 实施例2重组表达载体(质粒)和重组表达转化体的制备

[0070] 将实施例1所得的还原酶基因DNA片段在37℃用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切12h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经BamHI和HindIII酶切后的质粒pET28a，在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET-CgKR2。

[0071] 将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌(E.coli)DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆(图2)。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)/pET-CgKR2，菌落PCR验证阳性克隆(图3)。

[0072] 实施例3重组还原酶的表达

[0073] 将实施例2所得的重组大肠杆菌，接种至含氨苄青霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于pH 7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组还原酶的粗酶液。粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析(图5)，重组蛋白以部分可溶的形式存在。

[0074] 实施例4重组还原酶和葡萄糖脱氢酶活力的测定

[0075] 通过检测340nm处吸光值变化的方式，利用分光光度计测定还原酶和葡萄糖脱氢酶的活力。还原酶活力测定方法如下：于1ml反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 6.0)中，加入2mmol/L 2-羰基-4-苯基丁酸乙酯，0.1mmol/L NADPH，30℃保温2分钟后加入实施例3制备的适量粗酶液，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。葡萄糖脱氢酶活力测定方法如下：于1ml反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0)中，加入10mmol/L葡萄糖，+1mmol/L NADP，30℃保温2分钟后加入实施例3制备的适量粗酶液，迅速混匀，检测340nm
3
处吸光值的变化。酶活力的计算公式为：酶活力(U)＝EW×V×10/(6220×l)；式中，EW为
1min内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位mL；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位L/(mol·cm)；l为光程距离，单位cm。每单位还原酶的定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol NADPH氧化所需的酶量。每单位葡萄糖脱氢酶的定义为在上述条件下，每分+
钟催化1μmol NADP 还原所需的酶量。

[0076] 实施例5-16重组还原酶CgKR2催化羰基化合物的不对称还原

[0077] 在0.4ml磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)中加入2U实施例3制备的粗酶液CgKR2和2U的葡萄糖脱氢酶粗酶液(制备方法参见：Journal ofIndustrial Microbiology and Biotechnology 2011，38，633-641)，分别加入终浓度为10mmol/L的酮酯或芳基酮(实+施例5-16)，以及终浓度为0.5mmol/L的NADP 和50g/L的葡萄糖。在30℃，1100rpm振荡反应12h。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜后分析测定底物转化率和还原产物的ee值。结果见表1。

[0078] 产物ee值的具体分析条件如下：

[0079] 实施例5及10-16使用气相色谱仪进行分析，色谱柱为手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB，以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，其他条件如下：

[0080] 实施例5：柱温80℃；

[0081] 实施例10：初始柱温90℃维持2min后，以1℃/min的速率升温至120℃，维持5min；

[0082] 实施例11-12：反应产物乙酰化后进行分析，初始柱温110℃，维持2min后，以2℃/min的速率升至126℃，维持2min；

[0083] 实施例13：柱温120℃；

[0084] 实施例14：柱温130℃；

[0085] 实施例15-16：柱温140℃；

[0086] 实施例6-7使用液相色谱分析手性，手性OD-H柱，流动相：正己烷/异丙醇/三氟乙酸＝94/6/0.2，流速1ml/min，检测器波长228nm。

[0087] 实施例8-9使用液相色谱分析手性，手性OD-H柱，流动相：正己烷/异丙醇＝97/3，流速1ml/min，检测器波长254nm。

[0088] 表1.CgKR2催化羰基化合物不对称还原反应的结果

[0089]

[0090]

[0091] 实施例17-18CgKR2催化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯的不对称还原

[0092] 在10ml磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 6.0)中加入1200U的实施例3制备的CgKR2静息细胞和1200U的葡萄糖脱氢酶粗酶液(实施例17)或2400U的CgKR2静息细胞和2400U的葡萄糖脱氢酶粗酶液(实施例18)，分别加入终浓度为1mol/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯和270g/L的葡萄糖(实施例17)或2mol/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯和540g/L的葡萄糖(实施例18)。反应在30℃下进行，pH控制为6.0，反应至反应完全为止，即反应产物的量不再发生变化，此时反应时间实施例17为6小时，实施例18为24小时。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB)分析测定底物转化率和还原产物的ee值。具体分析条件为：以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，柱温160℃。结果见表2。

[0093] 表2.CgKR2催化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯不对称还原的结果

[0094]

[0095] 实施例19

[0096] 将实施例1所得的光滑假丝酵母CGMCC 2.234的还原酶全长基因序列(SEQ ID No.1)进行碱基突变。为5个碱基的突变，分别是将光滑假丝酵母CGMCC 2.234的还原酶基因编码序列的第303位的A突变为C，第399位的A突变为G，第555位的A突变为G，第654位的C突变为T，第658位的A突变为G，从而得到的突变基因的序列如SEQ ID No.3所示。其编码的氨基酸序列出现了1个氨基酸残基的突变，突变后的氨基酸序列为SEQ IDNo.4，即将光滑假丝酵母CGMCC 2.234的还原酶(SEQ ID No.2)的第220位的Asn突变为Asp。
该突变基因进行如实施例2所述的方法制备重组突变酶。该突变酶按照实施例3的方法制备静息细胞和粗酶，按照实施例5-18相同的条件(只有还原酶不同)进行反应，可达到完全相同的效果。

[0097] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。