大豆食心虫18srDNA基因及其应用转让专利
申请号 : CN201110372645.4
文献号 : CN102492688B
文献日 : 2013-02-13
发明人 : 孟凡立 , 王志坤 , 韩英鹏 , 李文滨
申请人 : 东北农业大学
摘要 :
本发明涉及植物基因工程领域，提供了一种大豆食心虫18srDNA基因，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。体外合成大豆食心虫18srDNA基因的dsRNA，利用显微注射技术将大豆食心虫18srDNA基因dsRNA导入到一龄末大豆食心虫幼虫体内，结果证明：注射18srDNA的dsRNA能够引起大豆食心虫幼虫体内18srDNA基因沉默从而对大豆食心虫幼虫的生长发育产生影响，甚至导致大豆食心虫幼虫的死亡。该基因可以作为靶基因用于构建RNAi表达载体，用于培育高抗大豆食心虫大豆种质。
权利要求 :
1.一种大豆食心虫18srDNA，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
2.含有权利要求1所述大豆食心虫18srDNA的RNAi植物表达载体pJawoh18-18srDNA RNAi。
3.权利要求1所述大豆食心虫18srDNA在提高大豆抗食心虫能力中的应用。
4.权利要求2所述含有大豆食心虫18srDNA的RNAi植物表达载体pJawoh18-18srDNA RNAi在提高大豆抗食心虫能力中的应用。
5.一种提高大豆抗食心虫能力的方法，将权利要求2所述含有大豆食心虫18srDNA的RNAi植物表达载体pJawoh18-18srDNARNAi导入大豆组织或细胞，得到食心虫抗性提高的大豆。
说明书 :
大豆食心虫18srDNA基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种大豆食心虫18srDNA基因及其应用。
背景技术
[0002] 大豆食心虫（Leguminivora glycinivorella(Mats.Obraztsov))是我国东北大豆产区发生最严重的一种虫害，主要是幼虫蛀入豆荚危害豆粒。一般年份虫食率10%～20%，重害年份30%～40%，个别年份超过50%以上。造成被害豆粒不完整或破粒，降低大豆产量和品质。黑龙江是我国大豆之乡，大豆种植面积占全国的33.2%，占东北的64%，总产量占全国的37.3%，在我国大豆生产中起着举足轻重的作用。但近年来由于气候变化和“豆麦产区”小麦种植面积逐年减少，重迎茬大豆种植比例逐渐增加，致使大豆食心虫发生加重。据黑龙江省植保站统计2009年黑龙江省大豆食心虫的发生面积为1720.5万亩；2010年大豆食心虫的发生面积为1383.7万亩。黑龙省每年大豆种植面积都在6000万亩左右，接近1/3大豆田遭受不同程度的害虫侵害，不仅使大豆田严重减产，而且降低大豆商品质量使大豆优质率只有50%-60%，严重影响其在国际市场的竞争力。为了减少害虫对大豆产量和品质的危害，以黑龙江为例，豆农每年至少使用2次化学杀虫剂对大豆食心虫和草地螟进行防治。现在使用的化学杀虫剂都是广谱性杀虫剂，不仅杀死目标昆虫，而且杀死有益昆虫，同时化学杀虫剂在自然界可以长期存在，在土壤和河流中逐渐积累，破坏土壤和河流的生态环境；化学杀虫剂还可以通过食物链进入人体，诱发致畸、致癌、严重损害人体健康。因此各种不必利用化学农药来防治大豆害虫的方法日益受到重视。转苏云金杆菌（Bacillusthuringiensis，简称Bt）抗虫基因虽为害虫防治一度带来了希望，并在抗虫棉的应用上获得了举世瞩目的成果。培育抗大豆食心虫的大豆品种的传统育种方法虽然有效，但周期长，效率低。所以，现在需要建立一种防治大豆食心虫的新方法，能够更精确、更高效的控制大大豆食心虫，加快我国抗大豆食心虫育种研究速度。
[0003] RNA干扰是利用外源导入或转录载体在体内转录的双链RNA介导受体细胞中的序列特异的同源性mRNA发生降解或翻译受阻，引发受体细胞产生转录后基因沉默，使与此相应的内源靶基因的表达被阻抑，从而得到类似于“基因敲除”的基因阻抑效果。显微注射法是RNAi研究中最广泛使用的dsRNA导入方法，该方法在蟋蟀G.bimaculatus、拟谷盗Tribolium castaneum、家蚕Bombyx mori、甜菜液蛾S.exigua、褐飞虱Nilaparvata lugens等昆虫中均取得成功。但显微注射法dsRNA方法只能用于研究昆虫基因功能，不能采用该方法在田间对害虫进行防控。如果利用植物表达与昆虫生长关键基因匹配的dsRNA分子，当昆虫取食这类植物后，将这些dsRNA摄入体内，在昆虫体内发生RNA干扰现象，使关键基因的表达被明显抑制，从而达到控制害虫的目的。这就是利用RNA干扰技术防治害虫的基本过程。RNA干扰利用的是基因片段，在转录后诱导相应靶基因沉默，与常规转抗虫基因相比，RNA干扰介导的昆虫基因沉默不产生新的蛋白质，具有更高的生物安全性。由于该方法具有高效、特异、安全等特点，被认为是一种非常具有前途的控制害虫的新方法，能够更好的防治那些以农作物为食、影响农作物产量的害虫，是农作物害虫防御领域的突破。而且，目前国内外尚无利用RNA干扰防治大豆食心虫的报道。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种编码大豆食心虫18srDNA的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
[0005] 本发明的第二个目的在于提供一种含有大豆食心虫18srDNA基因的载体。
[0006] 本发明的第三个目的在于提供大豆食心虫18srDNA基因在提高大豆抗食心虫能力中的应用。
[0007] 本发明的第四个目的在于提供一种提高大豆抗食心虫能力的方法，将大豆食心虫18srDNA基因导入大豆组织或细胞，得到食心虫抗性提高的大豆，所述大豆食心虫18srDNA基因的核苷酸序列如如SEQ ID NO：1所示。
[0008] 所述大豆食心虫18srDNA基因通过含有所述大豆食心虫18srDNA基因的载体导入植物组织或细胞。
[0009] 本发明的技术路线为：
[0010] 1）利用分子生物学方法克隆大豆食心虫18srDNA基因；
[0011] 2）体外合成大豆食心虫18srDNA基因的dsRNA，利用显微注射技术将大豆食心虫18srDNA基因dsRNA导入到一龄末大豆食心虫幼虫体内，结果证明：注射18srDNA的dsRNA能够引起大豆食心虫幼虫体内18srDNA基因沉默从而对大豆食心虫幼虫的生长发育产生影响，甚至导致大豆食心虫幼虫的死亡。
[0012] 本发明克隆了一种大豆食心虫18srDNA基因，体外合成大豆食心虫18srDNA基因的dsRNA，利用显微注射技术将大豆食心虫18srDNA基因dsRNA导入到一龄末大豆食心虫幼虫体内，结果证明：注射18srDNA的dsRNA能够引起大豆食心虫幼虫体内18srDNA基因沉默从而对大豆食心虫幼虫的生长发育产生影响，甚至导致大豆食心虫幼虫的死亡。该基因可以作为靶基因用于构建RNAi表达载体，用于培育高抗大豆食心虫大豆种质。
附图说明
[0013] 图1大豆食心虫18srDNA基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，M：DL2000DNA分子量标准，1：18srDNA的PCR产物；
[0014] 图2根据昆虫18SrDNA序列用相邻连接(NJ)法构建系统发生树；
[0015] 图318SrDNA在大豆食心虫不同发育阶段的表达模式；
[0016] 图418SrDNA在大豆食心虫不同组织的表达模式；
[0017] 图518srDNA体外合成的dsRNA电泳检测结果图，a)M：DNA分子量标准；1-3：18srDNA的dsRNA；
[0018] 图6注射不同浓度18srDNA dsRNA对大豆食心虫幼虫死亡率的影响；
[0019] 图7注射不同浓度dsRNA对大豆食心虫幼虫18srDNAmRNA表达水平的影响；
[0020] 图8注射18rDNA dsRNA对大豆食心虫幼虫死亡率的影响；
[0021] 图9注射18rDNA dsRNA对大豆食心虫幼虫体重的影响；
[0022] 图10注射18rDNA dsRNA对大豆食心虫幼虫发育的影响；
[0023] 图1118SrDNA目的片段的PCR扩增产物；
[0024] 图12(a)BP反应的PCR鉴定结果，M:DNA标准；1-3BP转化子PCR扩增产物；4:ddH2O；
[0025] 图12(b)LR反应的PCR鉴定结果,M:DNA标准；1-4intronA和引物6PCR扩增产物；
[0026] 图13RNAi植物表达载体pJawoh18-18SrDNA RNAi的构建流程图。
具体实施方式
[0027] 以下结合具体实施例对本发明的技术路线做进一步详细说明。
[0028] 实施例1大豆食心虫18srDNA基因克隆及序列分析
[0029] 根据文献报道的6个昆虫的18srDNA基因的全序列，利用DNAMAN软件进行分析，设计了覆盖了18SrDNA的全部序列的2个特异引物：
[0030] 18srDNA引物1:5-T(AC)CCTCGT(GT)GATCCTGCCAGT-3′；
[0031] 18srDNA引物2:5-CATCCTTC(CT)GCAGGTTCACCT-3′。
[0032] 以大豆食心虫基因组为模板进行PCR的扩增，95℃5min，57.1℃1.0min，72℃2.0min，30循环，最后72℃延伸10min。用引物1和引物2进行PCR反应，从大豆食心虫基因组模板获得扩增产物，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，将产物进行测序，得到全长的大豆食心虫18SrDNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示，该序列长度为1825bp。
[0033] 同源序列比较发现，该序列与Cacoecimorpha pronubana(AJ830747)、；Galleria mellonella（AF286298）、；X.vesparum（X77784）、；P.dominulus（X77785），分别为95.1%、94.8%、81.66%和80.94%。采用MEGA4.0软件使用相邻连接法NJ(neighbor-joining method)构建系统进化树，结果表明大豆食心虫18SrDNA（Leguminivora glycinivorella）和大蜡螟（Galleria mellonella）、荷兰石竹卷蛾（Cacoecimorpha pronubana）等鳞翅目的亲缘关系较近分布在同一分支，与捻翅目X.vesparum和膜翅目马蜂（P.dominulus）亲缘关系较远则处于不同分支。系统发生树（图2）中的各种生物的氨基酸序列来源于GenBank非冗余的数据库，左下方标尺为0.1进化距离单位，树枝的长度与遗传距离成比例，由氨基酸的替换计算所得，每个分枝上的数字表示1000次重复性随机抽样实验中支持该分枝的百分比。
[0034] 实施例2大豆食心虫18srDNA基因的表达模式分析
[0035] 为了确定大豆食心虫18srDNA基因在大豆食心虫不同发育时期和大豆食心虫幼虫不同组织的表达情况，从7月末8月初大豆田间出现大豆食心虫成虫开始，收集卵、幼虫、蛹、成虫四个时期的大豆食心虫样品，收集的虫样分别放入无Rnase的EP管后立即在液氮中冷冻，放入-80℃的低温冰箱中保存。每个试验重复3次。选取大豆食心虫3-4龄幼虫进行解剖，剖取的神经节、表皮、唾腺、中肠、卵巢、睾丸和脂肪体7个组织分别放入无Rnase的EP管后立即在液氮中冷冻，放入-80℃的低温冰箱中保存。每个试验重复3次。利用Trizol reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA)提取大豆卵、幼虫、蛹、成虫四个时期和神经节、表皮、唾腺、中肠、卵巢、睾丸和脂肪体7个组织的总RNA,利用采用Fermentas公司M-MLV反转录酶合成cDNA第一链.以cDNA为模板，利用RT-PCR和荧光定量PCR对结果表明18SRDNA mRNA的表达情况进行检测。荧光定量PCR按照TOYOBO公司SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-的程序进行。荧光定量PCR反应中所使用的基因及其引物如下：
[0036] actin-s:5′GGCGACATAGCACAGCTTCTC 3′
[0037] actin-a:5′ATCCTCCGTCTGGACTTGGC3′
[0038] 18S-s:5GACTCAACACGGGAAATCTCACC ′3′
[0039] 18S-a:5′CAGACAAATCGCTCCACCAACT3′
[0040] 为了确定大豆食心虫18srDNA基因在大豆食心虫不同发育时期和大豆食心虫幼虫不同组织的表达情况，利用RT-PCR和荧光定量PCR对结果表明18srDNA mRNA的表达情况进行检测，结果表明18srDNAmRNA在各发育阶段均表达，包括卵、幼虫、蛹、成虫四个时期（图3）；成虫期18srDNAmRNA的表达量最高，4龄幼虫、蛹、1龄幼虫的表达量较高，2龄幼虫和3龄幼虫幼虫表达量较低，卵中表达量最低。同时，选取4龄幼虫进行解剖，取神经节、表皮、唾腺、中肠、卵巢、睾丸和脂肪体7个组织用上述引物检测，结果发现18srDNAmRNA在这7个组织中均有表达，其中神经节、脂肪体和睾丸的相对表达量较高，其它4个组织相对表达量较低（图4）。
[0041] 实施例3不同浓度大豆食心虫18srDNA dsRNA对大豆食心虫幼虫死亡率的影响[0042] 体外合成18srDNA的dsRNA
[0043] 将大豆食心虫18SrDNA序列利用DNAman软件和大豆的18SrDNA序列进行序列比较，选择保守性最低的大豆食心虫区域作为目标片段。根据T7RiboMAXTM Express RNAi System试剂盒(Promega,USA)设计如下引物：
[0044] 18ST7sense5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGTAGTTGCATTTGT-3’[0045] 18S antisese 5’-CCCACCTCGACACTCACT-3’
[0046] 18ST7antisense5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGCCCACCTCGACACTCACT-3’[0047] 18Ssense 5’-GCTCGTAGTTGCATTTGT-3’
[0048] 体外合成长度为189bp的18srDNA dsRNA，利用1.5%的琼脂糖检测dsRNA片段的大小。结果显示，合成的dsRNA与预期的结果一致，如图5所示。
[0049] 不同浓度18srDNA dsRNA对大豆食心虫幼虫死亡率的影响
[0050] 国内外的研究结果表明只有合适浓度的dsRNA才可以引起RNAi效果，因此本发明设计了5μg/μL（高浓度），2.5μg/μL（中浓度），0.5μg/μL（低浓度）的dsRNA进行试验，以期找到一个合适的抑制靶基因表达的浓度。利用显微注射技术将相同体积的靶基因3种浓度dsRNA和生理盐水分别导入到100条一龄末大豆食心虫幼虫体内，试验设3次重复。注射后的幼虫放入温度26℃，湿度80%，光照18h的人工气候箱内利用天然饲料豆荚进行饲养，72h后统计不同浓度的大豆食心虫幼虫的死亡率，提取注射相应处理组的总RNA，利用荧光定量PCR对靶基因的mRNA表达水平进行检测。
[0051] 从图6和图7可以看出，注射不同浓度18srDNA dsRNA均引起大豆食心虫幼虫的死亡，而且死亡率明显高于对照生理盐水，表明注射18srDNA dsRNA能够引起大豆食心虫幼虫体内18srDNA基因沉默从而对大豆食心虫幼虫的生长发育产生影响，甚至导致大豆食心虫幼虫的死亡。对不同浓度处理组幼虫18srDNA mRNA表达水平进行分析表明，中浓度处理组18srDNA mRNA的表达水显著低于高浓度和低浓度处理，而幼虫死亡率显著高于高浓度和低浓度处理，此因2.5μg/μL是抑制靶基因表达的最合适的注射浓度。
[0052] 注射18srDNAdsRNA对大豆食心虫生长发育的影响
[0053] 利用显微注射方法将2.5μg/μL 18srDNAdsRNA和生理盐水导入二龄大豆食心虫幼虫，放入温度26℃，湿度80%，光照18h的人工气候箱内利用人工饲料进行饲养，每天观察大豆幼虫死亡率、生长发育情况、称量幼虫的体重、挑选4头合适的幼虫放入-80度冰箱保存用于提取总RNA用于荧光定量PCR检测18srDNA mRNA的表达水平。实验结果表明：将18sdsRNA导入大豆食心虫幼虫体内12h后大豆食心虫幼虫的死亡率为29.4%，显著高于对照生理盐水8.5%的死亡率；到第10d注射18s dsRNA的大豆食心虫的累计死亡率为53.125%，注射生理盐水幼虫的死亡率是31.3%，注射18sdsRNA的大豆食心虫幼虫的死亡率显著高于与对照生理盐水（图8）；注射18sdsRNA存活的大豆食心虫幼虫平均体重明显低于注射生理盐水大豆食心虫幼虫的体重（图9）；而且注射18sdsRNA存活的大豆食心虫幼虫30%提前化蛹并羽化（图10），表明18srDNA基因是大豆食心虫生长发育关键基因而且可能在控制大豆食心虫幼虫的发育周期中起重要作用。
[0054] 大豆食心虫每年仅发生1代，以老熟幼虫在地下结茧越冬。翌年7月中、下旬向土表移动化蛹，7月下旬至8月初化为蛹盛期。8月上、中旬为羽化盛期。雌蛾喜产卵在有毛豆荚上。幼虫孵化后多从豆荚边缘合缝处蛀入。幼虫在豆荚内驱食豆粒直到发育成四龄老熟幼虫，9月中、下旬脱荚入土越冬。将18srDNA dsRNA注射大豆大豆食心虫体内后，不仅引起53.125%大豆食心虫死亡，存活的大豆食心虫幼虫不仅体重低于对照而且有部分提前化蛹并羽化。北方9月末温度较低，而且田间没有合适大豆食心虫成虫产卵的合适大豆荚，大豆食心虫成虫不能产卵变迅速死亡而减少对次年大豆生产的危害，具有重要的生态防治效应，因此大豆食心虫18rDNA基因片段可以作为靶基因片段用于构建植物RNAi表达载体。
[0055] 实施例418rDNA基因RNAi表达载体构建及大豆遗传转化
[0056] 核糖体蛋白18rDNA基因RNAi表达载体构建
[0057] 核糖体蛋白18rDNA基因RNAi表达载体构建流程参见图14，由于大豆转化效率较低，而且转化效率因基因型不同差别很大，所以在进行体外人工合成18rDNA的dsRNA的同时，利用introgen公司的Gateway技术构建高效植物表达载体构建，在设计扩增用于体外转录dsRNA的18SRDNA目的片段引物时，在引物上下游的5’端加上attb特异序列形成Gateway接头，引物具体如下：
[0058] 18rDNAattB1
[0059] 5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC GCTCGTAGTTGCATTTGT-3’
[0060] 18rDNAattB2
[0061] 5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTC CCCACCTCGACACTCACT-3’
[0062] 利用引物18rDNA attB1和引物18SNA attB2以大豆食心虫cDNA为模板进行PCR扩增，条件为：95℃5min，95℃1min，56℃1min，72℃2min，30循环；最后72℃延伸10min。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，产物约为198bp，将扩增产物利用DNA凝胶回收试剂TM
盒获得带Gateway接头的18SrDNA目的片段（图11）。利用introgen BP Clonase Enzyme Mix进行中间载体pDONR201和Gateway接头的18SDNA的片段的Bp连接反应，构建带有TM
18SDNA目的基因片段的入门克隆（pDONR201-18SrDNA）（图13），利用introgen LP Clonase Enzyme Mix将已构建好的入门克隆（pDONR201-18SrDNA）载体与植物RNAi表达载体pJawoh18-RNAi进行LP反应，构建了18SrDNA基因的RNAi植物表达载体pJawoh18-18SrDNA RNAi，PCR鉴定阳性的克隆转化子（图12a和12b），用冻融法将构建的载体转化农杆菌LBA4404感受态细胞。
盒获得带Gateway接头的18SrDNA目的片段（图11）。利用introgen BP Clonase Enzyme Mix进行中间载体pDONR201和Gateway接头的18SDNA的片段的Bp连接反应，构建带有TM
18SDNA目的基因片段的入门克隆（pDONR201-18SrDNA）（图13），利用introgen LP Clonase Enzyme Mix将已构建好的入门克隆（pDONR201-18SrDNA）载体与植物RNAi表达载体pJawoh18-RNAi进行LP反应，构建了18SrDNA基因的RNAi植物表达载体pJawoh18-18SrDNA RNAi，PCR鉴定阳性的克隆转化子（图12a和12b），用冻融法将构建的载体转化农杆菌LBA4404感受态细胞。
[0063] 大豆种子经氯气消毒处理，萌发培养7d后，将两片子叶从子叶节处纵向切开，保留2-3mm下胚轴，用解剖刀切去萌发的顶芽和侧芽，用带有植物表达RNAi载体pJawoh18-18SrDNA RNAi农杆菌浸染大豆子叶节，经ppT筛选得到T0抗性苗，利用18SrDNA基因特异性引物和pJawoh18-RNAi载体上intron特异性引物
[0064] 18ssense64 5’-TATCGTCGGTGAATCGTA-3’
[0065] intronanti431 5’-GTCGAGCTGTGGTTGGAGAAG-3’
[0066] 对T0代抗性苗进行PCR分子检测，获得PCR阳性4株系（DN50-18SrDNA-11，DN50-18SrDNA-26，DN50-18SrDNA-28，DN50-18SrDNA-40），18SrDNA植物表达RNAi载体整合到大豆中，获得表达豆食心虫18SrDNA dsRNA的转基因株系。
[0067] 实验例 转基因大豆抗食心虫性验证
[0068] 转基因后代材料抗食心虫鉴定在东北农业大学转基因中间试验基地进行防虫网室中进行。在防虫网室内种植稳转表达豆食心虫18SRDNAdsRNA T3代转基因株系（DN50-18SrDNA-26、N50-18SrDNA-28、N50-18SrDNA-40）和受体材料（东农50），每个品种种15盆，3次重复，随机排列。于8月上中旬(5～15日)大豆食心虫成虫发生盛期到田间捕蛾，进行网室内人工接虫。接虫密度20对/m2。每5天接虫一次，分早、中、晚三期接入，以增大成虫选择适宜豆荚产卵的机会。籽粒成熟后，每次重复随机取样10株，脱粒后调查虫食率。大豆抗虫性分级标准：虫食率≥30%为高感（HS）；30%＞虫食率≥20%为感虫（S）；20%＞虫食率≥13%为中度感虫（M）；13%＞虫食率≥9%为抗虫（R）；虫食率＜9%为高抗（HR）。
数据分析采用SAS8.02进行。结果如下：
数据分析采用SAS8.02进行。结果如下：
[0069] 表1 T2转基因大豆部分农艺性状及抗虫分析
[0070]
[0071] 对T2代转基因18SRDNA植物表达RNAi载体的农艺性状进行分析表明（表1），转基因材料农艺性状与受体亲本东农50无明显差异。其中DN50-18SrDNA-26、DN50-18SrDNA-28的虫食率与受体亲本东农50差异显著，抗虫级别提高了1个数量级。表明在这两个转基因材料中，外源的大豆食心虫18SrDNA基因的dsRNA已获得表达，转基因材料抗食心虫的能力显著提高。本研究培育的抗虫转基因材料不仅可以作为亲本材料，通过常规育种技术培育抗虫大豆新品种，同时，也可以直接形成品种并在生产中加以利用。