一种保持在体生理状态的原代呼吸道上皮细胞的培养基

摘要

本发明涉及人的局部活体部分的保存，具体涉及一种保持体外培养原代呼吸道上皮细胞在体生理状态的培养基，其特征在于，每升所述培养基由以下组分组成：DMEM/F12培养基12g，青霉素G钠盐30mg，链霉素50mg，胰岛素10mg，转铁蛋白5mg，表皮生长因子25μg，霍乱毒素100μg，氢化可的松108.741μg，牛垂体提取物1g，牛血清白蛋白3g，维甲酸1.5×10-2μg，庆大霉素50mg，两性霉素B0.5mg，胎牛血清50ml，其余为水。本发明培养基所培养的原代呼吸道上皮细胞具有纤毛摆动功能，可保持其在体生理状态。

权利要求

1.一种保持在体生理状态的原代小鼠呼吸道上皮细胞的培养基，其特征在于，每升所述培养基由以下组分组成：DMEM/F12培养基12g，青霉素G钠盐30mg，链霉素50mg，胰岛素

10mg，转铁蛋白5mg，表皮生长因子25μg，霍乱毒素100μg，氢化可的松108.741μg，牛垂-2体提取物1g，牛血清白蛋白3g，维甲酸1.5×10 μg，庆大霉素50mg，两性霉素B0.5mg，胎牛血清50ml，其余为水。

2.一种制备权利要求1所述培养基的方法，该方法由以下步骤组成：

按配比将青霉素、链霉素、胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、霍乱毒素、氢化可的松、牛垂体提取物、牛血清白蛋白、维甲酸、庆大霉素、两性霉素B和胎牛血清加入到DMEM/F12培养基中，加水至1升充分混匀，层流细胞培养室0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液即可。

说明书

一种保持在体生理状态的原代呼吸道上皮细胞的培养基

技术领域

[0001] 本发明涉及人的局部活体部分的保存，具体涉及原代呼吸道上皮细胞的培养基。

背景技术

[0002] 呼吸道上皮细胞构成了从鼻腔到终末细支气管的第一道天然屏障，是病原体经呼吸道侵入机体后产生炎症反应的主要起始部位。国内外大多采用A549，16HBE，BEAS-2B等细胞系复制呼吸道疾病的细胞模型，用以研究微生物感染和炎症反应等。然而A549，16HBE等这类细胞系本身来源于肿瘤细胞，或是如BEAS-2B由正常呼吸道上皮细胞与肿瘤细胞融合后而得到永生化成为细胞系，它们的生理特征与在体细胞差异较大，对呼吸道疾病的细胞学研究产生了一定的局限性。因此，原代培养呼吸道上皮细胞，并使其生理上接近在体状态，具有重要价值。

[0003] 呼吸道上皮细胞附着于基膜生长，共同构成呼吸道的假复层柱状纤毛上皮，其表面的纤毛有节律地向咽部运动，在机体排除呼吸道刺激性异物的过程中发挥了重要作用。基膜是上皮细胞基底面与深部的结缔组织之间的薄膜，由以下两部分组成：靠近上皮的部分成为基板，主要由黏连蛋白、胶原蛋白和硫酸肝素多糖等构成；与结缔组织相接的部分为网板。呼吸道与外界直接相通，使呼吸道上皮细胞有较多机会接触病原微生物，其生长微环境中存在着强大的抗感染生物因素。由于极易遭受外界刺激而损伤，为维持稳态，局部环境中富含一些刺激因子，它们均作用于呼吸道上皮细胞使其具备旺盛的自我更新能力。由于受这种特殊的生长条件限制，而现有的常规培养基未能够营造出适宜呼吸道上皮细胞生长的微环境，该种细胞原代培养较难。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是在于提供一种原代呼吸道上皮细胞的培养基，该培养基所培养的原代呼吸道上皮细胞具有纤毛摆动功能，保持其在体生理状态。

[0005] 本发明解决上问题的技术方案为：

[0006] 一种保持在体生理状态的原代呼吸道上皮细胞的培养基，其特征在于，每升所述培养基由以下组分组成：DMEM/F12培养基12g，青霉素G钠盐30mg，链霉素50mg，胰岛素10mg，转铁蛋白5mg，表皮生长因子25μg，霍乱毒素100μg，氢化可的松108.741μg，牛垂-2
体提取物1g，牛血清白蛋白3g，维甲酸1.5×10 μg，庆大霉素50mg，两性霉素B0.5mg，胎牛血清50ml，其余为水。

[0007] 上述方案中的DMEM/F12培养基为美国invitrogen公司生产的产品，其产品代号为12500-096，产品的组成成分见产品说明书。

[0008] 本发明所述的培养基的制备方法如下所述：

[0009] 按配比将青霉素、链霉素、胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、霍乱毒素、氢化可的松、牛垂体提取物、牛血清白蛋白、维甲酸、庆大霉素、两性霉素B和胎牛血清加入到DMEM/F12培养基中，加水至1升充分混匀，层流细胞培养室0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液即可。

[0010] 本发明所述的培养基中，DMEM/F12作为基础培养液构成了细胞生长发育的基本微环境；胰岛素可通过促进细胞摄取葡糖糖和氨基酸，从而促进细胞增殖分裂；转铁蛋白能够结合铁离子，减少其毒性和被细胞所利用，同时可以减少培养过程中成纤维细胞的数量；表皮生长因子对呼吸道上皮细胞有强烈的促分裂作用；牛垂体提取物含有多种促进细胞生长的成分，牛血清白蛋白则能够为包括表皮生长因子在内的多种生长因子提供载体，这些生长刺激物的存在，更有效地刺激了细胞的生长，提高了细胞的培养效果；霍乱毒素和维甲酸分别有促进细胞增殖分化和增强损伤修复的功能；氢化可的松能有助于呼吸道上皮细胞的生长发育；青霉素、链霉素、庆大霉素和两性霉素B共同构成了强大的防御屏障，对真菌、革兰氏阳性和阴性细菌都有强效抑制作用，减少了污染风险。上述各组分的联合作用，使培养的原代呼吸道上皮细胞具有纤毛摆动功能，保留了原代呼吸道上皮细胞的在体生理状态。

[0011] 国外认为血清会抑制呼吸道上皮细胞的生长，因此目前普遍采用无血清培养。而本发明人的研究结果恰恰相反，培养液中含有胎牛血清非但对呼吸道上皮细胞的生长没有抑制作用，反而在一定程度上有助于细胞贴壁。

[0012] 另外，采用本发明所述的培养基所培养的原代呼吸道上皮细胞生长活力良好。目前，市售的原代呼吸道上皮细胞价格昂贵，且多数都已丧失纤毛摆动的节律运动，说明其生理状态与在体水平相差较大。本发明克服了上述缺点，且配制简单，可重复性强，操作简单易行，便于推广应用。本发明为有关呼吸道上皮细胞的科研、教学、医学应用提供了有利的物质条件，具有广泛的推广价值。

附图说明

[0013] 图1为光学显微镜下连续拍摄的30张下述实施例所培养的原代呼吸道上皮细胞的全息照片。

具体实施方式

[0014] 一、制备培养基

[0015] 为了便于储存和实验操作，本实验将所购得化学试剂先配制成标准储存浓度，在合适的温度条件下长期保存，因此本例中所述培养基中各组分的用量除胎牛血清外均按所制成标准储存浓度来计算用量。具体制备过程如下所述：

[0016] 按下表1所示的储存浓度和用量取青霉素、链霉素、胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、霍乱毒素、氢化可的松、牛垂体提取物、牛血清白蛋白、维甲酸、庆大霉素、两性霉素B和胎牛血清加入到DMEM/F12培养基中，加水至100ml充分混匀，层流细胞培养室0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液即得100ml本发明所述的培养基。

[0017] 表1

[0018]

[0019] 二、培养原代呼吸道上皮细胞

[0020] 1、培养皿胶原包被

[0021] 使用前24h，按3.0mg/ml I型胶原∶60g/L的DMEM/F12∶0.5mol/LNaOH＝4ml∶1ml∶0.15ml的比例配制胶原混合溶液(胶原溶液偏酸，加入一定浓度的NaOH，调节pH值为7.2左右)。细胞培养24孔板冰上垂直放置30min，每孔滴加250μl胶原混合溶液，37℃孵育10min使其凝固；而后继续追加150μl胶原混合溶液，37℃孵育至少1h使底层胶表面平整，最后再加0.5ml步骤一所制得的培养基，制作完成，4℃保存备用。

[0022] 2.小鼠呼吸道上皮细胞的分离培养

[0023] 2.1 小鼠气管的分离

[0024] 取BALB/c小鼠经CO2窒息处死，将其固定于手术台上，翘起头部，在其胸腹部酒精消毒，注意保护口腔和鼻道，免受酒精刺激。无菌条件下延腹白线剪开皮肤，暴露腹主动脉，切开放血至流尽，其目的在于避免分离呼吸道上皮细胞时混入过多红细胞；钝性分离肌肉，暴露气管，并将其充分游离；穿双股5号手术线，在气管上下端各打一松结，在该上端的结上缘切口，穿空心导管，深入约5mm后，打紧原先的松结并将导管固定于气管内；在下端的结和气管分叉处之间剪断，取尽可能长的气管段，去除多余组织。

[0025] 2.2 气管组织的消化和红细胞的去除

[0026] 向导管内注入少许4℃预冷的0.05％链霉蛋白酶，灌洗气管内壁至洁净；结扎气管游离端，两端的线结确认牢固后，将0.05％链霉蛋白酶注满整段气管，并用动脉夹夹住对折的导管后，将整段气管固定浸润在DMEM/F12中，4℃孵育过夜(约12h)。第二天，收集消化液，并用5ml注射器吸取DMEM/F12冲洗气管，收集冲洗液约5ml；将消化液和冲洗液合并后转移至15ml离心管，并添加红细胞裂解液，1000r/min离心7min；去除上清液，然后用适量DMEM/F12充分重悬细胞。

[0027] 2.3 成纤维细胞的去除

[0028] 将重悬细胞接种于加有10ml步骤一所制得的培养基的无组织包被的10cm培养皿中。约1h后，成纤维细胞由于附着能力强，较呼吸道上皮细胞提前贴壁而被去除，该原理类似差速贴壁法，采用无组织包被的培养皿，更有利于细胞的分离纯化。

[0029] 2.4 呼吸道上皮细胞的原代培养

[0030] 当绝大多数成纤维细胞已经贴壁后，吸取上清液转移至步骤1胶原包被的24孔板中继续培养，此时应观察旧培养皿中的呼吸道上皮细胞是否被彻底转移，若没有，可用步骤4
一所制得的培养基反复清洗转移，再进行细胞计数，而后按每孔5×10 个细胞的密度播种到24孔板中。每天行换液处理，约7d左右细胞将达到较高的融合度，并出现纤毛摆动现象。

[0031] 本法所获细胞可继续传代培养3～4代，但是状态渐差，建议使用原代细胞进行实验。

[0032] 三、在体生理状态的检验

[0033] 将盛有步骤二所得到的培养原代呼吸道上皮细胞的培养板移至型号为ZEISS Axiovert 200m的高倍显微镜下可观察并拍摄动态影像。为便于实审程序中审查判断本发明的创造性，本发明人将所拍摄动态影像按40毫秒一张图片的间隔制作成时长为1200毫秒的视频供审查员参考(参见实审参考资料所提供的光盘)；同时本发明人将上述视频中所对应的30张图片制作30张全息照片(见说明书附图的图1)。由于单根纤毛属于呼吸道上皮细胞上的亚显微结构，在普通高倍镜下难以观察，并且只有当细胞融合程度较高时，才能产生定向摆动，故我们将大量纤毛的节律性运动所形成的条索影作为观察指标。由图1可观察到，培养的细胞随时间推移，由于受纤毛摆动影响，白色条索影有相应的变化。上述动态变化在实审参考资料所提供的视频中更加清晰，视频中可清楚地看到“珊瑚丛样”蠕动的条索影，此现象为大量的呼吸道上皮细胞纤毛成簇地节律性定向摆动所造成。上述结果说明，采用本发明所述培养基培养的原代呼吸道上皮细胞保留了其在体的生理状态。