一种利用石英晶体微天平检测DNA甲基化的方法

摘要

本发明公开了一种利用石英晶体微天平检测DNA甲基化的方法，该方法为：一、酶切消化待检测的DNA；二、PCR扩增；三、制备固定有探针分子的QCM芯片；四、将芯片用6-巯基-1-己醇孵育；五、将芯片装入石英晶体微天平的反应器中，向反应器中通入对照物，计算频率差值ΔF；六、将芯片装入石英晶体微天平的反应器中，向反应器中通入检测物，计算频率差值ΔF′，计算ΔF′与ΔF的差值的绝对值F，当F≥30Hz时判定待检测的DNA发生甲基化。本发明采用对质量变化灵敏的QCM与传统的甲基化酶切技术相结合，可有效区分DNA的甲基化状况，在检测过程中没有毒性试剂掺杂，检测速度快，效率高，重复性良好。

权利要求

1.一种利用石英晶体微天平检测DNA甲基化的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤一、酶切消化待检测的DNA，使所述待检测DNA中未发生甲基化的CCGG位点被打断；

步骤二、以步骤一中经酶切消化后的DNA为模板进行PCR扩增，得到终产物；

步骤三、根据待检测的DNA序列采用常规方法设计DNA探针分子，然后采用常规方法对DNA探针分子进行巯基修饰，将金基底的QCM芯片用巯基修饰后的DNA探针分子溶液孵育，得到固定探针分子的QCM芯片；

步骤四、将步骤三中所述固定有探针分子的QCM芯片用6-巯基-1-己醇孵育；

步骤五、将步骤四中孵育后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入DNA杂交缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1，然后向反应器中通入对照物，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F2，计算频率F1和频率F2的差值ΔF；所述DNA杂交缓冲液为磷酸钾盐与氯化钠的混合水溶液，其中磷酸钾盐为磷酸氢二钾和/或磷酸二氢钾，所述混合水溶液中钾离子的浓度为0.1M～

0.5M，氯化钠的浓度为0.5M～1.5M，混合水溶液的pH值为7.0～7.4；所述对照物为不含DNA模板的PCR扩增体系和DNA杂交缓冲液以1∶5～10的体积比混合而成；

步骤六、将步骤四中孵育后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入DNA杂交缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1′，然后向反应器中通入检测物，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F2′，计算频率F1′和频率F2′的差值ΔF′，最后计算ΔF′和步骤五中ΔF的差值的绝对值F，当F≥30Hz时判定待检测的DNA发生甲基化；所述DNA杂交缓冲液为磷酸钾盐与氯化钠的混合水溶液，其中磷酸钾盐为磷酸氢二钾和/或磷酸二氢钾，所述混合水溶液中钾离子的浓度为0.1M～0.5M，氯化钠的浓度为0.5M～1.5M，混合水溶液的pH值为7.0～7.4；所述检测物为PCR扩增终产物、DEPC水和DNA杂交缓冲液以1∶2～5∶3～5的体积比混合而成。

2.根据权利要求1所述的一种利用石英晶体微天平检测DNA甲基化的方法，其特征在于，步骤三中所述巯基修饰的DNA探针分子溶液的浓度为1μM～2μM。

3.根据权利要求1所述的一种利用石英晶体微天平检测DNA甲基化的方法，其特征在于，步骤三中所述孵育的时间为0.5h～2h。

4.根据权利要求1所述的一种利用石英晶体微天平检测DNA甲基化的方法，其特征在于，步骤四中所述6-巯基-1-己醇的浓度为0.5mM～5mM。

5.根据权利要求1所述的一种利用石英晶体微天平检测DNA甲基化的方法，其特征在于，步骤四中所述孵育的时间为0.5h～2h。

说明书

一种利用石英晶体微天平检测DNA甲基化的方法

技术领域

[0001] 本发明属于DNA检测技术领域，具体涉及一种利用石英晶体微天平检测DNA甲基化的方法。

背景技术

[0002] DNA甲基化的检测方法很多，主要可以分为基于化学修饰、DNA甲基化结合蛋白及甲基化敏感内切酶三大类，MSRE-PCR法是第三类甲基化敏感酶方法的代表，具体过程主要是：基因组DNA经甲基化敏感内切酶广泛消化后，再设计与所选基因CpG两侧序列匹配的特异性的引物，经多重PCR扩增，对照组不进行DNA酶切就扩增，两相比较即可同时、快速检测多基因的DNA甲基化状态。该法用很小量的DNA标本即可检测多基因的甲基化状态。这一检测方法具有成本低，操作简便的优势。QCM平台检测DNA甲基化的方法就是基于此方法基础上开发而成，结合MSRE-PCR的操作简便和QCM准确和灵敏度高的优势，能够快速准确的测定DNA某一段序列上的甲基化状况。

发明内容

[0003] 本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种检测速度快，效率高，重复性良好的利用石英晶体微天平检测DNA甲基化的方法。该方法采用对质量变化灵敏的QCM与传统的甲基化酶切技术相结合，可以有效地区分DNA的甲基化状况。

[0004] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种利用石英晶体微天平检测DNA甲基化的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

[0005] 步骤一、酶切消化待检测的DNA，使所述待检测DNA中未发生甲基化的CCGG位点被打断；

[0006] 步骤二、以步骤一中经酶切消化后的DNA为模板进行PCR扩增，得到终产物；

[0007] 步骤三、根据待检测的DNA序列采用常规方法设计DNA探针分子，然后采用常规方法对DNA探针分子进行巯基修饰，将金基底的QCM芯片用巯基修饰后的DNA探针分子溶液孵育，得到固定探针分子的QCM芯片；

[0008] 步骤四、将步骤三中所述固定有探针分子的QCM芯片用6-巯基-1-己醇孵育；

[0009] 步骤五、将步骤四中孵育后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入DNA杂交缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1，然后向反应器中通入对照物，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F2，计算频率F1和频率F2的差值ΔF；所述DNA杂交缓冲液为磷酸钾盐与氯化钠的混合水溶液，其中磷酸钾盐为磷酸氢二钾和/或磷酸二氢钾，所述混合水溶液中钾离子的浓度为0.1M～0.5M，氯化钠的浓度为0.5M～1.5M，混合水溶液的pH值为7.0～7.4；所述对照物为不含DNA模板的PCR扩增体系和DNA杂交缓冲液以1∶5～10的体积比混合而成；

[0010] 步骤六、将步骤四中孵育后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入DNA杂交缓冲液，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1′，然后向反应器中通入检测物，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F2′，计算频率F1′和频率F2′的差值ΔF′，最后计算ΔF′和步骤五中ΔF的差值的绝对值F，当F≥30Hz时判定待检测的DNA发生甲基化；所述DNA杂交缓冲液为磷酸钾盐与氯化钠的混合水溶液，其中磷酸钾盐为磷酸氢二钾和/或磷酸二氢钾，所述混合水溶液中钾离子的浓度为0.1M～0.5M，氯化钠的浓度为0.5M～1.5M，混合水溶液的pH值为7.0～7.4；所述检测物为PCR扩增终产物、DEPC水和DNA杂交缓冲液以1∶2～5∶3～5的体积比混合而成。

[0011] 上述步骤三中所述巯基修饰的DNA探针分子溶液的浓度为1μM～2μM。

[0012] 上述步骤三中所述孵育的时间为0.5h～2h。

[0013] 上述步骤四中所述6-巯基-1-己醇的浓度为0.5mM～5mM。

[0014] 上述步骤四中所述孵育的时间为0.5h～2h。

[0015] 本发明采用石英晶体微天平为检测工具，石英晶体微天平(Quartzcrystal microbalance，QCM)利用石英晶体的压电效应检测表面质量和厚度的微小变化。QCM被广泛应用于真空、气态和液相中。Sauerbrey方程提出QCM频率变化和单位面积上的质量变化成简单线性关系后，QCM在真空镀膜领域内得到广泛的应用。但是在液相条件下，Sauerbrey方程虽然继续成立但却局限于较小的检测厚度范围内，而实际上由于在液相条件下生物高分子的溶胀行为造成检测厚度远远高于这一范围，因此导致液相条件下QCM的使用变得复杂。本发明根据在液相高频振动情况下，固定于QCM表面的生物大分子能够带动周围的溶液一起振动，从而可将QCM芯片表面的致密分子层携带周围液体分子一起振动的情况视为芯片表面形成特殊“固化水”层，QCM频率变化取决于固化层的厚度和密度，液相条件下微小的厚度变化可以被高分子的溶胀行为放大，由此提出了QCM“固化水”模型。本发明通过DNA体系的验证，发现QCM频率1Hz的响应可测量QCM芯片表面0.18nm的厚度变化，使得液相条件下采用QCM检测生物高分子更加灵敏和简便易行。

[0016] 本发明与现有技术相比具有以下优点：

[0017] 1、本发明采用对质量变化灵敏的QCM与传统的甲基化酶切技术相结合，可以有效的区分DNA的甲基化状况，在检测过程中没有毒性试剂掺杂，检测速度快，效率高，重复性良好。

[0018] 2、本发明采用甲基化敏感的内切酶对被检测的DNA进行酶切，DNA甲基化的位点得以保留，未甲基化位点被切断，然后通过PCR将保留的完整序列扩增，而未甲基化序列被打断后无法扩增，随后将检测物通过固定有探针分子的QCM芯片进行检测，通过检测物频率变化与对照物频率变化的差值可直接判断待检测DNA序列是否甲基化。

[0019] 3、本发明适用于区分某一位点或若干位点的DNA甲基化，可以做精确的基因组上的甲基化定位，因而适合于基因水平的甲基化研究。

[0020] 下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

[0021] 图1为本发明实施例1的QCM检测图。

[0022] 图2为本发明实施例1的PCR终产物的电泳图。

[0023] 图3为本发明实施例2的QCM检测图。

[0024] 图4为本发明实施例2的PCR终产物的电泳图。

[0025] 图5为本发明实施例3的QCM检测图。

[0026] 图6为本发明实施例3的PCR终产物的电泳图。

具体实施方式

[0027] 实施例1

[0028] Hela细胞p16基因DNA甲基化检测：

[0029] 步骤一、酶切消化待检测的DNA：收集80％铺满的Hela细胞约100万个，采用天根试剂盒抽提基因组后，使用琼脂糖凝胶电泳验证基因组抽提成功；将基因组稀释100倍后，在DNA的稀释液10μL中加入5μL的10×FastDigest缓冲液和5μL的FastDigest HpaII酶，30μL DEPC水，37℃酶切消化5分钟后，于65℃下灭活10分钟；

[0030] 步骤二、PCR扩增：以步骤一中经酶切消化后的DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系如下：

[0031] GC缓冲液12.5μL

[0032] DEPC水9.5μL

[0033] 模板DNA 1μL

[0034] dNTP混合体系1μL

[0035] 引物(10μM)0.5μL

[0036] Tag DNA聚合酶0.25μL；

[0037] 扩增30个循环，PCR终产物浓度为80g/L；

[0038] 步骤三、设计DNA探针分子序列(SEQ ID NO.1)为：5′-TTT TTT TTTTTT TTT GCC CCT CCT CTT TCT TCC TC-3′，对DNA探针分子5′端进行巯基修饰，将金基底的QCM芯片用浓度为1μM的巯基修饰的DNA探针分子溶液孵育2h，得到固定有探针分子的QCM芯片；

[0039] 步骤四、将步骤三中所述固定有探针分子的QCM芯片用浓度为0.5mM的6-巯基-1-己醇孵育2h；

[0040] 步骤五、将步骤四中孵育后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入DNA杂交缓冲液(磷酸氢二钾与氯化钠的混合水溶液，混合水溶液中钾离子的浓度为0.1M，氯化钠的浓度为0.5M，混合水溶液的pH值为7.4)，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1，然后向反应器中通入对照物(不含模板的PCR扩增体系和DNA杂交缓冲液以1∶5的体积比混合而成)，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F2，计算频率F1和频率F2的差值ΔF(见图1)；

[0041] 步骤六、将步骤四中孵育后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入DNA杂交缓冲液(磷酸氢二钾与氯化钠的混合水溶液，混合水溶液中钾离子的浓度为0.1M，氯化钠的浓度为0.5M，混合水溶液的pH值为7.4)，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1′，然后向反应器中通入检测物(PCR扩增终产物、DEPC水和DNA杂交缓冲液以1∶2∶3的体积比混合而成)，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F2′，计算频率F1′和频率F2′的差值ΔF′(见图1)，计算ΔF′和步骤五中ΔF的差值的绝对值F，得到F为40Hz＞30Hz，判定Hela细胞p16基因DNA发生甲基化。

[0042] 图2是本实施例的PCR终产物的电泳图，图中1为本实施例酶切后的PCR终产物，2为以未进行酶切的Hela细胞基因组为模板得到的p16基因的PCR产物，3为分子量为1kb的DNA对照物，从图中可以看出，本实施例的Hela细胞p16基因DNA发生甲基化，与本发明方法检测的结果一致。

[0043] 实施例2

[0044] Hela细胞GALR2基因DNA甲基化检测：

[0045] 步骤一、酶切消化待检测的DNA：收集80％铺满的HepG2细胞100万个，采用天根试剂盒抽提基因组后，使用琼脂糖凝胶电泳验证基因组抽提成功；将基因组稀释100倍后，在DNA的稀释液10μL中加入5μL的10×FastDigest buffer和5μL的FastDigest HpaII酶，30μL DEPC水，37℃下酶切消化5分钟后，于65℃下灭活10分钟；

[0046] 步骤二、PCR扩增：以步骤一中经酶切消化后的DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系如下：

[0047] GC缓冲液12.5μL

[0048] DEPC水9.5μL

[0049] 模板DNA 1μL

[0050] dNTP混合体系1μL

[0051] 引物(10μM)0.5μL

[0052] Tag DNA聚合酶0.25μL；

[0053] 扩增30个循环，PCR终产物浓度为80g/L；

[0054] 步骤三、设计DNA探针分子序列(SEQ ID NO.2)为：5′-TTT TTT TTTTTT TAT CTC CCA GGG GTC CTC TTT TC-3′，对DNA探针分子5′端进行巯基修饰，将金基底的QCM芯片用浓度为2μM的巯基修饰的DNA探针分子溶液孵育0.5h，得到固定有巯基修饰的DNA探针分子的QCM芯片；

[0055] 步骤四、将步骤三中所述固定有探针分子的QCM芯片用浓度为5mM的6-巯基-1-己醇孵育0.5h；

[0056] 步骤五、将步骤四中孵育后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入DNA杂交缓冲液(磷酸二氢钾与氯化钠的混合水溶液，混合水溶液中钾离子的浓度为0.5M，氯化钠的浓度为1.5M，混合水溶液的pH值为7.2)，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1，然后向反应器中通入对照物(不含DNA模板的PCR扩增体系和DNA杂交缓冲液以1∶10的体积比混合而成)，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F2，计算频率F1和频率F2的差值ΔF(见图3)；

[0057] 步骤六、将步骤四中孵育后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入DNA杂交缓冲液(磷酸二氢钾与氯化钠的混合水溶液，混合水溶液中钾离子的浓度为0.5M，氯化钠的浓度为1.5M，混合水溶液的pH值为7.2)，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1′，然后向反应器中通入检测物(PCR扩增终产物、DEPC水和DNA杂交缓冲液以1∶5∶5的体积比混合而成)，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F2′，计算频率F1′和频率F2′的差值ΔF′(见图3)，计算ΔF′和步骤五中ΔF的差值的绝对值F，得到F为30Hz，判定Hela细胞GALR2基因DNA发生甲基化。

[0058] 图4是本实施例的PCR终产物的电泳图，图中1为分子量为1kb的DNA对照物，2为本实施例酶切后的PCR终产物，3为以未进行酶切的Hela细胞基因组DNA为模板扩增出GALR2基因的PCR产物，从图中可以看出，本实施例的Hela细胞GALR2基因DNA发生甲基化，与本发明方法检测的结果一致。

[0059] 实施例3

[0060] HepG2细胞GALR2基因DNA甲基化检测：

[0061] 步骤一、酶切消化待检测的DNA：收集80％铺满的HepG2细胞100万个，采用天根试剂盒抽提基因组后，使用琼脂糖凝胶电泳验证基因组抽提成功；将基因组稀释100倍后，在10μL DNA的稀释液中加入5μL的10×FastDigest buffer和5μL的FastDigest HpaII酶，30μLDEPC水，37℃下酶切消化5分钟后，于65℃下灭活10分钟；

[0062] 步骤二、PCR扩增：以步骤一中经酶切消化后的DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系如下：

[0063] GC缓冲液12.5μL

[0064] DEPC水9.5μL

[0065] 模板DNA 1μL

[0066] dNTP混合体系1μL

[0067] 引物(10μM)0.5μL

[0068] Tag DNA聚合酶0.25μL；

[0069] 扩增30个循环，PCR终产物浓度为60g/L；

[0070] 步骤三、设计DNA探针分子序列(SEQ ID NO.2)为：5′-TTT TTT TTTTTT TAT CTC CCA GGG GTC CTC TTT TC-3′，对DNA探针分子5′端进行巯基修饰，将金基底的QCM芯片用浓度为1.5μM的巯基修饰的DNA探针分子溶液孵育1h，得到固定有巯基修饰的DNA探针分子的QCM芯片；

[0071] 步骤四、将步骤三中所述固定有探针分子的QCM芯片用浓度为2mM的6-巯基-1-己醇溶液孵育1h；

[0072] 步骤五、将步骤四中孵育后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入DNA杂交缓冲液(磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和氯化钠的混合水溶液，混合水溶液中钾离子的浓度为0.3M，氯化钠的浓度为1M，混合水溶液的pH值为7.0)，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1，然后向反应器中通入对照物(不含DNA模板的PCR扩增体系和DNA杂交缓冲液以1∶8的体积比混合而成)，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F2，计算频率F1和频率F2的差值ΔF(见图5)；

[0073] 步骤六、将步骤四中孵育后的QCM芯片装入石英晶体微天平的反应器中，然后向反应器中通入DNA杂交缓冲液(磷酸二氢钾与氯化钠的混合水溶液，混合水溶液中钾离子的浓度为0.3M，氯化钠的浓度为1M，混合水溶液的pH值为7.0)，待基线平稳后，读取石英晶体微天平监测到的频率F1′，然后向反应器中通入检测物(PCR扩增终产物、DEPC水和DNA杂交缓冲液以1∶4∶4的体积比混合而成)，待石英晶体微天平频率变化曲线平稳后读取监测到的频率F2′，计算频率F1′和频率F2′的差值ΔF′(见图5)，计算ΔF′和步骤五中ΔF的差值的绝对值F，得到F为8Hz＜30Hz，判定HepG2细胞GALR2基因DNA没有发生甲基化。

[0074] 图6是本实施例的PCR终产物的电泳图，图中1为以未进行酶切的HepG2细胞基因组DNA为模板扩增得到的GALR2基因的PCR产物，2为本实施例酶切后的PCR终产物，3为分子量为1kb的DNA对照物，从图中可以看出，本实施例的HepG2细胞GALR2基因DNA没有发生甲基化，与本发明方法检测的结果一致。

[0075] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。