一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（MPT-NAG）的检测方法及试剂

摘要

本发明公开了一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法及试剂。本发明所述检测方法的测定原理为：测定试剂中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶(MPT)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖，反应中生成的MPT在205nm、270nm、340nm处有最大吸收，通过测定37℃反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出样品中MPT-NAG的含量。本方法所涉及的化学品均无毒、易得，符合发展绿色检测方法的要求，检测灵敏度高，线性、精密度好，结果准确，且操作简便快速，可用于各种类型的分析仪，满足大规模测定样本的要求。

权利要求

1.一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

1)配制含有MgCl2、EDTA·2Na、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶、聚乙二醇6000、乙二醇、蔗糖的pH4.0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液；

2)加入含MPT-NAG的待测样品，反应一段时间，试剂中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶(MPT)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖；

3)通过测定特定波长下溶液的吸光度值，计算出待测样品中MPT-NAG的含量；

步骤(1)中所述pH4.0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液的浓度为30-500mmol/L、MgCl2浓度为2-20mmol/L、EDTA·2Na浓度为0.5-10mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶浓度为5-20KU/L、聚乙二醇6000浓度为2-10g/L、乙二醇浓度为20-100ml/L、蔗糖浓度为

5-50g/L；步骤(2)中的反应条件为在37℃环境中反应5-10min；

3

样品中MPT-NAG的计算公式为：样品液MPT-NAG含量(mmol/L)=(Au-A0)×V1×10/(ε×V2)，其中Au为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，ε为特定波长下MPT-NAG的摩尔吸光值。

2.根据权利要求1所述的一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法，其特征在于：步骤(2)反应中生成的6-甲基-2巯基吡啶(MPT)分别在205nm、270nm、340nm处有最大吸收。

说明书

一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基

葡萄糖苷（MPT-NAG）的检测方法及试剂

技术领域

[0001] 本发明属于生物化学试剂检测领域，具体涉及一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法和用于该方法的检测试剂。 背景技术

[0002] 6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)是近年来合成的测定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)的新底物。以MPT-NAG为主要原材料开发的液体型NAG测定试剂具有稳定、抗干扰能力好、能实现自动化分析等特点，在临床得以广泛应用。MPT-NAG含量的高低显著影响NAG测定试剂的灵敏度，是控制NAG测定试剂批间差不可忽视的实验因素之一。

[0003] 目前实验室测定MPT-NAG含量时均采用高效液相色谱(HPLC)法，该法需要专用大型仪器，需要标准品做对照，检测费时且成本高，检测时还需要使用有毒溶剂甲醇，易造成环境污染。

[0004] 因此，寻求一种操作简便、灵敏度高、结果准确的方法，对MPT-NAG进行定量检测就显得尤为重要。

发明内容

[0005] 本发明的目的是为了解决上述技术的不足，利用N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶对MPT-NAG的催化分解，通过测定反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出待测定样品中MPT-NAG浓度。依据该法构建的测定试剂绿色、环保，实现一步法直接测定，测定试剂置于2-8℃环境中可稳定保存12个月，用普通的紫外分光光度计就可以实现检测。 [0006] 本发明测定原理为：测定试剂中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶(MPT)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖。反应中生成的MPT205nm、270nm、340nm处有最大吸收，通过测定37℃反应一段时间后特定波长下溶液的吸光度值，计算出样品中MPT-NAG的含量。

[0007] 本发明通过以下技术方案实现：

[0008] 一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

[0009] 1)配制含有MgCl2、EDTA·2Na、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶、聚乙二醇6000、乙二醇、蔗糖的pH4.0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液；

[0010] 2)加入含MPT-NAG的待测样品，反应一段时间，试剂中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶将MPT-NAG催化分解产生6-甲基-2巯基吡啶(MPT)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖；

[0011] 3)通过测定特定波长下溶液的吸光度值，计算出待测样品中MPT-NAG的含量。 [0012] 步骤(1)中所述pH4.0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液的浓度为30-500mmol/L、MgCl2浓度为2-20mmol/L、EDTA·2Na浓度为0.5-10mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶浓度为5-20KU/L、聚乙二醇6000浓度为2-10g/L、乙二醇浓度为20-100ml/L、蔗糖浓度为5-50g/L。

[0013] 步骤(2)中的反应条件为在37℃环境中反应5-10min。

[0014] 步骤(2)中反应生成的6-甲基-2巯基吡啶(MPT)分别在205nm、270nm、340nm处有最大吸收，尤其是340nm。

[0015] 样 品 中 MPT-NAG 的 计 算 公 式 为：样 品 液MPT-NAG 含 量 (mmol/L) ＝3
(Au-A0)×V1×10/(ε×V2)，其中Au为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，ε为特定波长下MPT-NAG的摩尔吸光值。

[0016] 本发明的另一个目的是提供一种定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的检测试剂，其特征在于：含有pH4.0-5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中柠檬酸-柠檬酸三钠浓度为30-500mmol/L，MgCl2浓度为2-20mmol/L、EDTA·2Na浓度为0.5-10mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶浓度为5-20KU/L、聚乙二醇6000浓度为2-10g/L、乙二醇浓度为20-100ml/L、蔗糖浓度为5-50g/L，待测样品的浓度为0.005-16.5g/L。

[0017] 利用本发明所述定量检测6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的酶法检测方法，可以精确检测待测样品中含有的6-甲基-2-硫代吡啶-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MPT-NAG)的范围为0.015-50mmol/L。

[0018] 本发明所涉及的化学品均无毒、易得，符合发展绿色检测方法的要求。本检测方法与高效液相(HPLC)法相比较结果见表1。

[0019] 表1

[0020]检测方法 HPLC 本法
检测时间 60min 5～10min
检测成本 200 很低
标准品 需要 不需要
检测步骤 多步 一步直接法
手工法/自动法 手工法 手工法或自动法均可
含有的有毒物质 甲醇 不含有毒物质

[0021] 本发明所述方法灵敏度高，线性、精密度好，结果准确，且操作简便快速，并可用于各种类型的分析仪，达到大规模测定样本的要求。

具体实施方式

[0022] 下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明的原理和其应用，但本发明并不限于此。

[0023] 样品液：精确称取0.1克左右样品，用去离子水定容至样品终浓 度为0.005-16.5g/L的样品液。

[0024] 样品液中MPT-NAG的计算公式：样品液MPT含量(mmol/L)＝(Au-A0)×V1×103/(ε×V2)，其中Au为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，ε为特定波长下MPT-NAG的摩尔吸光值。 [0025] 实施例1：

[0026] 配制含MgCl220mmol/L、EDTA·2Na 10mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶20KU/L、聚乙二醇6000 10g/L、乙二醇100ml/L、蔗糖50g/L的500mmol/L pH5.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液为测定试剂，将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为日立7080全自动生化分析仪，测定方法类型为终点法，温度为37℃，V样品为3μl，V试剂为300μl，测定主/副波长为340/800nm，试剂加入样本后在测定温度反应5分钟后读取吸光度。样品液
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中MPT-NAG的计算公式为：MPT-NAG含量(mmol/L)＝(Au-A0)×V1×10/(10063×V2)，其中Au为样品管反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，10063为340nm下MPT-NAG摩尔吸光值。用本法和HPLC法同时测定了25例样品液中MPT-NAG含量。

[0027] 表2为本实施例所述方法测定的含MPT-NAG的样品液中MPT-NAG含量的测定值与HPLC法测定MPT-NAG含量的值对照表。

[0028] 表2

[0029]

[0030]

[0031] 从表2可知，本实施例所述方法与HPLC法的相关系数r为0.9999，两者显示了极好的相关性。

[0032] 实施例2：

[0033] 配制含MgCl210mmol/L、EDTA·2Na 5mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶12.5KU/L、聚乙二醇6000 6g/L、乙二醇60ml/L、蔗糖25g/L的250mmol/L PH4.5柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液为测定试剂，将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为岛津UV-2550紫外可见分光光度计，温度为37℃，V样品为30μl，V试剂为3000μl，测定波长为270nm，试剂加入样本后在测定温度反应7.5分钟后读取吸光度。样品液中MPT-NAG的计算公式为：
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MPT-NAG含量(mmol/L)＝(Au-A0)×V1×10/(9919×V2)，其中Au为样品管 反应吸光度值，A0为同体积的去离子水代替样品所测得的吸光度值，V1为总反应体积，V2为样品体积，9919为270nm下MPT-NAG摩尔吸光值。

[0034] 实施例3：

[0035] 配制含MgCl22mmol/L、EDTA·2Na 0.5mmol/L、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶5KU/L、聚乙二醇6000 2g/L、乙二醇20ml/L、蔗糖5g/L的30mmol/L pH4.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液为测定试剂，将该测定试剂用于测定样品液时，采用的仪器为岛津UV-2201紫外可