一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法

摘要

本发明涉及中药成分的检测方法，具体涉及一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法，其是利用多波长的高效液相色谱法检测护骨胶囊中的有效成分，具体步骤是：a、配制待检样品溶液；b、配制混合对照品溶液；c、将待检样品溶液和混合对照品溶液分别进行高效液相色谱检测；d、比较待检样品溶液的高效液相色谱图与混合对照品溶液的高效液相色谱图。本发明的检测方法可以同时检测出护骨胶囊中绿原酸、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷这五种有效成分及其含量；本发明在检测护骨胶囊的有效成分时，不需制备以上五种成分的各标准品的高效液相色谱图，可节省时间和试剂；本发明的方法简便、精密度高、重现性好。

权利要求

1.一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法，所述护骨胶囊的中药组方为何首乌、淫羊藿、熟地黄、龟甲、巴戟天、杜仲、续断、骨碎补、当归和山药，其特征在于：所述护骨胶囊的有效成分的检测方法是利用多波长的高效液相色谱法检测护骨胶囊中的各种有效成分，具体的步骤是：a、配制待检样品溶液：取护骨胶囊内容物，用溶剂配制成含药物4mg/ml～20mg/ml的待检样品溶液；

b、配制混合对照品溶液：取2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、淫羊藿苷、绿原酸、柚皮苷混合后用溶剂配制成各成分浓度均为1μg/ml～200μg/ml的对照品溶液；

c、然后将待检样品溶液和混合对照品溶液分别按以下方法进行高效液相色谱检测：

以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料，按进样量为1μL～20μL进样，柱温为

10℃～40℃，用由F相、G相和H相组成的流动相以0.3ml/min～1.5ml/min的流速进行梯度洗脱，同时采用检测波长为267nm～273nm、280～286nm、317nm～323nm和325nm～

328nm的紫外光多波长检测，获得待检样品溶液和混合对照品溶液的高效液相色谱图；

d、将待检样品溶液的高效液相色谱图与混合对照品溶液的高效液相色谱图比较，与混合对照品溶液的高效液相色谱图中相应成分的保留时间相同的峰即是与该成分相同物质的特征峰，并根据峰面积按外标法计算含量；

其中，所述梯度洗脱步骤为：0分钟，流动相中F相的体积百分比为5%～20%，流动相中G相的体积百分比为90%～60%，流动相中H相的体积百分比为5%～20%；2分钟～7分钟，F相为5%～20%，G相为90%～60%，H相为5%～20%；5分钟～14分钟，F相为7%～30%，G相为86%～40%，H相为7%～30%；10分钟～23分钟，F相为11%～35%，G相为78%～30%，H相为11%～35%；15分钟～35分钟，F相为15%～40%，G相为70%～20%，H相为15%～

40%；20分钟～55分钟，F相为20%～45%，G相为60%～10%，H相为20%～45%；其中，以上百分比均为体积百分比；

其中，所述混合对照品溶液的高效液相色谱图中各峰依次为绿原酸、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷的特征峰；

所述流动相的F相是甲醇；所述流动相的H相是乙腈；所述流动相的G相是0.1%～2%的醋酸。

2.根据权利要求1所述的一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法，其特征在于：所述配制待检样品溶液和混合对照品溶液所用的溶剂为：10%～95%的乙醇、

10%～100％的甲醇或者是与流动相相同的溶剂。

3.根据权利要求1所述的一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法，其特征在于：所述G相的制备方法是：往分析纯的冰醋酸中加入水配制成0.1%～2%的醋酸。

4.根据权利要求1所述的一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱步骤为：0分钟，流动相中F相的体积百分比为7%～15%，流动相中G相的体积百分比为86%～70%，流动相中H相的体积百分比为7%～15%；3分钟～6分钟，F相为7%～15%，G相为86%～70%，H相为7%～15%；6分钟～12分钟，F相为9%～20%，G相为82%～60%，H相为9%～20%；12分钟～20分钟，F相为14%～25%，G相为72%～50%，H相为14%～25%；20分钟～30分钟，F相为20%～30%，G相为60%～40%，H相为20%～

30%；30分钟～45分钟，F相为25%～35%，G相为50%～30%，H相为25%～35%；其中，以上百分比均为体积百分比。

5.根据权利要求4所述的一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱步骤为：0分钟，流动相中F相的体积百分比为10%，流动相中G相的体积百分比为80%，流动相中H相的体积百分比为10%；5分钟，F相为10%，G相为80%，H相为10%；8分钟，F相为13%，G相为74%，H相为13%；15分钟，F相为17%，G相为66%，H相为17%；25分钟，F相为25%，G相为50%，H相为25%；35分钟，F相为30%，G相为40%，H相为30%；其中，以上百分比均为体积百分比。

6.根据权利要求1所述的一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法，其特征在于：所述紫外光多波长检测的检测波长为270nm、283nm、320nm、325nm。

7.根据权利要求1所述的一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法，其特征在于：所述流动相的流速为0.8 ml/min。

8.根据权利要求1所述的一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法，其特征在于：所述色谱柱柱温为30℃。

说明书

一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及中药成分的检测方法，具体涉及一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法。

背景技术

[0002] 中药护骨胶囊由何首乌、淫羊藿苷、熟地、龟甲、巴戟天、杜仲、续断、骨碎补、当归、山药等中药材制成，具有补肾益精之功。护骨胶囊用于治疗中老年人肾精亏虚证所出现的腰脊疼痛、酥软无力、不能持重、下肢痿弱、步履艰难，或足跟痛、面色黯淡、发脱、性欲减退、头晕耳鸣、舌淡红苔薄白、舌红苔薄白；而骨质疏松患者通常出现上述症状。护骨胶囊为中药复方制剂，关于有效成分检测的原标准仅分别检测何首乌、淫羊藿苷、熟地等单一成分。而且在了解护骨胶囊的制备工艺的过程中，我们发现护骨胶囊现有质量标准检测有效成分不全面，且操作繁琐，不能满足质量监控的要求。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法，本发明所提供的护骨胶囊的有效成分的检测方法能同时对护骨胶囊的多种中药成分进行定量检测，检测成分全，操作简单，能满足质量监控的要求。

[0004] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0005] 一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法，所述护骨胶囊的中药组方为何首乌、淫羊藿、熟地黄、龟甲、巴戟天、杜仲、续断、骨碎补、当归和山药，其特征在于：所述护骨胶囊的有效成分的检测方法是利用多波长的高效液相色谱法检测护骨胶囊中的各种有效成分，具体的步骤是：

[0006] a、配制待检样品溶液：取护骨胶囊内容物，用溶剂配制成含药物4mg/ml～20mg/ml的待检样品溶液；

[0007] b、配制混合对照品溶液：取2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、淫羊藿苷、绿原酸、柚皮苷混合后用溶剂配制成各成分浓度均为1μg/ml～200μg/ml的对照品溶液；

[0008] c、然后将待检样品溶液和混合对照品溶液分别按以下方法进行高效液相色谱检测：

[0009] 以十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填料，按进样量为1μL～20μL进样，柱温为10℃～40℃，用由F相、G相和H相组成的流动相以0.3ml/min～1.5ml/min的流速并按表
1的配比进行梯度洗脱，同时采用检测波长为267nm～273nm、280～286nm、317nm～323nm和322nm～328nm的紫外光多波长检测，获得待检样品溶液和混合对照品溶液的高效液相色谱图；

[0010] 表1 流动相中F相、G相和H相的配比表

[0011]时间/分钟 F/% G/% H/%
0 5～20 90～605～20
2～7 5～20 90～605～20
5～14 7～30 86～407～30
10～23 11～3578～3011～35
15～35 15～4070～2015～40
20～55 20～4560～1020～45

[0012] 其中，表1中的百分比均为体积百分比；

[0013] 所述梯度洗脱步骤为：0分钟，流动相中F相的体积百分比为5%～20%，流动相中G相的体积百分比为90%～60%，流动相中H相的体积百分比为5%～20%；2分钟～7分钟，F相为5%～20%，G相为90%～60%，H相为5%～20%；5分钟～14分钟，F相为7%～30%，G相为86%～40%，H相为7%～30%；10分钟～23分钟，F相为11%～35%，G相为78%～30%，H相为11%～35%；15分钟～35分钟，F相为15%～40%，G相为70%～20%，H相为15%～40%；20分钟～55分钟，F相为20%～45%，G相为60%～10%，H相为20%～45%；其中，以上百分比均为体积百分比；

[0014] d、将待检样品溶液的高效液相色谱图与混合对照品溶液的高效液相色谱图比较，与混合对照品溶液的高效液相色谱图中相应成分的保留时间相同的峰即是与该成分相同物质的特征峰，并根据峰面积按外标法计算含量。

[0015] 其中，所述混合对照品溶液的高效液相色谱图中各峰依次为绿原酸、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷的特征峰； [0016] 所述配制待检样品溶液和混合对照品溶液所用的溶剂可为：10%～95%的乙醇、10%～100％的甲醇或者是与流动相相同的溶剂，所述配制待检样品溶液和混合对照品溶液的溶解方式均为超声、回流提取等中药常用提取、纯化方式。

[0017] 所述流动相的F相是甲醇；所述流动相的H相是乙腈；所述流动相的G相是0.1%～2%的醋酸。

[0018] 所述G相的制备方法是：往分析纯的冰醋酸中加入水配制成0.1%～2%的醋酸。

[0019] 本发明所述的待检样品溶液可以采用下述方法配制：精密称取适量护骨胶囊内容物药物，然后用溶剂溶解并采用常用的中药提取纯化方法进行处理，最后用溶剂定容至浓度为含内容物药物4mg/ml～20mg/ml，过滤，即可。

[0020] 优选的，梯度洗脱时所述流动相F相、G相和H相的配比如表2所示。

[0021] 表2 流动相中F相、G相和H相的配比表

[0022]时间/分钟 F/% G/% H/%
0 7～15 86～707～15
3～6 7～15 86～707～15
6～12 9～20 82～609～20
12～20 14～2572～5014～25
20～30 20～3060～4020～30
30～45 25～3550～3025～35

[0023] 其中，表2中的百分比均为体积百分比；

[0024] 所述梯度洗脱步骤为：0分钟，流动相中F相的体积百分比为7%～15%，流动相中G相的体积百分比为86%～70%，流动相中H相的体积百分比为7%～15%；3分钟～6分钟，F相为7%～15%，G相为86%～70%，H相为7%～15%；6分钟～12分钟，F相为9%～20%，G相为82%～60%，H相为9%～20%；12分钟～20分钟，F相为14%～25%，G相为72%～50%，H相为14%～25%；20分钟～30分钟，F相为20%～30%，G相为60%～40%，H相为20%～30%；30分钟～45分钟，F相为25%～35%，G相为50%～30%，H相为25%～35%；其中，以上百分比均为体积百分比。

[0025] 更优选的，梯度洗脱时所述流动相F相、G相和H相的配比如表3所示。

[0026] 表3 流动相中F相、G相和H相的配比表

[0027]时间/分钟 F/%G/%H/%
0 10 80 10
5 10 80 10
8 13 74 13
15 17 66 17
25 25 50 25
35 30 40 30

[0028] 其中，表3中的百分比均为体积百分比；

[0029] 所述梯度洗脱步骤为：0分钟，流动相中F相的体积百分比为10%，流动相中G相的体积百分比为80%，流动相中H相的体积百分比为10%；5分钟，F相为10%，G相为80%，H相为10%；8分钟，F相为13%，G相为74%，H相为13%；15分钟，F相为17%，G相为66%，H相为17%；25分钟，F相为25%，G相为50%，H相为25%；35分钟，F相为30%，G相为40%，H相为
30%；其中，以上百分比均为体积百分比。

[0030] 优选的，所述紫外光多波长检测的检测波长为270nm、283nm、320nm和325nm。

[0031] 优选的，所述流动相的流速为0.8 ml/min。

[0032] 优选的，所述柱温为30℃。

[0033] 本发明所述混合对照品溶液的高效液相色谱图中的各峰的归属是通过以下方法确定的：分别配制2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、淫羊藿苷、绿原酸、柚皮苷的标准品溶液，然后在同一色谱条件下分别制备各单独标准品溶液和所述混合对照品溶液的高效液相色谱图，根据各单独标准品溶液色谱图中相应成分的峰的保留时间确定混合对照品溶液色谱图中各峰的归属。经过多次重复试验，发现所述流动相中混合对照品溶液中有五种成分有固定的出峰，这五种成分为绿原酸、2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷，因此，可确定混合对照品溶液高效液相色谱图中五个峰的归属。

[0034] 本发明与现有技术相比较，有益效果在于：

[0035] 1）由于混合对照品溶液高效液相色谱图中有五个峰的归属分别为绿原酸、2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷，因此，在检测护骨胶囊的有效成分时，不需要再分别制备以上五种成分的各标准品的高效液相色谱图，从而节省了时间和试剂。

[0036] 2）本发明的检测方法采用高效液相色谱图的方法对护骨胶囊进行定性和定量的检测，根据护骨胶囊的有效成分的特性，流动相选择甲醇、乙腈和0.1%～2%的醋酸，并按程序连续改变流动相中各相之间的比例进行梯度洗脱，达到精确分离护骨胶囊中多种成分的目的，同时对各洗脱成分选择检测波长，从而进一步提高检测的精确度。

[0037] 3）采用本发明的检测方法，可以同时对护骨胶囊的有效成分中的2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、淫羊藿苷、绿原酸、柚皮苷这五种成分进行定量检测，能较全面地考察护骨胶囊中主要有效成分组成和比例变化情况，减少了分析步骤以及减少了样品前处理环节可能引起的成分变化和测定误差。

[0038] 4）本发明的检测方法具有简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的优点。

附图说明

[0039] 图1是本发明一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法的实施例1的混合对照品溶液的高效液相色谱图。

[0040] 图2是本发明一种防治骨质疏松中药护骨胶囊的有效成分的检测方法的实施例1的待检样品溶液的高效液相色谱图。

具体实施方式

[0041] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

[0042] 实施例1。

[0043] （1）仪器与试剂。

[0044] 仪器：Agilent1200高效液相色谱仪(在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)；Kromasil100-5C18色谱柱；Sartorius十万分之一天平；KQ5200DB型数控超声波清洗器；Milli-pore-Q超纯水制备仪。

[0045] 对照品：2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、淫羊藿苷、绿原酸、柚皮苷。

[0046] 待检样品：护骨胶囊。

[0047] 其他试剂：乙腈(色谱纯)、甲醇、冰醋酸（分析纯）。

[0048] （2）检测方法。

[0049] a、混合对照品溶液的制备：精密称取2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、淫羊藿苷、绿原酸、柚皮苷适量，用100%的甲醇溶解，定容，摇匀，滤膜过滤，制得绿原酸含量为80μg/ml、2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量为150μg/ml、阿魏酸含量为100μg/ml、柚皮苷含量为80μg/ml、淫羊藿苷含量为90μg/ml的混合对照品溶液。

[0050] b、待检样品溶液的制备：取护骨胶囊的内容物过四号筛，然后取约0.2g进行精密称定后，置于25ml的容量瓶中，精密加入80%甲醇至刻度线；在加热温度为57℃下进行超声使其完全溶解，制得浓度为8mg/ml的样品溶液，摇匀，微孔滤膜过滤。

[0051] c、色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，取混合对照样品溶液20μL进样，柱温为30℃，流速0.8ml/min，按表4进行梯度洗脱，并采用检测波长为270nm、283nm、320nm和325nm的紫外光多波长检测，得到混合对照品溶液的高效液相色谱图。

[0052] 表4 流动相中F相、G相和H相的配比表

[0053]时间/分钟 F/%G/%H/%
0 10 80 10
5 10 80 10
8 13 74 13
15 17 66 17
25 25 50 25
35 30 40 30

[0054] 其中，流动相的G相是1%的醋酸，其制备方法是：将分析纯的冰醋酸加水配制成1%的醋酸溶液；流动相的F相是甲醇，流动相的H相是乙腈。

[0055] 按照上述方法得到待检样品溶液的高效液相色谱图，其中，待检样品溶液的进样量为20μL，流速0.8ml/min。

[0056] （3）结果比较。

[0057] 见图1，混合对照品溶液的高效液相色谱图中A、B、C、D、E各峰的归属分别为绿原酸、2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷。

[0058] 见图1和图2，比较待检样品溶液的高效液相色谱图与混合对照品溶液的高效液相色谱图各峰的保留时间和峰面积，可知待检样品溶液的高效液相色谱图中A、B、C、D、E各峰分别代表绿原酸、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷的特征峰；该待检样品溶液中绿原酸的含量为0.3mg/mg，2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量为1.6mg/mg，阿魏酸的含量为0.3mg/mg , 柚皮苷的含量为0.4mg/mg，淫羊藿苷的含量为2.6mg/mg。

[0059] 实施例2。

[0060] （1）仪器与试剂。

[0061] 仪器：Agilent1200高效液相色谱仪(在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)；Kromasil100-5C18色谱柱；Sartorius十万分之一天平；KQ5200DB型数控超声波清洗器；Milli-pore-Q超纯水制备仪。

[0062] 对照品：2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、淫羊藿苷、绿原酸、柚皮苷。

[0063] 待检样品：护骨胶囊。

[0064] 其他试剂：乙腈(色谱纯)、甲醇、冰醋酸（分析纯）。

[0065] （2）检测方法。

[0066] a、混合对照品溶液的制备：精密称取2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、淫羊藿苷、绿原酸、柚皮苷适量，用80%的乙醇溶解，定容，摇匀，滤膜过滤，制得绿原酸含量为75μg/ml、2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量为200μg/ml、阿魏酸含量为90μg/ml、柚皮苷含量为95μg/ml、淫羊藿苷含量为150μg/ml的混合对照品溶液。

[0067] b、待检样品溶液的制备：取护骨胶囊的内容物过四号筛，然后取约0.2g进行精密称定后，置于25ml的容量瓶中，精密加入80%甲醇至刻度线；在加热温度为57℃下进行超声使其完全溶解，制得浓度为15mg/ml的样品溶液，摇匀，微孔滤膜过滤。

[0068] c、色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，取混合对照样品溶液20μL进样，柱温为40℃，流速1.5ml/min，按表5进行梯度洗脱，并采用检测波长为267nm、280nm、323nm和328nm的紫外光多波长检测，得到混合对照品溶液的高效液相色谱图。

[0069] 表5 流动相中F相、G相和H相的配比表

[0070]时间/分钟 F/%G/%H/%
0 8 75 15
6 8 75 12
10 20 80 15
20 23 60 20
30 28 48 23
45 35 35 32

[0071] 其中，流动相的G相是2%的醋酸，其制备方法是：将分析纯的冰醋酸加水配制成2%的醋酸溶液；流动相的F相是甲醇，流动相的H相是乙腈。

[0072] 按照上述方法得到待检样品溶液的高效液相色谱图，其中，待检样品溶液的进样量为15μL，流速1.5ml/min。

[0073] （3）结果比较。

[0074] 见图1，混合对照品溶液的高效液相色谱图中A、B、C、D、E各峰的归属分别为绿原酸、2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷。

[0075] 见图1和图2，比较待检样品溶液的高效液相色谱图与混合对照品溶液的高效液相色谱图各峰的保留时间和峰面积，可知待检样品溶液的高效液相色谱图中A、B、C、D、E各峰分别代表绿原酸、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷的特征峰；该待检样品溶液中绿原酸的含量为0.4mg/mg，2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量为1.8mg/mg，阿魏酸的含量为0.5mg/mg , 柚皮苷的含量为0.6mg/mg，淫羊藿苷的含量为2.9mg/mg。

[0076] 实施例3。

[0077] （1）仪器与试剂。

[0078] 仪器：Agilent1200高效液相色谱仪(在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)；Kromasil100-5C18色谱柱；Sartorius十万分之一天平；KQ5200DB型数控超声波清洗器；Milli-pore-Q超纯水制备仪。

[0079] 对照品：2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、淫羊藿苷、绿原酸、柚皮苷。

[0080] 待检样品：护骨胶囊。

[0081] 其他试剂：乙腈(色谱纯)、甲醇、冰醋酸（分析纯）。

[0082] （2）检测方法。

[0083] a、混合对照品溶液的制备：精密称取2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、淫羊藿苷、绿原酸、柚皮苷适量，用95%的乙醇溶解，定容，摇匀，滤膜过滤，制得绿原酸含量为100μg/ml、2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量为160μg/ml、阿魏酸含量为80μg/ml、柚皮苷含量为
1055μg/ml、淫羊藿苷含量为120μg/ml的混合对照品溶液。

[0084] b、待检样品溶液的制备：取护骨胶囊的内容物过四号筛，然后取约0.3g进行精密称定后，置于25ml的容量瓶中，精密加入80%甲醇至刻度线；在加热温度为57℃下进行超声使其完全溶解，制得浓度为20mg/ml的样品溶液，摇匀，微孔滤膜过滤。

[0085] c、色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，取混合对照样品溶液20μL进样，柱温为20℃，流速0.5ml/min，按表6进行梯度洗脱，并采用检测波长为273nm、286nm、317nm和322nm的紫外光多波长检测，得到混合对照品溶液的高效液相色谱图。

[0086] 表6 流动相中F相、G相和H相的配比表

[0087]时间/分钟 F/%G/%H/%
0 15 72 13
4 15 72 12
6 20 75 20
12 25 65 20
20 28 48 23
30 32 45 35

[0088] 其中，流动相的G相是0.1%的醋酸，其制备方法是：将分析纯的冰醋酸加水配制成0.1%的醋酸溶液；流动相的F相是甲醇，流动相的H相是乙腈。

[0089] 按照上述方法得到待检样品溶液的高效液相色谱图，其中，待检样品溶液的进样量为10μL，流速0.5ml/min。

[0090] （3）结果比较。

[0091] 见图1，混合对照品溶液的高效液相色谱图中A、B、C、D、E各峰的归属分别为绿原酸、2 ,3 ,5 ,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷。

[0092] 见图1和图2，比较待检样品溶液的高效液相色谱图与混合对照品溶液的高效液相色谱图各峰的保留时间和峰面积，可知待检样品溶液的高效液相色谱图中A、B、C、D、E各峰分别代表绿原酸、2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、柚皮苷、淫羊藿苷的特征峰；该待检样品溶液中绿原酸的含量为0.4mg/mg，2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量为2.0mg/mg，阿魏酸的含量为0.6mg/mg , 柚皮苷的含量为0.8mg/mg，淫羊藿苷的含量为3.1mg/mg。

[0093] 最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。