缺血修饰白蛋白液体稳定试剂盒

摘要

本发明公开一种缺血修饰白蛋白液体稳定试剂盒，该试剂盒为由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中试剂1为：缓冲液(pH7.5-8.5)0.05~0.5M，氯化钴20~200mg/L，去干扰剂0.1~10g/L，稳定剂0.1~10g/L，防腐剂0.1~10g/L；试剂2为：缓冲液(pH7.0-8.0)0.5~10M，二硫苏糖醇0.5~50g/L，稳定剂0.1~10g/L，防腐剂 0.1~10g/L。本发明的的试剂盒具有准确度、精密度均较好，稳定性好，2～8℃避光保存至少可稳定12个月，完全能满足临床检验要求的优点。

权利要求

1.一种缺血修饰白蛋白液体稳定试剂盒，其特征在于：该试剂盒为由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中试剂1各组分及浓度为：

试剂2各组分及浓度为：

试剂1中所述的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液中的一种；试剂1中所述的去干扰剂为氟化钠、柠檬酸、半胱氨酸、氨基乙酸中的一种或几种；试剂2中的缓冲液为柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、咪唑缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种；所述的稳定剂为吐温20、吐温80、布里杰-35、曲拉通100中的一种；所述的防腐剂为叠氮钠或proclin系列防腐剂。

2.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白液体稳定试剂盒，其特征在于：试剂1中所述的缓冲液为4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液。

3.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白液体稳定试剂盒，其特征在于：试剂2中的缓冲液为咪唑缓冲液。

说明书

缺血修饰白蛋白液体稳定试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于医学检验测定技术领域，具体涉及一种缺血修饰白蛋白液体稳定试剂盒。

背景技术

[0002] 急性冠状动脉综合征（Acute coronary syndromes，ACS）有不同的临床表现，但均有一个相同的病理生理过程，即动脉粥样硬化斑块脱落、血小板聚集和血栓形成，导致冠状动脉狭窄、阻塞，而引起心肌缺血，如果心肌缺血时间延长会导致心肌细胞坏死和心肌损伤。因此，在心肌坏死之前鉴别出心肌缺血，尽早明确诊断和开始治疗对于病人是至关重要的。当前心脏缺血的诊断多依赖于心电图的ST段和T波的改变，这是心肌缺血最简便、最迅速和最廉价的检查方法，但心梗的病人也可多表现为心电图未见异常，其灵敏度低于50%。单光子发射计算机成像显示的急性心肌灌注异常和超声心动图显示的室壁运动异常是诊断心肌缺血较好的指标，这两种方法都有很高的敏感性、特异性和阴性预测值，但在实际工作中不能随时检查且费用高昂，如果不与以前的检查结果对比则很难识别新出现的缺血区。

[0003] 目前，临床应用的心肌缺血标志物中，肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白等在心脏受损坏时能从心肌细胞释放入血，但这些酶也存在于骨骼肌，骨骼肌损伤时这些酶也会释放入血，故特异性差。心肌肌钙蛋白I或T具有高特异性，但其在心脏损伤发生6-12 h之后才能从血中检测出，且对心肌细胞损伤的特异性高，对可逆的心肌缺血多为阴性。因此，为能尽早诊断ACS，需要一种能早期检测且灵敏度和特异性较高的心肌缺血标志物。

[0004] 人血清白蛋白（HSA）是一种循环蛋白，其氨基酸末端序列为人类所特有，能与金属钴、铜和镍等离子结合，在缺血/再灌注发生时，由于自由基等破坏了血清白蛋白的氨基酸序列，而导致白蛋白与过渡金属的结合能力改变，这种因缺血而发生与过渡金属结合能力改变的白蛋白称为缺血修饰白蛋白（Ischemia Modified Albumin，IMA）。IMA在心肌缺血后数分钟内即迅速升高，是心肌缺血发生后到发生细胞坏死之前的一个非常早期的指标。研究显示，IMA在心肌可逆的心肌缺血阶段血中浓度即迅速升高，可早期并灵敏的反应心肌缺血状况，将心肌缺血的诊断窗由原来的缺血发生4-6 h提前到5-10 min。

[0005] 早在1990年，1名急诊医生就发现心肌缺血发作时HSA的化学性质可能会发生改变，并发现HSA和过渡金属元素如钴、铜和镍有很强的结合能力；1997年局部缺血技术公司（Ischemia Technologies，Denver, Colorado, USA）投入资金对IMA标志物进行商业开发，生产出适合临床自动化检测的试剂盒。2000年美国多中心临床试验显示在诊断ACS时IMA比心电图ECG、cTnI敏感；2001年ACB试验通过ISO9001、ISO13485、EN46001认可。2003年2月美国FDA批准可上市销售，这是FDA自1994年批准肌钙蛋白的测定试验后，首次批准的一个用来评价心肌缺血的生化试验项目。由于IMA极高的阴性预测值，美国FDA将其推荐为ACS的排除指标，在美国此项检测己列入医疗报销范围。

[0006] IMA的检测方法有超滤法、液相色谱法、质谱测定法、核磁共振法、ELISA方法等，均因检测成本较高或干扰因素多，不适合临床常规使用。目前，IMA的测定主要是采用白蛋2+ 2+
白结合钴试验（ACB试验），其反应原理如下：血清中HSA与Co 结合后剩余的游离Co 与
2+
有机显色物反应生成红褐色产物，在510 nm的波长下比色，其吸光度与Co 浓度成正比，与标准品进行比较，即可计算出样本中IMA的浓度。David Bar-Or等最早建立了手工分光光度法，方便简易，适合基层单位使用，报告单位为吸光度单位（absorbance unit，ABSU）。此种手工方法试剂，国内没有供应，可用于半自动生化分析仪检测。第二代ACB试验为全自动分光光度法。结果可用U/ml或KU/L表示。其基本原理同样为ACB试验。美国Ischemia Technologies公司（2007年被Inverness Medical Professional Diagnostics并购）根据该方法最早开发出IMA测定试剂盒，美国食品与药品管理局（FDA）于2003年批准认证。目® ® ®
前该试剂盒可应用于包括罗氏的COBAS MIRAPlus、COBAS INTEGRA700/800、Hitachi917®
及Roche/Hitachi Modular P，贝克曼库尔特的Beckman Coulter Synchron LX20等多种仪器，但价格昂贵，而且为干粉试剂，复溶后有效期仅为2个星期。由于IMA测定采用二硫苏糖醇为显色剂，其水溶液冷藏或冷冻保存稳定时间相对较短，此外由于二硫苏糖醇能与样本中的其他重金属螯合影响测定的准确性，因此严重影响了该试剂的大规模临床应用。

发明内容

[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供一种准确度、精密度均较好，稳定性好，2～8℃避光保存至少可稳定 12个月，完全能满足临床检验要求缺血修饰白蛋白液体稳定试剂盒。

[0008] 为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种缺血修饰白蛋白液体稳定试剂盒，该试剂盒为由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中

[0009] 试剂1各组分及浓度为：

[0010] 缓冲液(pH 7.5-8.5) 0.05~0.5 M （mol/L）

[0011] 氯化钴 20~200 mg/L

[0012] 去干扰剂 0.1~10 g/L

[0013] 稳定剂 0.1~10 g/L

[0014] 防腐剂 0.1~10 g/L；

[0015] 试剂2各组分及浓度为：

[0016] 缓冲液(pH 7.0-8.0) 0. 5~10 M

[0017] 二硫苏糖醇 0.5~50 g/L

[0018] 稳定剂 0.1~10 g/L

[0019] 防腐剂 0.1~10 g/L。

[0020] 本发明上述试剂1中的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液等中的一种，优选4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液。

[0021] 本发明上述试剂1中的去干扰剂为氟化钠、柠檬酸、半胱氨酸、氨基乙酸等中的一种或几种（即两种及以上的混合，当两种以上的混合时，各组分之间配比关系没有要求）。

[0022] 本发明上述试剂2中的缓冲液为柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、咪唑缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液等中的一种，优选咪唑缓冲液。

[0023] 本发明的稳定剂为吐温20、吐温 80、布里杰-35（Brij-35）、曲拉通100（曲拉通X-100）等非离子表面活性剂中的一种。

[0024] 本发明的防腐剂为叠氮钠或proclin系列防腐剂（如Proclin300）等。

[0025] 本发明试剂1和试剂2的配制方法为常规方法，即按照上述配方比例，分别将试剂1和试剂2所述的各组分按照配方比例分别加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。

[0026] 本发明试剂盒测定样本中的IMA的测试条件如下：温度：30-37 ℃；比色杯光径为1.0 cm。检测主波长510 nm，副波长700 nm。

[0027] 应用本发明IMA测定试剂盒测定样本中IMA的方法如下：样品（校准管以校准品做样品）加试剂1混匀，30-37℃孵育3-5 min后读取吸光度A0，立即加入试剂2混匀，30-37℃反应5 min后，读取吸光度A1，ΔA＝A1-A0。其中样本用量30 µl，试剂1用量200 µl，试剂2 用量100 µl。

[0028] 本发明试剂盒测定样本中IMA含量按以下公式进行计算：

[0029]

[0030] 单位定义：每ml血清中白蛋白失去结合1 µg钴离子的能力为1 U。

[0031] 本发明的突出实质性特点及显著进步主要表现在：

[0032] （1）本发明通过在试剂1中添加抗干扰剂，在一定程度上避免了样本中其他重金属离子的干扰，同时通过加入稳定剂保证了钴离子不与试剂中的其他成分反应，从而让试剂的稳定性更好。

[0033] （2）本发明将二硫苏糖醇（DTT）加入到高浓度缓冲液中，并加入少量非离子型表面活性剂，大大降低了DTT氧化的速度，显著提高了试剂的稳定性。

[0034] （3）本发明试剂盒稳定性好，2-8℃避光保存至少稳定12个月，能完全满足临床检验要求。

具体实施方式

[0035] 以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步描述，但本发明并不限于这些实施例。

[0036] 本发明的检测原理如下：血清中白蛋白与Co2+结合后剩余的游离Co2+与有机显色2+
物反应生成红褐色产物，在510 nm的波长下比色，其吸光度与Co 浓度成正比，与标准品进行比较，即可计算出样本中IMA的浓度。

[0037] 实施例1

[0038] 试剂1（R1）各组分及浓度为：

[0039] 三羟甲基氨基甲烷缓冲液（pH 7.5） 0.1 M

[0040] 氯化钴 50 mg/L

[0041] 吐温20 0.1 g/L

[0042] 氟化钠 0.1 g/L

[0043] 叠氮钠 0.1 g/L

[0044] 试剂2（R2）各组分及浓度为：

[0045] 柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液（pH 7.0） 1 M

[0046] 二硫苏糖醇 0.5 g/L

[0047] 布里杰-35 1 g/L

[0048] 叠氮钠 0.1 g/L

[0049] 试剂1和试剂2的配制方法为常规方法，即试剂1和试剂2所述组分分别加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。

[0050] 实施例2

[0051] 试剂1各组分及浓度为：

[0052] 3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸缓冲液（pH 8.0） 0.2 M

[0053] 氯化钴 20 mg/L

[0054] 氟化钠 5 g/L

[0055] 柠檬酸 0.7 g/L

[0056] 吐温20 1 g/L

[0057] 叠氮钠 1 g/L

[0058] 试剂2各组分及浓度为：

[0059] 醋酸-醋酸钠缓冲液（pH 7.5） 2 M

[0060] 二硫苏糖醇 10 g/L

[0061] 吐温 80 5 g/L

[0062] Proclin300 0.1 g/L

[0063] 实施例2试剂盒的制备方法同实施例1。

[0064] 实施例3

[0065] 试剂1各组分及浓度为：

[0066] 4-羟乙基哌嗪丙磺酸缓冲液（pH 8.5） 0.2 M

[0067] 氯化钴 200 mg/L

[0068] 氨基乙酸 2.5 g/L

[0069] 吐温 80 2 g/L

[0070] Proclin300 1 g/L

[0071] 试剂2各组分及浓度为：

[0072] 咪唑缓冲液（pH 8.0） 10 M

[0073] 二硫苏糖醇 30 g/L

[0074] 曲拉通100 1 g/L

[0075] Proclin300 1 g/L

[0076] 实施例3 试剂盒的制备方法同实施例1。

[0077] 本发明试剂盒测定样本中的IMA的测试条件如下：温度：30-37 ℃；比色杯光径为1.0 cm。检测主波长510 nm，副波长700 nm。

[0078] 应用本发明IMA测定试剂盒测定样本中IMA的方法如下：样品（校准管以校准品做样品）加R1混匀，30-37℃孵育3-5 min后读取吸光度A0，立即加入R2混匀，30-37℃反应5 min后，读取吸光度A1，ΔA＝A1-A0。其中样本用量30 µl，试剂1用量200 µl，试剂2 用量100 µl。

[0079] 本发明试剂盒测定样本中IMA含量按以下公式进行计算：

[0080]

[0081] 单位定义：每ml血清中白蛋白失去结合1 µg钴离子的能力为1 U。

[0082] 下面结合表格对本发明实施例所得试剂盒的性能进行说明。

[0083] 1、试剂盒稳定性实验

[0084] （1）37℃加速稳定性实验

[0085] 将实施例1配制的试剂进行37℃加速稳定性实验（37℃加速稳定性试验7天可模拟现实4-8℃保存1年），空白吸光度（此时吸光度最大且稳定便于观察）检测结果如表1所示：

[0086] 表1

[0087]时间 空白吸光度
第一天 1.5693
37℃3天 1.5553
37℃5天 1.5237
37℃7天 1.4523
第七天下降百% 7.5％

[0088] （2）4-8 ℃稳定性实验

[0089] 将实施例1配制的试剂在4-8℃保存1年，空白吸光度检测结果如表2所示：

[0090] 表2

[0091]月 份 空白吸光度
1 1.5773
3 1.5547
5 1.5288
7 1.4885
9 1.4461
12 1.4283

[0092] 由以上数据明显显示，本发明实施例1配制的试剂稳定性好。

[0093] 2、试剂盒的准确值、精密度检测

[0094] 对靶值为62.4±4 U/L的质控液Ⅰ和靶值为75.2±4 U/L的质控液Ⅱ在相同条件下，采用实施例1制备的试剂盒对同一质控液的唾液酸浓度连续检测20次，将检测结果的平均值与靶值范围进行比较，以检测所述的试剂盒的准确性，同时比较每个测定的变异系数，以检测所述的试剂盒实施例的精密度，结果如表3所示：

[0095] 表3：

[0096]