一种色木槭腋芽途径组织培养的方法

摘要

本发明提供了一种色木槭(Acer mono Maxim)腋芽途径组织培养繁殖方法，包括以下步骤：首先进行外植体消毒，消毒后接种于诱导培养基中进行芽的分化诱导，控制培养温度在25℃，光照时间10-16h/d、光照强度为1600-20001x下进行正常培养20d，接着将所得色木槭嫩梢切割后接入继代培养基中进行继代培养30d，最后将色木槭无菌苗接入生根培养基中进行生根培养15-20d，培养温度20-26℃，光照时间10-16h/d，光照强度为1600-2000Ix。获得生根无菌苗后，移至苗床驯化培养。通过该方法能够有效的解决色木槭快速推广的问题。

权利要求

1.一种色木槭腋芽途径组织培养繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)外植体消毒：9月中上旬选取色木槭一年生扦插苗的当年生带腋芽茎段作为外植体，进行消毒处理；

B)芽的分化诱导：取消毒后的外植体切割为1.0-1.5cm长的茎段，其中每个茎段带一个腋芽，将茎段接种于诱导培养基WPM+6-BA1.0mg/L+IBA0.01mg/L+PVP500mg/L+GA31.0mg/L pH6.0中进行芽的分化诱导，控制培养温度在25℃，光照培养20d，所述光照培养为：光照时间10-16h/d，光照强度为1600-2000lx；

C)继代培养与增殖：将步骤B)中所得色木槭嫩梢切割后接入继代培养基

WPM+6-BA0.3mg/L+IBA0.05mg/L+PVP500mg/L，pH6.0中进行继代培养30d，培养温度25℃，光照时间10-16h/d，光照强度为1600-2000lx；

D)根的诱导：将步骤C)所得色木槭试管苗接入生根培养基1/2MS+IBA3.0mg/L，pH6.0中进行生根培养15-20d，培养温度20-26℃，光照时间10-16h/d，光照强度为

1600-2000lx；

E)无菌苗驯化及继续培养：将步骤D)所得色木槭生根无菌苗在打开瓶盖的环境下培养3-5d，然后移入适合该树种生长环境的轻基质容器中继续培育，轻基质是由土壤、河沙和有机肥以2∶1∶2的比例混合而成，并用0.4％的高锰酸钾消毒，培育10-15天后将苗木与基质一起移栽并密植到所适应的土壤中继续培育；

所述步骤A)中的外植体消毒过程为：清洗后放入质量浓度为3％的H2O2中浸泡15～

20分钟，取出立即转入含质量浓度为1～5％吐温-80的0.1％HgCl2溶液中浸泡10～20分钟，然后取出用无菌水冲洗5～6次并用灭菌吸水纸将水吸干。

说明书

一种色木槭腋芽途径组织培养的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及色木槭(Acer mono Maxim)组织培养繁殖方法，属于木本植物种苗繁殖的技术领域。

背景技术

[0002] 色木槭(Acer mono Maxim)属槭树科(Aceraceae)槭树属(Acer)植物。又名五角槭，落叶乔木，高15-20m；树皮粗糙，常纵裂，灰褐色；小枝细瘦，无毛，当年生嫩枝绿色或紫绿色，多年生枝灰色或淡灰色，具圆形皮孔；冬芽近于球形，鳞片卵形。叶对生叶柄长4-6cm，细瘦，无毛；叶片纸质，外貌近椭圆形，长6-8cm，宽9-11cm，5裂，有时3裂及7裂同生一树；裂片卵形或宽三角形，长渐尖，全缘，无毛，仅主脉腋间有簇毛，主脉5条，在上面显着，侧脉两面均不显着，上面光绿色，下面淡绿色。花多数，杂性，雄花与两性花同株，多数常成圆锥状，伞房花序顶生，无毛；花带绿黄色，总花梗长1-2cm；萼片5，长圆形，黄绿色；花瓣
5，椭圆形，淡白色；雄蕊8，无毛，比花瓣短，花药黄色；子房无毛，在雄花中不发育，花柱无毛，柱头2裂，反卷。翅果嫩时紫绿色，成熟时淡黄色，小坚果压扁状，长1-1.3cm，宽5-8mm；
翅长圆形，宽5-10mm，连同小坚果长2-2.5cm，张开成锐角或近于钝角，花期5月，果期9月。
主要自然分布于东北、华北、华中、华东、西南各地。由于色木槭树势优美，枝叶浓密，叶形秀丽，嫩叶红色，入秋变成橙黄或红色，甚为美观。因此，该树种无论栽植于何处，无不感到引人入胜，在园林中既可以作为很好的有色树种植于草坪、土丘、溪边、池畔等地，又可以作为行道树利用。此外，色木槭木材纹理清晰，结构细而均匀，木质重、硬、耐腐，易加工，切面光滑，弹性好，是制作高档家具、乐器、农具和胶合板的上好材料。

[0003] 目前国内对色木槭的研究与开发应用较少。对于其快速繁殖和栽培管理的研究尚处于空白。色木槭目前以种子繁育为主，相关研究表明色木槭靠种子繁殖的实生苗变异比较大，形状不稳定，因此市场上种苗资源极其短缺。扦插与嫁接还在试验之中，槭树科种子饱满率极低，仅万分之几。这样不仅繁殖系数小，而且成苗时间大大延长，很难形成规模，，满足不了市场的需求。

[0004] 木本植物组织培养研究起步于20世纪50年代初，直到70年代后期才得到较大的发展。组织培养获得再生植株主要分为两种途径，其一为广义组织培养，即从植物体分离出符合需要的器官等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株；其二为狭义组织培养，即在培养过程中从各器官上产生愈伤组织，培养愈伤组织再经过再分化形成再生植物。

[0005] 目前，不完全统计有90多属300多种木本植物经组织培养获得再生植株。而关于槭树属植物组织培养的研究，国内外报道很少。近5年，仅见有报道对色木槭嫩茎(见植物生理学通讯，2008年第2期，色木槭的组织培养及快繁技术)、对红翅槭以嫩茎(见北方园艺，2010年第9期，红翅槭的组织培养及快繁技术)和嫩叶(见中南林业科技大学学报，2010年第4期，景观树种红翅槭愈伤组织诱导培养)为外植体进行愈伤组织的诱导培养，而关于色木槭的腋芽(器官)途径离体快繁研究尚未见有报道。

[0006] 综上所述，采取组织培养繁殖色木槭是解决色木槭资源短缺的重要途径之一，对色木槭的开发和推广利用都具有着非常重要的意义。

发明内容

[0007] 本发明主要解决的技术问题是公开色木槭的腋芽途径组织培养繁殖方法。

[0008] 为解决该技术采用如下的技术方案：

[0009] A)外植体消毒：9月中上旬取色木槭一年生扦插苗当年生枝条上带腋芽的茎段为外植体，用清水冲洗干净，清洗后放入质量浓度为3％的H2O2中浸泡15～20分钟，取出立即转入含质量浓度为1～5％吐温-80的0.1％HgCI2溶液中浸泡10～20分钟，然后取出用无菌水冲洗5～6次并用灭菌吸水纸将水吸干。

[0010] B)腋芽萌动：取消毒后的外植体切割为1.0-1.5cm长的茎段，其中每个茎段带一个腋芽，将茎段接种于诱导培养基WPM+6-BA1.0mg/L+IBA0.01mg/L+PVP500mg/L+GA31.0mg/L PH6.0中进行腋芽的萌发诱导，控制培养温度在25℃，进行光照培养20d，所述光照培养为：光照时间10-16h/d，光照强度为1600-2000lx；

[0011] C)继代培养：将步骤B)中所得色木槭嫩梢切割后接入继代培养基WPM+6-BA0.3mg/L+IBA0.05mg/L+PVP500mg/L PH6.0中进行继代培养30d，培养温度25℃，光照时间10-16h/d，光照强度为1600-2000lx；

[0012] D)根的诱导：将步骤C)所得色木槭试管苗接入生根培养基1/2MS+IBA3.0mg/L PH6.0中进行生根培养15-20d，培养温度20-26℃，光照时间10-16h/d，光照强度为1600-2000Ix。

[0013] E)无菌苗驯化及继续培养：：将步骤D)所得色木槭生根无菌苗在打开瓶盖的环境下培养3-5d，然后移入适合该树种生长环境的轻基质容器中继续培育，轻基质是由土壤、河沙和有机肥以2∶1∶2的比例混合而成，并用0.4％的高锰酸钾消毒，培育10-15天后将苗木与基质一起移栽并密植到所适应的土壤中继续培育。

[0014] 本发明相对现有技术的有益效果为：

[0015] 1、本发明在试验过程中发现，按常规的操作灭菌后外植体被杀伤，不能得到诱导培养所需的有效外植体数。经反复试验，多次实验结果的比较，才得到本发明的具体实施方案，即流水冲洗-双氧水-升汞，不仅得到了理想的灭菌效果，还保证了诱导培养所需的外植体数。这一结果与发明所针对的特定对象色木槭所含成分有很大关系。本发明采用色木槭外植体灭菌方法是在理论研究的基础上，得到大量试验结果支持的有效灭菌方法。

[0016] 2、由于不同的植物，根系生长方式和长度不一样，扎根能力不一样，因此不同的基质层对植物的生根率有很大的影响。本发明将一次生根后的试管苗移入由土壤、河沙、有机肥构成的轻基质中继续培育，进行二次生根，大大提高了生根率，进一步提高了色木槭的成活率。二次生根与一次生根不同，由于一次生根后的穗条根系比较发达、粗壮，吸收能力高，所以本发明根据此特点，为色木槭的生根配制出营养成分较高的轻基质，同时用高锰酸钾对轻基质进行消毒，可避免其中的有害成分对苗木生长造成影响。

[0017] 3、采用腋芽途径组织培养的方法对色木槭进行繁殖，配合最佳的诱导、继代、生根培养基配方，能够有效的得到大量的色木槭无菌苗，解决色木槭资源短缺的问题；通过对外植体、诱导培养基、继代培养基及生根培养基的选取，能够使得增殖率达到70倍，驯化成活率达到98-100％，高效的得到色木槭种苗。

具体实施方式

[0018] 实施例一

[0019] 1、选取10株茁壮的色木槭一年生扦插苗。于2010年1月份休眠期放入温室培养。2010年9月1日，剪取当年生带腋芽茎段，去除叶片，保留1cm叶柄，以腋芽为外植体，每茎段带一腋芽，长约2cm。将外植体用清水冲洗干净，清洗后放入质量浓度为3％的H2O2中浸泡15～20分钟，取出立即转入含质量浓度为1～5％吐温-80的0.1％HgCI2溶液中浸泡10～20分钟，然后取出用无菌水冲洗5～6次并用灭菌吸水纸将水吸干。将消毒灭菌过的外植体两端分别切除0.5cm，以去除受伤部分。接入诱导培养基WPM+6-BA1.0mg/L+IBA0.01mg/L+PVP500mg/L+GA31.0mg/L PH6.0中。每瓶接3株，共接入30瓶。在温度25℃，光照时间10h/d，光强2000lx的条件下，进行培养。

[0020] 2、外植体接入培养基4d后，外植体开始有腋芽萌动。至20d时，萌发率达95％，共获得86株不带根的初代无菌苗。无菌苗株高约4cm，每株茎上带有已萌动的腋芽2至4个。将叶片去除，主干切为带芽茎段，每段带一个腋芽，共取170段。接入继代增殖培养基WPM+6-BA0.3mg/L+IBA0.05mg/L+PVP500mg/L PH6.0中，培养条件同上。培养10d后，腋芽开始陆续出梢，15d后枝条开始硬化，腋芽开始饱满，30d后，170个腋芽的萌发率达到98％，增殖率达到3.8倍，即每株继代苗上平均含有3.8个腋芽，共得到腋芽633个。

[0021] 3、将继代的无菌苗切成带2-3个腋芽的小段，接入生根壮苗培养基1/2MS+IBA3.0mg/LPH6.0，共接入600株，培养条件同上。培养15d后，开始生根，20d后生根率达100％，至此获得带根无菌苗600株。至此无菌苗增殖率达到60倍。

[0022] 4、将600株带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，然后移入适合该树种生长环境的轻基质容器中继续培育，轻基质是由土壤、河沙和有机肥以2∶1∶2的比例混合而成，并用0.4％的高锰酸钾消毒，培育10-15天后将苗木与基质一起移栽并密植到所适应的土壤中继续培育。幼苗成活率达到99％，获得种苗594株。

[0023] 实施例二

[0024] 1、选取20株茁壮的色木槭一年生扦插苗。于2010年1月份休眠期放入温室培养。2010年9月16日，剪取当年生带腋芽茎段，去除叶片，保留1cm叶柄，以腋芽为外植体，每茎段带一腋芽，长约2cm。将外植体用清水冲洗干净，清洗后放入质量浓度为3％的H2O2中浸泡15～20分钟，取出立即转入含质量浓度为1～5％吐温-80的0.1％HgCI2溶液中浸泡10～20分钟，然后取出用无菌水冲洗5～6次并用灭菌吸水纸将水吸干。将消毒灭菌过的外植体两端分别切除0.5cm，以去除受伤部分。接入诱导培养基WPM+6-BA1.0mg/L+IBA0.01mg/L+PVP500mg/L+GA31.0mg/L PH6.0中。每瓶接3株，共接入60瓶。在温度24℃，光照时间16h/d，光强20001x的条件下，进行培养。

[0025] 2、外植体接入培养基6d后，外植体开始有腋芽萌动。至20d时，萌发率达97％，共获得175株不带根的初代无菌苗。无菌苗株高约4cm，每株茎上带有已萌动的腋芽2至4个。将叶片去除，主干切为带腋芽茎段，每段带一个腋芽，共取400段。接入继代增殖培养基WPM+6-BA0.3mg/L+IBA0.05mg/L+PVP500mg/L PH6.0中，培养条件同上。培养10d后，腋芽开始陆续出梢，15d后枝条开始硬化，腋芽开始饱满，30d后，400个腋芽的萌发率达到99％，